李風(fēng)梅 張龔敏 吳林蔚 廣東省藥品監(jiān)督管理局審評(píng)認(rèn)證中心 （廣東 廣州 510080）

內(nèi)容提要： 根據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》及《免于進(jìn)行臨床試驗(yàn)的體外診斷試劑臨床評(píng)價(jià)資料基本要求（試行）》等的要求，對(duì)藥敏檢測(cè)試劑盒的性能指標(biāo)、臨床評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行研究分析。

隨著醫(yī)學(xué)的日益發(fā)展進(jìn)步，疾病治療中如何合理使用抗生素，進(jìn)而達(dá)到有效減少或避免耐藥菌株的產(chǎn)生，已成為現(xiàn)今衛(wèi)生領(lǐng)域的一大重要任務(wù)。故而臨床上在控制患者感染時(shí)，實(shí)驗(yàn)室診斷中抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的結(jié)果至關(guān)重要。藥敏檢測(cè)不但可以直接指導(dǎo)患者用藥，預(yù)測(cè)抗菌藥物治療效果的好壞，亦可評(píng)估耐藥菌感染的一些流行病學(xué)特征，從而為控制及預(yù)防耐藥菌的流行擴(kuò)散提供應(yīng)對(duì)措施[1]。

目前臨床診斷實(shí)驗(yàn)室多采用自動(dòng)化藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏檢測(cè)，相比傳統(tǒng)的手工法，自動(dòng)化操作的重現(xiàn)性、檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性都得到了大幅提升。進(jìn)而，市場(chǎng)上大量自動(dòng)化藥敏分析系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。

一般而言，藥敏控制系統(tǒng)包括藥敏檢測(cè)試劑盒及其配套的微生物鑒定藥敏分析儀器兩部分。本文結(jié)合注冊(cè)技術(shù)審評(píng)的要求，對(duì)自動(dòng)化藥敏分析系統(tǒng)中藥敏檢測(cè)試劑盒的安全有效性進(jìn)行研究[2]。

1.性能要求

藥敏分析系統(tǒng)中藥敏試劑盒部分應(yīng)結(jié)合常規(guī)注冊(cè)中體外診斷試劑的性能要求進(jìn)行考慮。藥敏試劑盒介于定性檢測(cè)試劑與定量檢測(cè)試劑之間，沒有完全清晰的界定，使用時(shí)先接種培養(yǎng)出鑒定細(xì)菌，最終確定出鑒定細(xì)菌的最低殺菌濃度。

在確定最低殺菌濃度之前，應(yīng)先保證使用產(chǎn)品如下的一些基本性能要求：

1.1 無菌要求

培養(yǎng)鑒定菌株的前體時(shí)，培養(yǎng)基應(yīng)保持無菌環(huán)境，無其他雜菌的干擾。驗(yàn)證該性能要求時(shí)，可抽取5%的培養(yǎng)基進(jìn)行無菌試驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)果應(yīng)無細(xì)菌生長(zhǎng)。若抽檢的5%培養(yǎng)基中出現(xiàn)污染，則全部培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行無菌試驗(yàn)，出現(xiàn)污染的培養(yǎng)基棄去不用。

1.2 pH要求

細(xì)菌對(duì)pH的敏感性也是影響其生長(zhǎng)的重要因素，偏酸性或偏堿性的生存環(huán)境都可能出現(xiàn)抑菌的現(xiàn)象，從而造成結(jié)果判斷的假陰性出現(xiàn)。故臨床上，無菌培養(yǎng)基的pH一般要求7.2左右，或結(jié)合產(chǎn)品定位菌種的實(shí)際生長(zhǎng)特點(diǎn)進(jìn)行考慮，如結(jié)核桿菌、鏈球菌等菌種pH要求存在不同程度的差異。

1.3 生長(zhǎng)試驗(yàn)

所謂生長(zhǎng)試驗(yàn)，即前述無菌、pH兩個(gè)基本性能滿足要求后，應(yīng)采用對(duì)照菌株（或質(zhì)控菌株）進(jìn)行培養(yǎng)，確定該培養(yǎng)基可長(zhǎng)出培養(yǎng)菌。排除培養(yǎng)基因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)不足或其他原因造成無菌生長(zhǎng)的假陰性出現(xiàn)。不同的鑒定菌種其藥敏對(duì)照菌種存在差異，如結(jié)核桿菌的質(zhì)控菌種可采用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)敏感株H37Ra（Mycobacterium tuberculosis H37Ra）ATCC 25177，[CMCC（B）93020]無毒菌株。

1.4 最低殺菌濃度

明確培養(yǎng)基可以培養(yǎng)出正常對(duì)照菌株（或質(zhì)控菌株）后，可對(duì)鑒定菌種進(jìn)行下一步的最小殺菌濃度探索。衛(wèi)健委每年發(fā)布一系列針對(duì)不同菌種藥物敏感性濃度的相關(guān)指南性文件?？紤]到臨床實(shí)際情況中，不同地區(qū)、不同人群、不同實(shí)驗(yàn)室中病原微生物的分布及生長(zhǎng)、耐藥等流行病學(xué)存在差異。具體應(yīng)用過程中，參考該指南性文件內(nèi)容的同時(shí)，應(yīng)結(jié)合實(shí)際環(huán)境特點(diǎn)，對(duì)不同鑒定菌種的抗菌敏感濃度進(jìn)行研究。驗(yàn)證該性能要求時(shí)，應(yīng)針對(duì)不同的細(xì)菌分開進(jìn)行研究。每個(gè)細(xì)菌再分不同的抗菌藥物及不同抗菌藥物的不同濃度，依次梯度逐步遞增進(jìn)行培養(yǎng)，從而最終與對(duì)照菌種進(jìn)行對(duì)比，選出抑菌或者殺菌的最低藥物濃度。如結(jié)核桿菌大多選異煙肼、鏈霉素、利福平、卡那霉素等多種抗菌藥物進(jìn)行研究，其中異煙肼抗菌濃度結(jié)合衛(wèi)生部藥敏指南濃度進(jìn)行擴(kuò)展探索。

2.生產(chǎn)過程控制

藥敏試劑盒生產(chǎn)工藝基本以基礎(chǔ)液的分裝配置、過濾除菌為主，最終培養(yǎng)基無菌則是關(guān)鍵所在。故生產(chǎn)控制中涉及到的無菌室、微生物室、陽(yáng)性對(duì)照室的空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)能夠有效避免交叉污染[3]。檢測(cè)用到的質(zhì)控菌株應(yīng)可溯源并記錄其詳細(xì)來源，如菌株的批號(hào)、效期、溯源途徑、主要技術(shù)指標(biāo)、保存狀態(tài)等信息。藥敏試劑盒作為微生物檢測(cè)試劑盒中的一種，除生產(chǎn)設(shè)備要有要求之外，其工作人員亦應(yīng)該具備一定的衛(wèi)生及微生物專業(yè)知識(shí)，應(yīng)對(duì)其菌種的操作，包括菌種復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)增菌以及使用過程中的潔凈操作、防護(hù)等工作熟悉掌握，從而以確保生產(chǎn)人員的安全及產(chǎn)品的有效。

3.臨床驗(yàn)證[4-6]

新版的免臨床目錄已發(fā)布，免臨床的體外診斷試劑已增加至將近400個(gè)品種。用于淋病奈瑟菌紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)及用于真菌的紙片擴(kuò)散法藥物敏感實(shí)驗(yàn)的藥敏試紙屬于免臨床的范疇，具體評(píng)價(jià)方法應(yīng)參照《免于進(jìn)行臨床試驗(yàn)的體外診斷試劑臨床評(píng)價(jià)資料基本要求（試行）》的要求進(jìn)行臨床評(píng)價(jià)。

非免臨床的藥敏檢測(cè)試劑應(yīng)按照《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求開展臨床試驗(yàn)。這里以結(jié)核桿菌為例，進(jìn)行簡(jiǎn)單闡述。藥敏檢測(cè)試劑盒進(jìn)行注冊(cè)檢驗(yàn)合格之后，應(yīng)選擇兩家國(guó)家局備案的醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床研究。通過各臨床單位倫理委員會(huì)審批，并向當(dāng)?shù)乇O(jiān)管部門進(jìn)行臨床備案之后，則可開展臨床樣本的收集。藥敏檢測(cè)試劑相對(duì)特殊，不同的抗菌藥物臨床試驗(yàn)應(yīng)單獨(dú)分別達(dá)到法規(guī)的要求。如結(jié)核桿菌要驗(yàn)證異煙肼、鏈霉素、利福平三種抗生素的敏感性時(shí)，首先選取前期研發(fā)研究的濃度生產(chǎn)相應(yīng)

的培養(yǎng)基，如0.2μg/mL異煙肼培養(yǎng)基、4μg/mL鏈霉素培養(yǎng)基、40μg/mL利福平培養(yǎng)基。試驗(yàn)過程中，這三種抗菌藥物異煙肼、鏈霉素、利福平在兩家臨床單位各自開展不少于200例的樣本研究。每種陽(yáng)性率不低于30%，即60例的要求。若每種抗菌藥物涉及不同濃度，則每種濃度應(yīng)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)要求進(jìn)行研究。與合適的對(duì)比產(chǎn)品同步進(jìn)行試驗(yàn)后，最終應(yīng)將試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，形成統(tǒng)計(jì)報(bào)告。若簡(jiǎn)單的定性，則每種抗菌藥物應(yīng)與對(duì)比產(chǎn)品試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行陰陽(yáng)性、總符合率及一致性的統(tǒng)計(jì)分析。若涉及到不同的抗菌濃度，統(tǒng)計(jì)過程則應(yīng)考慮不同抗菌濃度的分布及結(jié)果，選擇合理的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

4.結(jié)語(yǔ)

目前，體外診斷試劑管理的法規(guī)相對(duì)全面完善。在眾多指南文件中，生化、免疫類產(chǎn)品已發(fā)布的國(guó)、行標(biāo)及指導(dǎo)原則相對(duì)較多；而微生物檢測(cè)方面的試劑一直尚未有相關(guān)的、比較系統(tǒng)的指導(dǎo)性文件發(fā)布。

本文結(jié)合現(xiàn)行法規(guī)要求及藥敏檢測(cè)試劑盒的實(shí)際特點(diǎn)，對(duì)涉及藥敏檢測(cè)試劑盒安全有效性的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要分析?？蔀榧夹g(shù)審評(píng)部門審評(píng)該類產(chǎn)品的注冊(cè)申報(bào)資料提供參考，同時(shí)也間接指導(dǎo)相關(guān)企業(yè)產(chǎn)品注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫。