黃紅麗 何文鳳 姜艷華 劉曉瑛 楊小猛

【摘要】 目的：研究染色體微陣列技術(shù)（CMA）應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因診斷中的價(jià)值。方法：抽選2017年7月-2019年6月本院收治的自然流產(chǎn)患者60例進(jìn)行研究，所有患者均流產(chǎn)2次以上，收集患者的胚胎相關(guān)組織進(jìn)行CMA檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果，研究CMA應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷中的價(jià)值。結(jié)果：所有患者中，染色體數(shù)目異常40例（66.67%），染色體結(jié)構(gòu)異常3例（5.00%），單親二倍體1例（1.67%）;所有患者中，發(fā)生流產(chǎn)最多孕周為8周前，檢出異?；颊咦疃嗟囊矠樵摃r(shí)期（82.5%），產(chǎn)婦年齡超過(guò)35歲，染色體數(shù)目異常的發(fā)生率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：使用CMA技術(shù)對(duì)產(chǎn)婦的胚胎相關(guān)組織進(jìn)行染色體檢查，可以發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素，檢測(cè)方法比較簡(jiǎn)便高效，對(duì)產(chǎn)婦復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷、生育風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及生育指導(dǎo)功能具有較大的價(jià)值，可以在臨床工作中規(guī)范應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)發(fā)性流產(chǎn) 染色體微陣列分析 染色體異常 遺傳

[Abstract] Objective： To study the value of chromosome microarray technique （CMA） in the diagnosis of recurrent abortion. Method： A total of 60 cases of spontaneous abortion in our hospital from July 2017 to June 2019 were selected for study. All patients had abortion more than twice. The embryo-related tissues of these patients were collected for CMA detection， and the results were analyzed to study the value of CMA in the diagnosis of recurrent abortion. Result： Among all patients， 40 cases （66.67%） had abnormal chromosome number， 3 cases （5.00%） had abnormal chromosome structure and 1 case （1.67%） had single diploid， and the most abnormal patients （82.5%） had abnormal chromosome number before 8 weeks of pregnancy， the maternal age was over 35 years old， and the incidence of abnormal chromosome number was higher， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Chromosome examination of embryo-related tissues of parturient using CMA technology can find out the risk factors of recurrent abortion. The method is simple and efficient， has a great value in the diagnosis， reproductive risk assessment and reproductive guidance function of recurrent abortion， and can be standardized in clinical work.

[Key words] Recurrent abortion Chromosome microarray analysis Chromosome abnormalities Inheritance

First-authors address： Shenzhen City Luohu District Maternal and Child Health Hospital， Shenzhen 518000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.035

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指同一性伴侶連續(xù)發(fā)生3次及以上的自然流產(chǎn)，其發(fā)生率為1%～3%，但大多數(shù)專家認(rèn)為連續(xù)發(fā)生2次流產(chǎn)即應(yīng)重視并予評(píng)估[1-2]。研究與實(shí)踐表明，患者發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)次數(shù)越多，不孕、月經(jīng)紊亂以及宮腔粘連等癥狀的發(fā)生率越高，給患者與其家人帶來(lái)的悲傷與抑郁等負(fù)性情緒反應(yīng)越大[3]。因此，隨著對(duì)該疾病認(rèn)識(shí)的加深，相關(guān)醫(yī)務(wù)工作者對(duì)流產(chǎn)次數(shù)超過(guò)2次以上患者的關(guān)注度逐漸加深，臨床上一般對(duì)該類患者進(jìn)行合理的評(píng)估。研究證明，導(dǎo)致自然流產(chǎn)發(fā)生的原因有孕產(chǎn)婦免疫系統(tǒng)功能紊亂、胚胎染色體異常、產(chǎn)婦內(nèi)分泌功能紊亂、生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、生殖泌尿系統(tǒng)發(fā)生病原微生物的感染以及宮頸生理功能的紊亂與異常，所有原因中最常見(jiàn)的是胚胎染色體異常[4]。因此，采取科學(xué)規(guī)范的技術(shù)手段對(duì)胚胎的染色體進(jìn)行檢查對(duì)檢測(cè)與排除復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、指導(dǎo)生育與妊娠具有十分重要的價(jià)值[5]。染色體微陣列技術(shù)（CMA）是近幾年研究出的采用微陣列的技術(shù)手段對(duì)染色體的數(shù)目形態(tài)等進(jìn)行分析的技術(shù)[6-7]，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)全基因組的檢測(cè)與掃描，能夠檢測(cè)出變異程度極小的微重復(fù)與微缺失，填補(bǔ)了以往常規(guī)檢測(cè)手段無(wú)法檢測(cè)5 Mb以下基因變異的技術(shù)空白，同時(shí)該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，取材方便，對(duì)產(chǎn)婦的傷害較小，誘發(fā)感染的可能性比較低[8-9]，因此研究將該技術(shù)應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)產(chǎn)婦染色體檢測(cè)中有一定的意義。為了研究該技術(shù)應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷中的可行性與實(shí)際價(jià)值，本院特選擇收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者進(jìn)行此次研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年7月-2019年6月本院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者60例進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）流產(chǎn)次數(shù)≥2次;（2）年齡在20周歲以上;（3）均符合復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn);（4）診斷確認(rèn)胚胎已經(jīng)停止發(fā)育，并經(jīng)合理評(píng)估認(rèn)定需要施行清宮術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神疾病;（2）合并糖尿病、高血壓、冠心病等心腦血管疾病;（3）中途退出。60例患者，年齡29～41歲，平均（28.28±1.39）歲;孕周5.33～12.00周，平均（8.46±1.08）周;流產(chǎn)次數(shù)2～5次，平均（2.43±1.07）歲。該研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 材料、試劑與儀器 （1）材料。DNA提取盒（德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)），PCR純化試劑盒、基因工程相關(guān)酶類（Nsp I、T4連接酶等）、PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Clontech公司生產(chǎn)）、標(biāo)記與片段化試劑盒、芯片試劑盒（美國(guó)Affymetrix公司生產(chǎn)）。（2）設(shè)備。雜交儀、洗滌工作站、掃描儀，均來(lái)自美國(guó)Affymetrix公司。

1.3 方法 手術(shù)前，預(yù)先將需要進(jìn)行樣本采集的1.5 mL離心管裝入適量生理鹽水，在對(duì)產(chǎn)婦進(jìn)行手術(shù)過(guò)程中，將手術(shù)獲取的胚胎部位組織用無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈，然后使用干凈未受污染的手術(shù)器械將胚胎的絨毛組織剪下大約80 mg，將剪取的組織放置在事先準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，盡快（不超過(guò)1 h）送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。送入實(shí)驗(yàn)室后使用專業(yè)的DNA提取試劑盒對(duì)組織中的全基因組DNA進(jìn)行提取，提取完成后，將提取到的DNA取250 ng，使用Nsp I酶進(jìn)行處理，將其分解為較小的片段，然后把分解產(chǎn)物的尾端補(bǔ)齊，再使用T4連接酶將共同引物連接于分解的片段上，然后將該片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及純化處理，最后使用標(biāo)記與片段化試劑盒進(jìn)行處理，將其同雜交液混勻，經(jīng)過(guò)變性處理后置于芯片試劑盒，然后使用雜交儀雜交16 h左右，注意轉(zhuǎn)速控制在60 r/min，溫度為50 ℃，最后雜交后的樣品使用洗滌工作站進(jìn)行處理，將染色洗凈，使用掃描儀進(jìn)行圖像的捕獲，取得本研究需要的數(shù)據(jù)。

1.4 結(jié)果判讀 本研究經(jīng)過(guò)CMA取得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用專業(yè)數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析。然后對(duì)拷貝數(shù)變異（CNV）情況進(jìn)行分析比較，比較的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)自DGV、OMIM、DECIPHER以及ISCA等數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)結(jié)合查閱的相關(guān)專業(yè)文獻(xiàn)資料，嚴(yán)格解讀患者的CNV情況，現(xiàn)階段的研究認(rèn)為，CNV可以分成3個(gè)不同的等級(jí)：（1）致病性;（2）未確定意義;（3）不致病。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示;計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)與Fisher檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體異常的類型與分布情況 所有患者中異常44例（73.33%），其中染色體數(shù)目異常40例（66.67%），染色體結(jié)構(gòu)異常3例（5.00%），單親二倍體1例（1.67%），見(jiàn)表1。

2.2 異常患者孕周分布情況 所有患者中，發(fā)生流產(chǎn)最多孕周為8周之前，檢出異?；颊咦疃嗟囊矠樵摃r(shí)期（82.5%），見(jiàn)表2。

2.3 患者染色體異常的年齡分布 產(chǎn)婦年齡超過(guò)35歲，染色體數(shù)目異常的發(fā)生率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指的是連續(xù)發(fā)生2次及以上的自然流產(chǎn)，產(chǎn)婦大多在妊娠的20周以內(nèi)發(fā)生流產(chǎn)，妊娠終止，發(fā)生該病之前最常見(jiàn)的癥狀有異常陰道出血以及腹部疼痛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，該病與多種因素有關(guān)，比較常見(jiàn)的有產(chǎn)婦生殖系統(tǒng)發(fā)育異常、胎兒染色體異常以及遭受病原微生物的感染等，其中最常見(jiàn)的致病因素是胎兒發(fā)生的染色體異常[10-11]。臨床上診斷和治療該疾病時(shí)需要通過(guò)規(guī)范的體格檢查、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)纳笜?biāo)以及相關(guān)影像學(xué)手段等將該病與異位妊娠、葡萄胎等疾病進(jìn)行鑒別診斷，同時(shí)明確發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的具體病因并做出合理干預(yù)指導(dǎo)。因此，采取適當(dāng)?shù)氖侄蚊鞔_產(chǎn)婦發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的病因具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。但是以往檢測(cè)手段復(fù)雜多樣，缺乏針對(duì)性，同時(shí)許多檢查手段對(duì)患者傷害較大，難以被患者接受，因而限制了該病的診斷與治療。本院考慮采用CMA技術(shù)對(duì)流產(chǎn)胎兒進(jìn)行染色體檢查，評(píng)估該項(xiàng)檢查應(yīng)用的實(shí)際價(jià)值。

CMA技術(shù)是一項(xiàng)遺傳學(xué)檢查技術(shù)，該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)整體基因組拷貝數(shù)的單次、高通量、高敏感性以及高分辨率的檢測(cè)[12-13]，能夠?qū)Πl(fā)生變異的位置以及內(nèi)在實(shí)際基因含量進(jìn)行精確地定位，同時(shí)通過(guò)與正?；蚪M進(jìn)行比對(duì)分析，可以對(duì)患者的相關(guān)臨床癥狀做出合理解釋，對(duì)患者的治療方案以及疾病治療的預(yù)后做出科學(xué)評(píng)估[14]。因此CMA技術(shù)與其他的遺傳學(xué)檢查技術(shù)相比，對(duì)染色體異常的檢出更精確靈敏[15]，對(duì)因染色體異常導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的臨床診斷具有較大的價(jià)值，除此之外，還可以對(duì)夫妻雙方的變異位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)下一次生育的流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，效果卓著，具有其他研究方法不具有的優(yōu)點(diǎn)。

本研究中，所有患者檢測(cè)均成功，共檢測(cè)出染色體存在異?；颊?4例（73.33%），其中染色體數(shù)目異常者有40例（66.67%），染色體結(jié)構(gòu)異常3例（5.00%），單親二倍體者有1例（1.67%）。本結(jié)果可以證明，染色體異常是引起復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的最常見(jiàn)原因。所有染色體數(shù)目異?；颊咧校畛Ｒ?jiàn)的異常類型是16三體，其次常見(jiàn)的X染色體缺失，另外21三體異?，F(xiàn)象的出現(xiàn)比例也比較高，其余異常類型相對(duì)而言出現(xiàn)比例較低，這提示在臨床工作中要注意以上常見(jiàn)異常類型的排查，如果在患者的流產(chǎn)胚胎中查見(jiàn)非整倍異?，F(xiàn)象，那么可以認(rèn)為導(dǎo)致產(chǎn)婦發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的最根本原因是非整倍體異常。針對(duì)此現(xiàn)象，建議患者按照科學(xué)合理的方式進(jìn)行自然妊娠，妊娠期間注意做好相關(guān)檢查與篩查工作，發(fā)現(xiàn)異常時(shí)及時(shí)處置。比較孕周與流產(chǎn)之間關(guān)系發(fā)現(xiàn)，所有患者中，發(fā)生流產(chǎn)最多孕周為8周之前，檢出異?；颊咦疃嗟囊矠樵摃r(shí)期（82.50%），這可能是因?yàn)槿旧w異常在妊娠早期即可導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育，引起流產(chǎn)，這提示要做好早期妊娠的排查工作，對(duì)存在明確流產(chǎn)跡象的產(chǎn)婦按照診療規(guī)范做出處理。最后，還分析了產(chǎn)婦年齡與染色體異常之間的關(guān)系，結(jié)果表明，產(chǎn)婦年齡超過(guò)35歲以后，染色體數(shù)目異常的發(fā)生率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因此，要指導(dǎo)備孕夫妻盡量在合適的年齡妊娠，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)高齡產(chǎn)婦的監(jiān)測(cè)，做好針對(duì)此類產(chǎn)婦的臨床檢查工作，及時(shí)排查染色體異?，F(xiàn)象。

綜上所述，將CMA檢查技術(shù)應(yīng)用于自然流產(chǎn)患者的臨床診斷中，對(duì)該類患者胚胎相關(guān)組織進(jìn)行染色體分析，準(zhǔn)確率較高，分辨率較高，可以檢出拷貝數(shù)很小的變異基因;同時(shí)，此種技術(shù)操作簡(jiǎn)單，取材方便，可以提取產(chǎn)婦流產(chǎn)的絨毛組織以及死亡的胚胎相關(guān)組織進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)產(chǎn)婦傷害較小，易于被產(chǎn)婦及家人接受。同時(shí)在檢測(cè)時(shí)不需要進(jìn)行培養(yǎng)操作，縮短了等待時(shí)間，克服了常規(guī)檢測(cè)手段等待時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)患者傷害較大、檢測(cè)準(zhǔn)確率低等缺點(diǎn)，效果顯著，減輕了患者受到的傷害，利于排查產(chǎn)婦流產(chǎn)的原因，利于對(duì)妊娠進(jìn)行指導(dǎo)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，前景廣闊，值得推廣。

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（收稿日期：2019-08-02） （本文編輯：程旭然）