王安良 唐璜 吳杰 鄭洋 鄭小玲

摘 ? 要 ? 以涪陵榨菜原料青菜頭為研究對象，取其葉、瘤狀莖及瘤狀莖的皮部和芯部，用高效液相色譜法測定青菜頭的黑芥子苷（2-丙烯基芥子苷）含量。用外標法計算，測得青菜頭各部位的黑芥子苷含量為：葉2.78 g·kg-1 DW;瘤莖4.84 g·kg-1 DW;瘤莖表皮7.39 g·kg-1 DW;瘤莖里芯4.05 g·kg-1 DW。研究結果表明，青菜頭各部位的黑芥子苷含量：瘤莖表皮>瘤莖>瘤莖里芯>葉。

關鍵詞 ? 青菜頭;黑芥子苷;高效液相色譜法

中圖分類號：S637 ? ?文獻標志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.34.006

享譽海外的涪陵榨菜是重慶的一張?zhí)厣?，傳統(tǒng)涪陵榨菜采用風脫水工藝[1]，屬于中國非物質文化遺產[2]。涪陵榨菜是以莖瘤芥的瘤芥（青菜頭）為原料經整理、脫水、3次腌制而成的鹽腌菜，是一種半干態(tài)的具有輕微乳酸發(fā)酵的腌制品[3-4]。莖瘤芥屬十字花科[5]，含有豐富的芥子苷[6]，芥子苷是一類具有抗癌防癌功能的物質[7]。

芥子苷又稱硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷）[8]，在十字花科蔬菜中屬于重要的次生代謝產物[9]，目前十字花科中發(fā)現芥子苷有20多種[10]，其結構如圖1所示[11]。芥子苷通常由硫化肟基團、β-D-硫葡萄糖基和來源于氨基酸的側鏈構成。芥子苷有3個類群，分別是吲哚族芥子苷、脂肪族芥子苷和芳香族芥子苷[12-13]。近年來，由于在抗癌、防癌方面的特殊功效，芥子苷研究成為流行病學、食品科學、農業(yè)等多個領域的研究熱點[14]。國際癌癥基金會指出，每天食用10 g左右富含芥子苷的蔬菜即可有效地預防癌癥的發(fā)生。除了具有抗癌功效外，芥子油苷水解產物對于植物抵抗細菌、真菌、病毒和蚜蟲等都有重要作用。我國常見的十字花科蔬菜種類包括白菜類、甘藍類、芥菜類和蘿卜類四大類。存在于芥菜類蔬菜中的芥子油苷有9種。黑芥子苷，又稱黑芥子硫苷酸鉀，也就是2-丙烯基芥子苷，為主要的芥子油苷種類，屬于脂肪族芥子苷，它的R側鏈上連接的是一個2-丙烯基，其結構如圖2所示[15]。黑芥子苷是中藥芥子的有效成分之一，有抗炎[16]、 通利內臟、溫和開胃、發(fā)汗散寒、化痰利氣、增進食欲、促進消化等功效[17]。

青菜頭為涪陵榨菜原料，屬于涪陵的特色產品，是十分重要的地方特殊經濟作物，對拉動當地經濟、帶領農戶脫貧增收有著重要的作用。當前國內外對于芥子油苷的研究，主要集中于蘿卜、甘藍、花椰菜、芥菜、瑪咖等農產品，而針對青菜頭中芥子油苷還鮮有研究。本文以青菜頭為研究對象，采用高效液相色譜法測定青菜頭的黑芥子苷含量，并比較黑芥子苷含量在各器官間的差異，以期填補針對涪陵榨菜相關產品中芥子油苷的檢測方法空白，促進涪陵榨菜特色產業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇，色譜純，TEDLA公司;氯化鉀，分析純，上海化學試劑公司;乙酸鉛，分析純，上?；瘜W試劑公司;超純水，由MERCK MilliPORE制得;黑芥子苷標品，CAS號3952-98-5，純度≥98%，上海源葉生物有限公司;青菜頭，采自重慶市涪陵區(qū)致韓鎮(zhèn)菜地。

安捷倫1290高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）、色譜柱：Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），Agilent Technologies;H23474組織破碎機，北京恒奧德儀器儀表有限公司;ALpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機，CHRIST;Direct-Q3超純水一體機，MERCK MilliPORE;SCQ-8201A超聲波清洗機，上海聲彥超聲波儀器有限公司;Z323k冷凍離心機，HERMLE;N-EVAPTM112氮吹儀，南京銘奧儀器設備有限公司;DEG-200氮氣發(fā)生器，淄博宏潤工貿有限公司;XW-80A渦旋震蕩器，上海青浦滬西儀器廠;LE324S電子分析天平，SARTORIUS。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備

葉部取鮮樣切碎，混合均勻后縮分至150 g。瘤莖部分分2種取樣：瘤狀莖整個切成薄片，然后混合均勻，四分法縮分至150 g;瘤狀莖表皮取鮮樣，混合均勻后縮分至150 g，瘤狀莖中心肉質部分取鮮樣，混合均勻后縮分至150 g。制備后的樣品冷凍保存在-20 ℃冰箱里，然后進行冷凍干燥，粉碎，用真空袋裝好，抽真空，在-20 ℃冰箱里保存。

1.2.2 樣品前處理

取樣品凍干粉0.10 g于15 mL離心管中，加入1.5 mL 70%甲醇溶液，在70 ℃水浴鍋中超聲提取10 min，冷卻至室溫后，加入0.5 mL澄清10 g/100 mL乙酸鉛溶液，除去部分蛋白質。渦旋1 min，混勻，在4 000 r·min-1離心機中離心5 min。保存上清液，沉淀再用70%甲醇按上述方法提取2次，合并3次提取液。將提取液在40 ℃水浴下用氮吹儀濃縮至0.1 mL。再用超純水定容至2 mL，渦旋1 min后，用0.22 nm水系濾膜過濾，供UPLC檢測。每個樣品再做2次平行。

1.2.3 色譜檢測條件

色譜柱：Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：氯化鉀溶液（0.005 mol·L-1）與甲醇的體積比為91∶9。柱溫：30 ℃。檢測器：二極管陣列檢測器。波長：230 nm。流速：1.0 mL·min-1。進樣量：20 μL。

1.2.4 標準曲線的繪制

準確稱取0.007 0 g黑芥子苷標準品，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即為700 μg·mL-1黑芥子苷標準儲備液。準確稱取0.001 0 g黑芥子苷標準品，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即為100 μg·mL-1黑芥子苷標準儲備液。所配制的標準儲備液置于冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

黑芥子苷標準儲備液用水分別稀釋成濃度為25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、350 μg·mL-1、700 μg·mL-1系列標液，高效液相色譜儀測定，以保留時間定性，峰面積定量，繪制標準工作曲線。

1.2.5 樣品測定

按“1.2.3 色譜檢測條件”，待基線平穩(wěn)后再進樣，以目標物譜峰的保留時間定性，外標法定量計算樣品中黑芥子苷含量。計算公式如下：

X=（C×V）/（M×1000） ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1）

式（1）中的X為樣品中黑芥子苷含量，單位為g·kg-1;C為待測樣中黑芥子苷濃度，單位為μg·mL-1;V為樣液最后定容總體積，單位為mL;M為樣品質量，單位為g。

2 結果與分析

2.1 檢測方法的建立

在選定的色譜條件下，分別對一系列濃度的黑芥子苷標液進行測定，以黑芥子苷標樣的峰面積為縱坐標（Y），進樣濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X）做標準曲線，如圖3所示。

得到的線性回歸方程為y=21.764X-162.08，結果表明，在25～700 μg·mL-1范圍內線性關系良好，相關系數為0.999 7。檢出限以3倍噪聲計為0.01 g·kg-1。方法的準確度和精密度可通過添加回收率實驗來考察。按上述實驗方法，對黑芥子苷加標樣品進行了含量測定并計算回收率和相對標準偏差。結果發(fā)現，本方法平均回收率在95%～104.2%，相對標準偏差在1.6%～3.4%。實驗結果表明，本方法的準確度和精密度較好。采用此方法檢測青菜頭中黑芥子苷的含量，準確可靠，能夠滿足測定要求。

2.2 實際樣品的測定及器官間差異

本文采用所建立的檢測方法分別測定8個青菜頭的葉、瘤莖、瘤莖表皮、瘤莖里芯等部位的黑芥子苷含量。

從表1和圖4可以看出，青菜頭瘤莖表皮的黑芥子苷含量最高，有7.39 g·kg-1DW;其次是瘤莖，有4.84 g·kg-1 DW;然后是瘤莖里芯，有4.05 g·kg-1 DW;最少的是葉，僅有2.78 g·kg-1 DW。

由表1再看這4個部位的含量范圍與極差，葉的測定值極差最大，達到了5.56 g·kg-1;其次是莖，相差4.39 g·kg-1，說明葉和莖的測定結果變動較大。對比4個部位的方差和標準差，葉的方差達到4.60 g2/kg2之多，標準差為2.15 g·kg-1，其次是莖的方差2.25 g2/kg2、標準差1.50 g·kg-1，表皮的方差1.75 g2/kg2、標準差1.32 g·kg-1，里芯的方差和標準差最低為0.88 g2/kg2和0.94 g·kg-1，說明本實驗中葉的測定數據離散程度較大，莖、皮、芯的測定數據的離散程度較小，數據較集中。葉黑芥子苷含量的變異系數是77.12%，莖黑芥子苷含量的變異系數是30.99%，瘤莖表皮黑芥子苷含量的變異系數是17.89%，瘤莖里芯黑芥子苷含量的變異系數是23.19%，可見葉黑芥子苷含量的相對變異程度大，瘤莖表皮黑芥子苷含量的相對變異程度小。最后從標準誤差分析這4個部位的差異，葉（0.76）>莖（0.53）>皮（0.47）>芯（0.33），表明本實驗所測樣品的瘤莖里芯黑芥子苷含量與總體瘤莖里芯的黑芥子苷含量值較接近，對總體的瘤莖里芯有代表性，以本實驗瘤莖里芯的樣本來推斷總的瘤莖里芯的黑芥子苷含量可靠度很大;本實驗的莖和瘤葉莖表皮的黑芥子苷含量也能較好地代表總體莖和瘤莖表皮的含量;而本實驗中葉的黑芥子苷含量只能一定程度地代表總體莖瘤芥葉的含量。從這4個部位的相對標準偏差來看，本實驗測得的青菜頭的皮、芯和瘤莖的黑芥子苷含量的精密度較高，而葉的測定結果的精密度則較低。

3 小結

本文研究了青菜頭中黑芥子苷含量的檢測方法，并進一步試驗分析了黑芥子苷含量在青菜頭不同器官間的差異。實驗結果表明，黑芥子苷在25～700 μg·mL-1質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r=0.999 7），檢出限為0.01 g·kg-1，黑芥子苷的添加回收率為95.0%～104.2%，相對標準偏差為1.6%～3.4%。說明本文所建方法準確度和精密度符合青菜頭中黑芥子苷含量的測定要求，且方法前處理快捷簡便，適合處理大批量樣品。并進一步分析了黑芥子苷含量在青菜頭不同器官間的差異。發(fā)現青菜頭各部位的黑芥子苷含量：瘤莖表皮>瘤莖>瘤莖里芯>葉。其中，葉的測定數據離散程度較大，莖、皮、芯的測定數據的離散程度較小，數據較集中。

參考文獻：

[1] 方明強，賀云川，周斌全，等.曬制風脫水榨菜工藝研究[J].食品與發(fā)酵科技，2016，52（2）：14-21.

[2] 薛元鵬，陳俊杰，葉進，等.青菜頭物理力學特性研究[J].西南大學學報（自然科學版），2017，39（2）：147-152.

[3] 李敏，賀云川.方便榨菜揮發(fā)性成分分析[J].食品科學，2011，32（8）：272-274.

[4] 劉明春.榨菜加工過程中揮發(fā)性風味物質的形成及變化研究[D].重慶：重慶大學，2009.

[5] 陳竹君，張明方，汪炳良，等.榨菜胞質雄性不育及其農藝性狀的研究[J].園藝學報，1995，22（1）：40-46.

[6] Rosa EAS， Heaney RK， Fenwick GR， et al. Glucosinolates in Crop Plants[M]. Horticultural Reviews， Volume 19. John Wiley & Sons， Inc. 1997： 99-215.

[7] 汪俏梅，曹家樹.芥子油苷研究進展及其在蔬菜育種上的應用前景[J].園藝學報，2001（S1）： 669-675.

[8] Reichelt M， Brown PD， Schneider B， et al. Benzoic acid glucosinolate esters and other glucosinolates from Arabidopsis thaliana[J]. Phytochemistry， 2002， 59（6）： 663-671.

[9] 張麗，何洪巨，陳靜華，等.不同蘿卜品種中硫代葡萄糖苷組分及含量分析[J].中國蔬菜，2010（18）：43-46.

[10] 臘貴曉，方萍，馬劍，等.高效液相色譜-外標法定量芥藍中芥子油苷[J].食品科技，2009，34（8）：267-271.

[11] Grubb CD， Abel S. Glucosinolate metabolism and its control[J]. Trends in Plant Science， 2006， 11（2）： 89-100.

[12] Fahey JW， Zalcmann AT， Talalay P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants[J]. Phytochemistry， 2001， 32（10）： 5-51.

[13] Halkier BA， Gershenzon J. Biology and biochemistry of glucosinolates[J]. Annual Review of Plant Biology， 2006， 57（1）： 303-333.

[14] 程坤，楊麗梅，方智遠，等.十字花科植物中主要硫代葡萄糖苷合成與調節(jié)基因的研究進展[J].中國蔬菜，2010（12）：1-6.

[15] Tian Q， Rosselot RA， Schwartz SJ. Quantitative determination of intact glucosinolates in broccoli， broccoli sprouts， Brussels sprouts， and cauliflower by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J]. Analytical Biochemistry， 2005， 343（1）： 93-99.

[16] 臘貴曉，孔海民，方萍，等.芥藍芥子油苷提取條件優(yōu)化研究[J].中國農業(yè)科技導報，2014，16（3）：150-155.

[17] Lin CM， Wei CI. Antibacterial mechanism of allyl isothiocyanate[J]. Journal of Food Protection， 2000， 63（6）： 727-734.

（責任編輯：敬廷桃）