胡明瑜 白文欽 潘曉雪 吳紅 雷開榮

摘 ? 要 ? 啟動子在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，分析啟動子表達特性對于基因功能研究和啟動子的開發(fā)利用有重要意義。本研究克隆了水稻組蛋白基因OsHistone3的啟動子pOsHistone3，在PlantCARE中分析顯示包含脫落酸、茉莉酸甲酯等生長調(diào)節(jié)劑信號應(yīng)答元件和胚乳、莖尖、分生組織等部位特異表達元件。進一步構(gòu)建啟動子分析載體并對煙草作遺傳轉(zhuǎn)化，GUS染色分析顯示，pOsHistone3在轉(zhuǎn)基因煙草幼嫩組織如莖尖、嫩葉中GUS活性較高，而在成熟組織中僅在維管組織周圍檢測到GUS活性，說明pOsHistone3具有組織表達特異性。這些結(jié)果初步表明OsHistone3基因作為表觀遺傳調(diào)控的一個重要基因，可能在轉(zhuǎn)錄水平參與了植物生長調(diào)節(jié)劑信號和植株發(fā)育調(diào)控的過程。

關(guān)鍵詞 ? 水稻;煙草;組蛋白;OsHistone3;植物生長調(diào)節(jié)劑;表達特性

中圖分類號：S572;Q78 ? ?文獻標志碼：A ? ?DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.34.003

表觀遺傳調(diào)控在植物生長發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境的過程中發(fā)揮重要作用[1]。組蛋白修飾如組蛋白乙?；?、甲基化和泛素化等是表觀遺傳調(diào)控的方式之一。已有研究表明，組蛋白Histone3具有多種修飾酶和修飾位點，如甲基化酶ATX1、SDG8、SDG25和H3K4、H3K9、H3K27等，憑借對Histone3的不同修飾參與調(diào)控植物生長發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)[2]。在擬南芥中，ATX1激活WRKY70基因表達拮抗水楊酸和茉莉酸甲酯信號，PR1、THI2.1等水楊酸或茉莉酸甲酯信號應(yīng)答基因的核小體也是ATX1蛋白的作用靶點[3]。SDG8能通過調(diào)控茉莉酸甲酯和乙烯信號相關(guān)基因，來防御蕓薹生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）和灰葡萄孢菌石竹變種（Botrytis cinerea）等病原菌侵染[4]。

雖然Histone3是植物進行表觀遺傳調(diào)控的重要靶蛋白，在植物生長發(fā)育調(diào)控和適應(yīng)環(huán)境等方面具有重要作用，但對Histone3基因自身的表達特性還研究較少。為此，我們克隆了水稻OsHistone3基因（LOC_Os11g05730）的啟動子pOsHistone3，分析顯示其含有多個植物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)答元件和組織特異表達元件。在轉(zhuǎn)基因煙草中的分析表明，pOsHistone3在幼嫩組織中高表達，而在成熟組織中僅在維管組織周圍表達，說明水稻OsHistone3基因可能參與了植物幼嫩組織到成熟組織發(fā)育過程的調(diào)控。這些結(jié)果為進一步探索Histone3基因在調(diào)控植物生長發(fā)育和生長調(diào)節(jié)劑信號反應(yīng)中的功能提供了參考。

1 材料與方法

1.1 ? 實驗材料

水稻“秀水03”（Oryza sativa L. “Xiushui 03”）和煙草（Nicotiana tabacum L.），是逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市重點實驗室保存的試驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1 水稻和煙草基因組DNA提取

參照Luo等[5]的方法，取水稻或煙草嫩葉，用CTAB法提取基因組DNA。

1.2.2 啟動子的克隆

根據(jù)LOC_Os11g05730的上游調(diào)控序列設(shè)計引物（上游引物：5- ATTGAGGAATGTGATTTAATC-3，下游引物：5- CGCGGAGGAGGGAGGAGGAGG-3），以“秀水03”基因組DNA為模板，擴增LOC_Os11g05730的啟動子片段。PCR反應(yīng)體系為：1×PCR Buffer、2.5 mmol·L-1 MgCl2、0.15 mmol·L-1 dNTPs、0.25 μmol·L-1引物、1U DNA聚合酶和約50 ng模板DNA。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，1個循環(huán);94 ℃變性30 s，56 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，共32個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，切取特異性強的DNA條帶，回收后，作TA克隆測序。

1.2.3 植物表達載體構(gòu)建

測序鑒定的pOsHistone3啟動子片段，用Hind III和Xba I雙酶切，連入用相同酶切的pBI121載體，重組質(zhì)粒即為啟動子分析植物表達載體。

1.2.4 煙草遺傳轉(zhuǎn)化

采用葉盤轉(zhuǎn)化法對煙草進行遺傳轉(zhuǎn)化。無菌苗葉片切成約0.5 cm×0.5 cm大小，用農(nóng)桿菌菌液侵染10 min，外植體移入共培養(yǎng)基，24 ℃暗培養(yǎng)2～3 d;共培養(yǎng)后，外植體接入篩選培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化，每2～3周繼代1次;出現(xiàn)不定芽后，切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。抗卡那霉素的陽性植株，提取DNA，用克隆pOsHistone3啟動子的引物進行PCR鑒定。

1.2.5 煙草GUS染色分析

萌發(fā)約10 d的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗，浸入GUS染液，37 ℃孵育4 h，用75%乙醇脫色。四葉期幼苗和10～15片完全葉的煙草植株，用解剖刀徒手切取植物組織器官，浸入GUS染液，37 ℃孵育4 h，用75%乙醇脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsHistone3基因啟動子的克隆和調(diào)控元件分析

在國家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/index.htm）查找OsHistone3基因（LOC_Os11g05730）的上游調(diào)控序列，設(shè)計特異性引物，從“秀水03”基因組中擴增得到約1 000 bp的DNA片段。測序結(jié)果表明，克隆的DNA片段長度為963 bp，與數(shù)據(jù)庫中登錄的序列完全相同，命名為pOsHistone3。

為了解pOsHistone3中的調(diào)控元件，在PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）對順式調(diào)控元件作了分析（見表1）。結(jié)果表明，pOsHistone3中不僅有脫落酸、茉莉酸甲酯等植物生長調(diào)節(jié)劑的信號調(diào)控元件，還有胚乳、莖尖、分生組織等部位特異表達元件;同時，還有大量環(huán)境信號應(yīng)答元件，包括光反應(yīng)、低溫、干旱、缺氧反應(yīng)和誘導(dǎo)子應(yīng)答元件等。這些結(jié)果表明水稻OsHistone3同源基因的表達可能受到多種因素的調(diào)控。

2.2 pOsHistone3：：GUS煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

構(gòu)建pOsHistone3控制GUS基因表達的植物表達載體，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404。采用葉盤轉(zhuǎn)化法對煙草作遺傳轉(zhuǎn)化，通過GUS組織化學(xué)染色，分析pOsHistone3在煙草中的表達特性。通過遺傳轉(zhuǎn)化，獲得12株煙草再生植株，經(jīng)鑒定獲得8株轉(zhuǎn)基因陽性植株（見圖1）。

2.3 pOsHistone3在煙草中的表達特性分析

GUS染色結(jié)果表明，pOsHistone3在子葉和幼根中高表達（見圖2A），在下胚軸中表達相對較低。在四葉期幼苗中，GUS在頂芽高表達（見圖2B）。當植株生長出10～15片完全葉時，分別取幼嫩和成熟的莖葉作GUS染色，發(fā)現(xiàn)幼嫩葉、葉柄和莖中GUS活性相對較高（見圖2CDG），在成熟莖的維管組織周圍能檢測到GUS活性（見圖2I），而在成熟葉片和葉柄中不能檢測到GUS活性（見圖2HJ）。分別取成熟和幼嫩部位的腋芽作GUS染色，發(fā)現(xiàn)幼嫩部位的腋芽GUS活性較高（見圖2E），而成熟部位的腋芽僅在維管組織周圍檢測到GUS活性（見圖2F）。這些結(jié)果表明，pOsHistone3在煙草中具有組織表達特異性，在幼嫩組織中表達水平相對較高，在成熟組織中表達量較低甚至不表達。

3 小結(jié)

組蛋白Histone3是表觀遺傳調(diào)控的一個重要靶蛋白，通過對不同位點的修飾，來激發(fā)或抑制特定基因或功能元件的活性。如在水稻中，JMJ703是H3K4位點特異性去甲基酶，能特異地降低H3K4的甲基化水平，調(diào)控轉(zhuǎn)座子的活性[6]。Histone3除了通過在蛋白質(zhì)不同位點修飾的方式來參與表觀遺傳調(diào)控外，也有可能在基因表達水平參與植物生長發(fā)育調(diào)控，但這方面報道相對較少。

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)水稻有多個OsHistone3同源基因，這些基因編碼的蛋白質(zhì)雖然高度保守，但在可修飾區(qū)段存在氨基酸位點差異（數(shù)據(jù)未發(fā)表），這些位點差異是否會影響OsHistone3蛋白的表觀遺傳調(diào)控尚未可知。本研究克隆了其中一個水稻OsHistone3同源基因的啟動子，試圖通過對該啟動子調(diào)控元件和表達特性的分析，了解水稻不同的OsHistone3基因是否在表達水平參與植物生長發(fā)育的調(diào)控。

研究結(jié)果顯示，克隆的pOsHistone3啟動子包含植物生長調(diào)節(jié)劑信號調(diào)控元件和大量的環(huán)境信號響應(yīng)元件，說明OsHistone3基因可能在轉(zhuǎn)錄水平受到多種信號途徑的調(diào)控。進一步在煙草中分析pOsHistone3啟動子的表達特性，發(fā)現(xiàn)該啟動子主要在幼嫩組織中表達，在成熟組織中表達量很低甚至不表達。這些結(jié)果初步說明，組蛋白OsHistone3可能不僅在蛋白質(zhì)修飾水平上參與表觀遺傳調(diào)控，而且在轉(zhuǎn)錄水平上對植物的生長發(fā)育可能也有重要的調(diào)控作用，這對于進一步揭示組蛋白Histone3的生物學(xué)功能有一定的參考價值。

參考文獻：

[1] Juan S R， Aala A A， Naganand R， et al. Plant immunity： from signaling to epigenetic control of defense [J]. Trends in Plant Science， Published online： July 02， 2018.

[2] Zhou C， Zhao Y， Zhou S L， et al. Progresses and perspectives of crop epigenome research （in Chinese） [J]. Chinese Bulletin of Life Sciences （生命科學(xué)） ， 2016， 28（10）：1138-1145.

[3] Alvarez-Venegas R and Avramova Z. Methylation patterns of histone H3 Lys 4， Lys 9 and Lys 27 in transcriptionally active and inactive Arabidopsis genes and in atx1 mutants [J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33（16）： 5199-5207.

[4] Alexandre B， Emily J M， Abdelmalek A， et al. Arabidopsis histone methyltransferase SET DOMAIN GROUP8 mediates induction of the jasmonate/ethylene pathway genes in plant defense response to necrotrophic fungi [J]. Plant physiology， 2010， 154（3）： 1403-1414.

[5] Luo M， Xiao Y H， Hou L， et al. Cloning and expression analysis of a LIM1 domain protein gene from cotton （Gossypium hirsuturm L.） （in Chinese） [J]. Acta Genetica Sinica （遺傳學(xué)報）， 2003， 30（2）：175-182.

[6] Xiekui Cui， Ping Jin， Xia Cui， et al. Control of transposon activity by a histone H3K4 demethylase in rice [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2013， 110（5）： 1953-1958.

（責(zé)任編輯：丁志祥）