黃青 凌志杰 鄒毓華 鐘小明 楊赟 張明海 羅開源

【摘要】 目的：觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在兒童腎病綜合征（NS）鼠模型中作用，探討B(tài)MSCs移植治療兒童NS的可能性。方法：分離、純化、擴(kuò)增和鑒定BMSCs。21日齡剛斷奶的SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，篩選尿蛋白濃度<0.8 g/L作為實(shí)驗(yàn)用鼠。隨機(jī)選取5只實(shí)驗(yàn)用鼠作為正常對照稱A組，其余實(shí)驗(yàn)鼠按照Bertani法尾靜脈注射鹽酸阿霉素制作MCNS鼠模型。成模后隨機(jī)分成B、C、D組，每組5只，分別按計(jì)劃注射生理鹽水、潑尼松灌胃和注射BMSCs細(xì)胞懸液。各組大鼠按計(jì)劃進(jìn)行24 h尿蛋白定量和血肌酐檢測。結(jié)果：造模前，各組24 h尿蛋白和血肌酐水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模后，B、C、D組24 h尿蛋白和血肌酐水平均升高，且A組24 h尿蛋白和血肌酐水平均低于其他三組（P<0.05）;干預(yù)后1、4、8周，B、C、D組24 h尿蛋白和血肌酐水平均持續(xù)升高，C、D組24 h尿蛋白和血肌酐水平均低于B組（P<0.05），且D組干預(yù)后8周血肌酐水平低于C組（P<0.05）。結(jié)論：BMSCs移植可改善阿霉素誘導(dǎo)的腎損傷，降低蛋白尿和血肌酐水平。

【關(guān)鍵詞】 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 腎病綜合征 阿霉素

[Abstract] Objective： To observe the role of bone mesenchymal stem cells （BMSCs） in the rat model of nephrotic syndrome （NS） in children， and to explore the possibility of BMSCs transplantation in the treatment of NS in children. Method： Separation， purification， amplification and identification of BMSCs. After adaptive feeding of 21-day-old newly weaned SD rats， urinary protein concentration <0.8 g/L was selected as experimental rats. Five experimental mice were randomly selected as control group A. The other experimental mice were injected adriamycin hydrochloride into tail vein according to Bertani method to make MCNS mice model. The rats were randomly divided into groups B， C and D， with 5 rats in each group， and they were given normal saline injection， Prednisone intragastric administration and BMSCs cell suspension injection respectively according to the plan. The 24-hour urinary protein and serum creatinine were measured in each group. Result： Before modeling， there were no significant differences in 24-hour urinary protein and serum creatinine levels among the groups （P>0.05）. After modeling， 24-hour urinary protein and creatinine levels in groups B， C and D increased， and 24-hour urinary protein and creatinine levels in group A were lower than those in other three groups （P<0.05）. At 1， 4 and 8 weeks after intervention， the 24-hour urinary protein and creatinine levels in groups B， C and D increased continuously， while the 24-hour urinary protein and creatinine levels in groups C and D were lower than those in group B （P<0.05）， the serum creatinine level in group D was lower than that in group C after intervention 8 weeks （P<0.05）. Conclusion： BMSCs transplantation can ameliorate adriamycin-induced renal injury and reduce the levels of proteinuria and creatinine.

[Key words] Bone mesenchymal stem cells Nephrotic syndrome Adriamycin

First-authors address： First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.010

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是兒童泌尿系統(tǒng)的常見病，多為原發(fā)性，微小病變型居多[1]。微小病變型腎病綜合征（minimal change nephrotic syndrome，MCNS）病因不明，目前兒科臨床多采用以糖皮質(zhì)激素為主的綜合治療。兒童正處于生長發(fā)育關(guān)鍵期，大量蛋白尿和長期服用激素等藥物會(huì)影響患兒的生長發(fā)育和心身健康。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有增殖、分化、分泌和免疫調(diào)節(jié)等功能。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在損傷修復(fù)、再生、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用[2]。本研究采用體外擴(kuò)增的大鼠BMSCs經(jīng)尾靜脈途徑注入阿霉素誘導(dǎo)MCNS鼠模型體內(nèi)，觀察其療效并探索其可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 BMSCs提取及鑒定 60～80 g雄性SD大鼠（購于贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）頸椎脫臼處死，取出雙股骨和脛骨。PBS沖洗骨髓腔，經(jīng)大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，用貼壁法純化培養(yǎng)BMSCs。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（Hycolne），100 U/L青、鏈霉素，2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM-LG（Hycolne）完全培養(yǎng)基。BMSCs鑒定：（1）表型。P5代對數(shù)生長期的BMSCs，按試劑盒說明書要求加入抗體（Biolegend），避光孵育，充分洗滌后制成單細(xì)胞懸液后用流式細(xì)胞儀檢測。（2）分化。P5代對數(shù)生長期的BMSCs種板后，用成脂和成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)（成脂誘導(dǎo)劑包括DMEM-HG、10%胎牛血清、10-6 mol地塞米松、0.5 mmol 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10 μg/mL胰島素、0.2 mmol吲哚美辛;成骨誘導(dǎo)劑包括DMEM-HG、10%胎牛血清、10-7 mol地塞米松、10 mmol β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C;主要試劑均購于Sigma）。成脂誘導(dǎo)2周、成骨誘導(dǎo)3周后分別進(jìn)行油紅O和Von Kossa 染色[3]。

1.2 造模與分組 斷奶日齡21 d的雄性SD大鼠，平均體重（40.0±8.5）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，測尿蛋白值<0.8 g/L者作為實(shí)驗(yàn)用鼠。隨機(jī)抽取5只實(shí)驗(yàn)用鼠作為正常對照命名為A組，其余實(shí)驗(yàn)用鼠按Bertani法進(jìn)行造模[4]。鹽酸阿霉素粉針劑10 mg（輝瑞制藥）用生理鹽水配成2 mg/mL的溶液，非麻醉下尾靜脈一次性按7.5 mg/kg劑量注射阿霉素，14 d后尿蛋白定量>30 mg/24 h表示造模成功，認(rèn)定為NS模型鼠并隨機(jī)分成B、C、D組，各5只。

1.3 實(shí)驗(yàn)各組干預(yù) 將P4～P5代BMSCs，配成濃度約1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，在D組（干細(xì)胞治療）大鼠成模后的第2天和第8天分別經(jīng)尾靜脈注射2 mL BMSCs懸液[內(nèi)含（1～2）×106個(gè)BMSCs];與D組干預(yù)相同時(shí)間，A組（正常對照）、B組（空白對照）大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水;C組（激素治療）大鼠在成模后第2天開始給予潑尼松5 mg/（kg·d）灌胃給藥，連續(xù)給藥8周。

1.4 標(biāo)本收集與檢測

1.4.1 尿標(biāo)本收集及檢測 將實(shí)驗(yàn)鼠置入代謝籠中，代謝籠下置干凈空瓶。為防止尿液變質(zhì)，空瓶中預(yù)先加入1 mL的甲醛。24 h后，收集尿液送檢驗(yàn)科測量尿液總體積和尿蛋白濃度，計(jì)算得出24 h尿蛋白量。收集次數(shù)與時(shí)間如下，第一次：購買回SD大鼠適應(yīng)性培養(yǎng)第7天;第二次：模型鼠注射阿霉素第14天;第三次：以D組干細(xì)胞治療首次干預(yù)后第1周;第四次：以D組干細(xì)胞治療首次干預(yù)后第4周;第五次：以D組干細(xì)胞治療首次干預(yù)后第8周。

1.4.2 血標(biāo)本收集及血肌酐的檢測 用乙醚麻醉后，經(jīng)眶靜脈采血用抗凝管收集，立即送至檢驗(yàn)科檢測血肌酐水平。采血次數(shù)與時(shí)間如下，第一次：造模鼠注射阿霉素第14天;第二次：以D組干細(xì)胞治療首次干預(yù)后第1周;第三次：以D組干細(xì)胞治療首次干預(yù)后第4周;第四次：以D組干細(xì)胞治療首次干預(yù)后第8周。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 25.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs培養(yǎng)與純化 原代培養(yǎng)的BMSCs貼壁生長，呈星形或多角形，含有一定量的懸浮圓形雜質(zhì)細(xì)胞，見圖1;經(jīng)傳代培養(yǎng)，雜質(zhì)細(xì)胞逐漸減少變純、BMSCs大量擴(kuò)增;傳至P3代時(shí)，鏡下觀察幾乎未見懸浮培養(yǎng)的雜質(zhì)細(xì)胞，見圖2。

2.2 BMSCs表型鑒定結(jié)果 P5代對數(shù)生長期的BMSCs經(jīng)用流式細(xì)胞儀檢測后，BMSCs表型為CD90+、CD29+、CD45-、CD34-，其中CD90、CD45、CD34、CD29陽性細(xì)胞群的熒光吸收峰分別為98.2%、1.32%、1.01%、99.1%，見圖3。

2.3 BMSCs分化結(jié)果 成脂誘導(dǎo)2周進(jìn)行油紅O染色，結(jié)果陽性可見染成紅色的脂肪細(xì)胞，見圖4;成骨誘導(dǎo)3周后進(jìn)行Von Kossa染色，結(jié)果陽性可見成骨細(xì)胞包漿內(nèi)有黑色物質(zhì)沉淀物，見圖5。

2.4 各組24 h尿蛋白比較 造模前，各組24 h尿蛋白比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;造模后，B、C、D組24 h尿蛋白均數(shù)高于30 mg/24 h，B、C、D組的組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但A組24 h尿蛋白均低于其他三組（P<0.05）;干預(yù)后1、4、8周，B、C、D組24 h尿蛋白均持續(xù)升高，C、D組24 h尿蛋白均低于B組（P<0.05），但C、D組24 h尿蛋白比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖6、表1。

2.5 各組血肌酐水平比較 造模前，各組血肌酐水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05 ）;造模后，B、C、D組血肌酐水平均升高，B、C、D組的組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但A組血肌酐水平均低于其他三組（P<0.05）;干預(yù)后1、4、8周，B、C、D組血肌酐水平均持續(xù)升高，C、D組血肌酐水平均低于B組（P<0.05）;干預(yù)后1、4周，C、D組血肌酐水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），干預(yù)后8周，D組血肌酐水平低于C組（P<0.05）。見圖7、表2。

3 討論

NS是由多原因引起的腎小球基底膜通透性增高，導(dǎo)致大量血漿蛋白從尿中丟失的一種臨床綜合征，以大量蛋白尿、低蛋白血癥、高膽固醇血癥和水腫為主要臨床表現(xiàn)[5-6]。兒童NS以微小病變型居多，多為3～5歲的學(xué)齡前兒童。MCNS的病理表現(xiàn)為：光鏡下腎小球基本正常，電鏡下彌漫性腎小球臟層上皮細(xì)胞足突消失[7]。目前認(rèn)為MCNS發(fā)病主要與腎小球?yàn)V過膜靜電屏障減弱或消失有關(guān)，使帶負(fù)電荷的白蛋白大量漏出形成蛋白尿。

阿霉素是一種含醌式結(jié)構(gòu)具有抗腫瘤作用的抗生素，在體內(nèi)酶的作用下可形成半醌型自由基。半醌型自由基氧化反應(yīng)后可生成活性氧物質(zhì)，誘發(fā)腎小球上皮系部脂質(zhì)過氧化，破壞腎小球?yàn)V過膜，導(dǎo)致屏障功能障礙從而引起蛋白尿。阿霉素NS鼠模型于1982年Bertani等率先報(bào)道，具有造模簡便、成功率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是公認(rèn)較好MCNS鼠模型[8]。本實(shí)驗(yàn)采用Bertain法，尾靜脈一次性大劑量（7.5 mg/kg）注射鹽酸阿霉素進(jìn)行造模，注射后14 d后尿蛋白定量均>30 mg/24 h，成模率達(dá)100%。

BMSCs是一類來自骨髓的多能干細(xì)胞，具有大量增殖、多向分化、旁分泌、免疫調(diào)節(jié)、低免疫源性和損傷修復(fù)等功能，是組織工程的理想種子細(xì)胞。目前研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)下可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[9-11]。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)BMSCs分化成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。BMSCs在培養(yǎng)中可分泌多種細(xì)胞因子，如胰島素樣生長因子-1、肝細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、神經(jīng)生長因子等[12-15]。Zhuo等[16]在BMSCs移植治療孤立腎缺血再灌注鼠模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：BMSCs可通過調(diào)節(jié)抗氧化/氧化平衡來改善缺血再灌注導(dǎo)致的腎損傷。Yang等[17]在BMSCs移植治療局灶節(jié)段性腎小球硬化鼠模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：BMSCs移植可能通過上調(diào)MMP/TIMP和下調(diào)IL-6、TNF-α來降低尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平。Jiao等[18]在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：BMSCs移植能通過激活Wnt/β-Catenin通路減少順鉑誘導(dǎo)的腎損傷。

在本實(shí)驗(yàn)采用尾靜脈注射的方式將BMSCs移植入阿霉素誘導(dǎo)的MCNS鼠模型體內(nèi)，通過比較同期各組大鼠24 h蛋白尿定量和血肌酐水平觀察療效，結(jié)果顯示，BMSCs移植和激素均能降低MCNS鼠模型的蛋白尿和血肌酐水平，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。BMSCs移植能改善阿霉素誘導(dǎo)的MCNS鼠模型腎損傷且無長期使用激素引起的感染、代謝異常等并發(fā)癥。吳悠等[19]研究發(fā)現(xiàn)阿霉素誘導(dǎo)的MCNS模型鼠Th17/Treg免疫失衡程度與腎臟損傷成正比，早期應(yīng)用潑尼松可通過下調(diào)腎臟局部Th17水平保護(hù)腎臟。劉倩等[20]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞移植能減輕阿霉素誘導(dǎo)的NS鼠模型蛋白尿水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)告，本課題認(rèn)為，干細(xì)胞可能通過其免疫調(diào)理作用保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的MCNS模型鼠的腎損傷。

綜上所述，BMSCs移植可改善阿霉素誘導(dǎo)的MCNS模型鼠的腎損傷，降低蛋白尿和血肌酐水平，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]單文婕，龔瑩靚，朱亞菊，等.兒童腎病綜合征腎組織病理免疫熒光分型和病理類型與激素療效關(guān)系[J].臨床兒科雜志，2017，35（2）：111-114.

[2] Sargent A，Miller R H.MSC Therapeutics in Chronic Inflammation[J].Curr Stem Cell Rep，2016，2（2）：168-173.

[3] Guo J，Gao X，Lin Z，et al.BMSCs reduce rat granulosa cell apoptosis induced by cisplatin and perimenopause[J].BMC Cell Biology，2013，14（1）：18.

[4] Guo J，Zou Y，Wu Z，et al.Protective effects of mesenchymal stromal cells on adriamycin-induced minimal change nephrotic syndrome in rats and possible mechanisms[J].Cytotherapy，2014，16（4）：471-484.

[5] Dwivedi S，Sharma P.Stem Cell Biology：A New Hope in Regenerations and Replenishments Therapy[J].Indian J Clin Biochem，2018，33（4）：369-371.

[6]保睿，陳朝英.兒童原發(fā)性腎病綜合征中microRNAs的研究進(jìn)展[J]中國醫(yī)刊，2018，53（8）：872-874.

[7]馮小倩，王墨.兒童微小病變腎病免疫發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].兒科藥學(xué)雜志，2017，23（1）：53-56.

[8]包玉龍，楊瑞，劉禾，等.阿霉素大鼠腎病綜合征模型最佳劑量的篩選[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2018，39（5）：61-63.

[9] Zhang J，Jiang N，Yu H，et al.Requirement of TGFβ Signaling for Effect of Fluoride on Osteoblastic Differentiation[J].Biological Trace Element Research，2019，187（2）：492-498.

[10] Bai X，Li G，Zhao C，et al.BMP7 induces the differentiation of bone marrow-derived mesenchymal cells into chondrocytes[J].Med Biol Eng Comput，2011，49（6）：687-692.

[11] Hong R，Renshun X，Xinghai J，et al.Biofunctionalized self-assembly of peptide amphiphile induces the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into neural cells[J].Mol Cell Biochem，2018，450（1-2）：199-207.

[12] Gao S，Zhao Z，Wu R，et al.Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation improves radiation-induced heart injury through DNA damage repair in rat model[J].Radiat Environ Biophys，2017，56（1）：63-77.

[13]王勁，陳燕，王琳.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌作用研究進(jìn)展[J].中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2016，23（1）：57-61.

[14]邱紀(jì)玲，王曉彤，周灝雯，等.間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液修復(fù)多種疾病損傷的潛能[J].中國組織工程研究，2019，23（29）：4743-4748.

[15]李淑華，高麗蓮，陳系古，等.表達(dá)肝細(xì)胞生長因子的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞[J].中國病理生理雜志，2019，35（6）：1118-1123.

[16] Zhuo W，Liao L，Xu T，et al.Mesenchymal stem Cells Ameliorate ischemia-reperfusion-induced renal dysfunction by improving the antioxidant/oxidant balance in the ischemic kidney[J].Urol Int，2011，86（2）：191-196.

[17] Yang R C，Zhu X L，Wang J，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells attenuate the progression of focal segmental glomerulosclerosis in rat models[J].BMC Nephrol，2018，19（1）：335.

[18] Jiao X，Cai J，Yu X，et al.Paracrine Activation of the Wnt/β-Catenin Pathway by Bone Marrow Stem Cell Attenuates Cisplatin-Induced Kidney Injury[J].Cell Physiol Biochem，2017，44（5）：1980-1994.

[19]吳悠，李昊，陳婉冰，等.潑尼松對阿霉素腎病小鼠腎臟Th17/Treg免疫平衡的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，44（5）：568-576.

[20]劉倩，張玉靜，劉靜，等.脂聯(lián)素與鼠脂肪干細(xì)胞移植治療大鼠腎病綜合征[J].中國組織工程研究，2018，22（13）：2109-2113.

（收稿日期：2019-07-22） （本文編輯：董悅）