彭夢雪 梁志宏

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京100083）

曲霉屬（Aspergillus spp.）真菌隸屬于半知菌亞門（deuteromycotina）絲孢綱（hyphomycetes）絲孢目（hyphomycetales）叢梗孢科（moniliaceae），廣泛分布于土壤、空氣和農(nóng)作物中，屬內(nèi)常見菌種主要有黃曲霉（A.flavus）、赭曲霉（A.ochraceus）、煙曲霉（A.fumigatus）、灰綠曲霉（A.glaucus）、寄生曲霉（A.parasiticus）、土曲霉（A.terreus）和雜色曲霉（A.versicolor）等[1-2]。曲霉屬真菌產(chǎn)生的毒素污染食品、飼料及藥物，人或動物攝入后可引起肝、腎毒性、生殖毒性、致癌和致突變性等[3-4]。曲霉屬真菌在土壤中以分生孢子或菌核的形式存在，在植物組織中則以菌絲體的形式存在。菌核能在極端脅迫環(huán)境條件（高溫、干旱等）下存活，并能產(chǎn)生分生孢子或子囊孢子。環(huán)境因子包括溫度、pH、光照、脂類、宿主蛋白及酚類化合物等均會影響曲霉屬真菌的菌絲生長、孢子產(chǎn)生和毒素合成[5]。研究者對曲霉屬真菌毒素的生物合成相關(guān)基因、關(guān)鍵酶及調(diào)控因子、代謝通路、環(huán)境影響因子以及阻控毒素危害等方面開展了大量的研究[3，6-7]。迄今為止，參與黃曲霉毒素生物合成的一系列基因、酶及部分調(diào)控因子已基本清楚，而其它曲霉毒素，例如赭曲霉毒素的生物合成機制尚不清晰，還不能有效控制糧食中曲霉屬真菌毒素的產(chǎn)生。

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是微生物間通過釋放一些特定的小分子化學物質(zhì)，并感知其濃度變化，來監(jiān)測群體密度并調(diào)控自身的某些生理行為，從而適應(yīng)周圍環(huán)境的一種信號交流機制，又稱為“自動誘導(dǎo)（autoinduction）”或“細胞與細胞的交流（cell to cell communication）”。群體感應(yīng)現(xiàn)象最早于20 世紀70年代，在費氏發(fā)光弧菌（Vibrio fluvialis）[8]中發(fā)現(xiàn)，細菌可通過群體感應(yīng)通信機制，調(diào)節(jié)其菌相轉(zhuǎn)換、毒力因子產(chǎn)生、生物膜形成、生物發(fā)光等生理活動[9]，進而適應(yīng)環(huán)境的變化。在真菌中也發(fā)現(xiàn)類似于細菌群體感應(yīng)的密度依賴性調(diào)節(jié)現(xiàn)象，許多動植物致病菌如白色念珠菌（Candida albicans）[10]、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）[11]、腐榆角藻菌（Ceratocystis ulmi）[12]等，可通過群體感應(yīng)誘導(dǎo)毒力因子的分泌，增強其入侵動植物的能力。此外，曲霉屬真菌的形態(tài)建成和次級代謝物的產(chǎn)生，也與群體的密度密切相關(guān)。黃曲霉以密度依賴的方式調(diào)節(jié)菌核、孢子以及黃曲霉毒素產(chǎn)生，其中低密度群體產(chǎn)生更多的黃曲霉毒素，并可以增加菌核，降低分生孢子產(chǎn)生；隨著群體密度的升高，曲霉屬真菌表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)，產(chǎn)生的菌核減少，分生孢子增加，毒素產(chǎn)量降低[13]。在赭曲霉中也發(fā)現(xiàn)類似于黃曲霉的群體密度依賴性現(xiàn)象，將不同密度的赭曲霉孢子分別接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基和花生、玉米、大豆、小麥中，低密度接種情況下赭曲霉毒素A 生物合成相關(guān)基因pks的表達量更高，產(chǎn)生更多的赭曲霉毒素A[14]。

隨著分子生物學新理論和新技術(shù)的發(fā)展，尤其是基因組學和生物信息學等研究的快速發(fā)展，許多研究對曲霉屬真菌毒素生物合成的分子機制做了很多探索，其中包括群體密度依賴性的調(diào)控機制。本文以黃曲霉、赭曲霉、煙曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)毒曲霉為例，評述調(diào)控其毒素產(chǎn)生的群體感應(yīng)分子機制的相關(guān)因素，包括信號分子（主要是脂氧合物）、G 蛋白偶聯(lián)信號途徑以及氧化應(yīng)激，旨在為深化曲霉屬真菌的有毒次級代謝產(chǎn)物的生物合成機制研究提供參考。

1 曲霉屬真菌中的群體感應(yīng)現(xiàn)象

真菌群體感應(yīng)現(xiàn)象研究最多的是人類致病菌白色念珠菌（Candida albicans）。長期以來觀察到，白色念珠菌細胞密度較低時呈絲狀生長，而密度較高時以出芽酵母形態(tài)生長，其信號分子是法尼醇（farnesol）[15]、酪醇[16]等。此外，還在酵母[17-18]、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）[11]、曲霉屬真菌[13]中發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)現(xiàn)象。曲霉屬真菌菌體的形態(tài)建成和次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與群體密度有關(guān)。黃曲霉以密度依賴方式繁殖，在低群體密度時菌核產(chǎn)量增加，分生孢子減少，黃曲霉毒素產(chǎn)量較高，高群體密度時則相反。

目前發(fā)現(xiàn)的曲霉屬真菌群體感應(yīng)信號分子主要是脂氧合物（oxylipins）[19]，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑是G 蛋白偶聯(lián)信號途徑。在構(gòu)巢曲霉中，發(fā)現(xiàn)G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptors，GPCRs）參與了與次級代謝，性發(fā)育，應(yīng)激信號和氨基酸代謝相關(guān)的基因調(diào)控[20-21]。在這些GPCRs 缺失的真菌中觀察到代謝轉(zhuǎn)變，并引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，這反映調(diào)節(jié)環(huán)境變化的代謝反應(yīng)的微調(diào)機制[20]。對煙曲霉G蛋白偶聯(lián)受體GprC 和GprD 的缺失突變體的轉(zhuǎn)錄組分分析表明，參與初級代謝的基因下調(diào)，而幾個次級代謝基因簇的轉(zhuǎn)錄水平升高[22]。雖然早已發(fā)現(xiàn)曲霉屬真菌的群體密度依賴性的現(xiàn)象，但是其群體感應(yīng)信號分子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍然有限，需要表征和鑒定更多的信號分子，以闡明曲霉屬真菌的群體感應(yīng)信號調(diào)節(jié)機制。

2 曲霉屬真菌的群體感應(yīng)信號分子

脂類物質(zhì)及其氧化產(chǎn)物（脂氧合物）與曲霉屬真菌毒素的合成具有密切的聯(lián)系，曲霉屬真菌感染油料作物種子或含油脂高的組織之后會產(chǎn)生更多的毒素[23]。脂氧合物是多不飽和脂肪酸通過酶促或非酶促反應(yīng)產(chǎn)生的氧合脂質(zhì)，是絲狀真菌、酵母、植物和動物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要信號分子[19，24]。脂氧合物（oxylipins）在曲霉屬菌株中統(tǒng)稱為性誘導(dǎo)因子（precocious sexual inducer，psi），調(diào)節(jié)曲霉屬菌株的無性和有性發(fā)育之間的平衡。

曲霉屬真菌中存在脂氧合酶（lipoxygenase，EC 1.13.11.12，LOX）同工酶，催化脂肪酸代謝產(chǎn)生脂氧合物，調(diào)控曲霉屬真菌的分生孢子、菌核和次級代謝物產(chǎn)生[25]。LOX 是脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，其主要作用是催化多不飽和脂肪酸（如亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等）的加氧反應(yīng)，脂肪酸氫過氧化物，此過程稱為LOX 途徑或十八碳酸途徑[26]。LOX 及其代謝產(chǎn)物可影響曲霉屬真菌侵染作物種子的進程，通過參與調(diào)控曲霉屬真菌和種子互作而不同程度地影響曲霉屬真菌生長和產(chǎn)毒，從而影響種子的黃曲霉毒素污染水平。黃曲霉的LOX 與Ppo 蛋白 （psi factor-producing oxygenases，psi-氧合酶） 一起參與群體感應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。Lox 或PpoC 突變會改變密度依賴性的菌核和分生孢子的產(chǎn)生：在細胞高密度（＞105個孢子/板）條件下，與野生型分生孢子增多和菌核減少相比，突變體的菌核增加而分生孢子減少[27-28]。

真菌的脂氧合物與動、植物的脂氧合物結(jié)構(gòu)與功能相似，這是脂氧合物作為曲霉-宿主互作信號分子的重要特征[29-30]。植物來源的脂氧合物，如13S-HPODE（hydroperoxyoctadecenoic acid，HPODE）和9S-HPODE，不僅參與植物生長發(fā)育和防御反應(yīng)，而且影響黃曲霉屬真菌、寄生曲霉屬真菌和構(gòu)巢曲霉的營養(yǎng)生長、分生孢子和菌核的形成及次級代謝產(chǎn)物合成[31-32]。Burrow 等[32]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入低濃度的9S-HPODE、13S-HPODE 均能促進曲霉屬真菌孢子的形成，而對曲霉屬真菌產(chǎn)毒具有不同作用，低濃度的13S-HPODE（10 μmol/L 和100 μmol/L）能抑制寄生曲霉屬真菌和構(gòu)巢曲霉屬真菌中黃曲霉毒素合成基因的表達，并能顯著降低其黃曲霉毒素的產(chǎn)量，而相同濃度的9S-HPODE 不能抑制產(chǎn)毒。

脂氧合酶合成相關(guān)基因ppo（存在于真菌）和lox（存在于植物、動物和真菌）編碼合成的加氧酶類及其氧化產(chǎn)物（脂氧合物）具有調(diào)控曲霉屬真菌生長發(fā)育和產(chǎn)毒的作用[27]。構(gòu)巢曲霉的ppo 基因敲除后，其有性與無性發(fā)育之間的平衡被打亂。同時敲除黃曲霉ppo 基因 （ppoA，ppoB，ppoC 和ppoD）以及另一種產(chǎn)生脂氧合物的基因lox，可破壞黃曲霉的正常形態(tài)發(fā)育，即使群體密度從低到高變化，菌核也不會轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚咦?，且這些敲除ppo 和lox 基因的黃曲霉侵染玉米和花生種子后，黃曲霉毒素產(chǎn)量增加。此外，ppoC 和lox 敲除突變菌株，在任何群體密度下均產(chǎn)生高水平的黃曲霉毒素[27-28]。

其它脂氧合酶代謝產(chǎn)物，如茉莉酸甲酯[33]，六碳醛和九碳醛、醇及其相應(yīng)酯類[34-35]等可作為啟動植物防御機制的信號分子，介導(dǎo)植物抵抗病原菌侵染等過程。Zeringue 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，抗黃曲霉玉米品種產(chǎn)生的揮發(fā)性醛濃度顯著高于染病品種。這些脂氧合酶代謝產(chǎn)物可直接或間接地影響真菌生長和產(chǎn)毒，從而提高作物抗真菌毒素污染的能力。

3 G 蛋白偶聯(lián)信號途徑

G 蛋白偶聯(lián)信號途徑是真核生物中普遍存在的細胞跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與識別并轉(zhuǎn)導(dǎo)多種胞外信號分子，對真菌的生長、分化、繁殖、致病性及真菌毒素等次生代謝產(chǎn)物合成有重要的調(diào)控作用[37]。外部的信號分子由G 蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein coupled receptors，GPCR）識別，通過異源三聚體G 蛋白（heterotrimeric G protein，簡稱G蛋白，含3 個亞基Gα、Gβ、Gγ）完成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[38]，調(diào)節(jié)cAMP 通路，調(diào)控下游反應(yīng)。

G 蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)由4 部分組成：G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）、G 蛋白、下游效應(yīng)因子（如cAMP）以及信號調(diào)節(jié)蛋白[21，39-41]。GPCR 是一個非常龐大的跨膜受體家族，其功能和序列具有多樣性。在真菌中已發(fā)現(xiàn)存在于哺乳動物中的幾類GPCR[42]，它們結(jié)構(gòu)的共同特征是含7 個跨膜結(jié)構(gòu)域和與異源三聚體G 蛋白相互作用的結(jié)合位點。G 蛋白偶聯(lián)受體傳遞信號的基本原理[43]是：特異性的配體（信號分子）與相應(yīng)的GPCR 結(jié)合，引起GPCR 構(gòu)象的變化；GPCR 構(gòu)象變化之后能夠結(jié)合三聚體G 蛋白（此時Gα亞基結(jié)合1 個GDP 分子），并誘導(dǎo)G 蛋白的Gα亞基構(gòu)象發(fā)生變化，使Gα亞基釋放結(jié)合的GDP，并迅速與周圍環(huán)境中的GTP 結(jié)合；結(jié)合了GTP 的Gα亞基立即與GPCR 和Gβγ亞基復(fù)合物分離；Gα亞基和Gβγ亞基分別與下游的效應(yīng)蛋白結(jié)合，通過調(diào)控效應(yīng)蛋白的活性來實現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)；Gα亞基與效應(yīng)蛋白結(jié)合后，GTP 水解成為GDP，并與Gβγ亞基形成三聚體，等待下一次信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

曲霉屬真菌可通過GPCR 來感測環(huán)境中營養(yǎng)源、發(fā)育信號、應(yīng)激壓力及來自其它生物體的信號的變化[44]。黃曲霉和其它絲狀真菌的GPCR 敲除后，突變體的生長發(fā)育和次生代謝受到破壞。在黃曲霉gprC 和gprD 突變體中發(fā)現(xiàn)，gprC 和gprD 的敲除使得高群體密度表型向低群體密度表型的轉(zhuǎn)變能力受損，即使在不利的高群體密度下，兩種菌株也產(chǎn)生較高水平的菌核和黃曲霉毒素[13]。此外，脂氧合物可以引起構(gòu)巢曲霉中cAMP 水平顯著升高，并且構(gòu)巢曲霉G 蛋白偶聯(lián)受體gprD 基因的喪失可阻止這種cAMP 積聚。2012年，Affeldt 等[13]構(gòu)建了10 種GPCR 突變體，發(fā)現(xiàn)GprD 負責識別13S-HPODE、9S-HPODE、13S-HODE（hydroxylinoleic acid，HODE）和9S-HODE。在黃曲霉中開發(fā)了一種GPCR 敲除的文庫，gprA，gprB，gprF，gprG，gprM，gprP，gprP 或gprR 敲除的菌株對外源性茉莉酮酸甲酯（一種植物的防御性脂氧合物）的作用無應(yīng)答。gprA，gprC，gprD，gprF，gprG，gprJ，gprO 或gprP 被敲除的突變體仍然應(yīng)答于亞油酸而形成孢子，而對誘導(dǎo)孢子形成的氧脂素13S-HPODE 無應(yīng)答[44]。

G 蛋白偶聯(lián)信號途徑可以作為改進利用微生物來生產(chǎn)酶類和其它次生代謝產(chǎn)物的生物技術(shù)的重要靶標。由于這一途徑也顯著影響了菌株的生長發(fā)育，因此應(yīng)考慮靶分子改變后的副作用，如引起菌株生長缺陷，喪失生殖能力或改變毒素產(chǎn)生等。

4 曲霉屬真菌毒素合成應(yīng)答于氧化應(yīng)激壓力

真菌侵染宿主后，宿主產(chǎn)生活性氧（ROS）作為防御武器，誘導(dǎo)真菌細胞死亡[45]。在曲霉屬真菌中，抗氧化酶的產(chǎn)生是抵抗胞內(nèi)ROS 形成的第1道防線，而次級代謝物的合成則是作為抵抗ROS傷害的第2 道防線[46-48]。絲狀真菌已經(jīng)開發(fā)出復(fù)雜而成熟的應(yīng)答系統(tǒng)以避免氧化損傷。在許多絲狀真菌（包括黃曲霉、寄生曲霉、米曲霉和構(gòu)巢曲霉）中發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與毒素生物合成之間有密切的聯(lián)系[45，48]。氧化應(yīng)激可以刺激黃曲霉中的黃曲霉毒素[49]，赭曲霉中的赭曲霉毒素A[50]，禾谷鐮刀菌中的單萜烯B[51]的積累。具有抗真菌活性的抗氧化劑（例如多酚），是曲霉屬的真菌毒素生物合成的抑制劑[52]。據(jù)報道，酚類抗氧化劑如咖啡酸或綠原酸，是幾種曲霉屬的赭曲霉毒素A 產(chǎn)生的有效抑制劑[53]。

真菌可通過產(chǎn)生次生代謝物來抵抗氧化應(yīng)激壓力所帶來的損傷，許多屬于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)，協(xié)調(diào)氧化應(yīng)激與次級代謝之間的相互作用。bZIP 蛋白（如AtfA，AtfB，ApYapA 及其同系物NapA） 在絲狀真菌的生命史中起普遍的作用，它們調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)，次生代謝以及形態(tài)發(fā)育[48]。在寄生曲霉中，atfB 表達不僅與黃曲霉毒素生成相關(guān)，還結(jié)合黃曲霉毒素生物合成基因的啟動子以及應(yīng)激反應(yīng)基因[54-55]。此外，在黃曲霉毒素生產(chǎn)過程中同時發(fā)生黃曲霉毒素生物合成基因轉(zhuǎn)錄物以及atfB 轉(zhuǎn)錄物的積累[55]。AtfB 可以促進nor-1（一種黃曲霉毒素生物合成基因）的轉(zhuǎn)錄。寄生曲霉apyapA 敲除突變體對細胞外源氧化劑的易感性增加，該突變體的活性氧水平和黃曲霉毒素產(chǎn)量均增加[55]。構(gòu)巢曲霉的DApyap1 突變菌株對玉米種子的致病性增加，更早、更多地產(chǎn)生了黃曲霉毒素。構(gòu)巢曲霉的apyapA 同系物napA 過表達時，突變體更耐受氧化應(yīng)激，次級代謝產(chǎn)物合成降低[49]。另一種bZIP 蛋白，氮調(diào)節(jié)的MeaB 蛋白，可調(diào)節(jié)毒力和次級代謝[56]。當黃曲霉屬真菌株的MeaB 過表達，其定殖于種子類宿主的能力降低，脂肪酶活性降低，并失去黃曲霉毒素合成能力。

真菌病原體氧化應(yīng)激和次生代謝產(chǎn)物之間的密切關(guān)系，可以解釋為植物宿主與真菌互作所產(chǎn)生的適應(yīng)性機制。真菌侵染宿主后，激活具有解毒活性的抗氧化劑的表達來克服植物的防御性氧化應(yīng)激壓力。例如，禾谷鐮刀菌產(chǎn)生B 型頭孢霉素[51]，赭曲霉產(chǎn)生赭曲霉毒素[14]等。次生代謝產(chǎn)物如核黃素的生物合成，是真菌清除ROS 的機制，在真菌存活中起作用[57]。真菌毒素的生物合成可能有助于真菌細胞維持細胞內(nèi)ROS 的安全水平。

雖然真菌毒素生物合成的調(diào)節(jié)與氧化應(yīng)激之間的聯(lián)系遠未完全闡明，但是這種相互作用為工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物（例如抗生素）或控制作物中霉菌毒素的積累提供了廣闊的前景。例如，一些酚類的抗氧化劑通常在許多植物（包括谷物）中大量存在，這些抗氧化劑可以負調(diào)節(jié)毒素生產(chǎn)[52]。控制這些抗氧化劑在作物中的含量，可能有助于調(diào)控食物和飼料中霉菌毒素。

5 總結(jié)與展望

曲霉屬真菌在自然界中分布廣泛，是人、動物及植物的共同病原菌，其產(chǎn)生的毒素污染不僅制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，而且產(chǎn)生嚴重的食品安全問題。群體感應(yīng)分子機制可以調(diào)節(jié)曲霉屬真菌的生長發(fā)育和次級代謝，然而目前對曲霉屬真菌的群體感應(yīng)研究仍然處于初級的階段，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的信號分子、受體、下游調(diào)控通路的靶分子等仍然不清晰。目前發(fā)現(xiàn)的曲霉屬真菌群體感應(yīng)的信號分子主要是脂氧合物，其受體是G 蛋白偶聯(lián)受體 （GPCRs），G 蛋白信號通路基因的突變影響孢子形成和霉菌毒素的產(chǎn)生。不飽和脂肪酸通過脂氧合酶 （LOX） 的催化產(chǎn)生脂氧合物，lox 和ppo 可以編碼合成加氧酶類及脂氧合物，具有調(diào)控曲霉屬真菌生長發(fā)育和產(chǎn)毒的作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因表達與真菌毒素生物合成之間有密切的聯(lián)系，真菌可能通過合成毒力因子來應(yīng)對活性氧水平的升高，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)可協(xié)調(diào)氧化應(yīng)激與次級代謝之間的相互作用。

目前仍然存在一些值得深究的問題。①曲霉屬真菌的群體感應(yīng)現(xiàn)象是否與氧化應(yīng)激水平有關(guān)？真菌毒素的生物合成與群體感應(yīng)、氧化應(yīng)激均相關(guān)，這三者間的關(guān)系及這些現(xiàn)象之下的生物學機制如何仍然不清楚。②曲霉屬真菌在與植物寄主互作過程中，是如何利用寄主的脂氧合物（作為信號分子）和應(yīng)對寄主升高的氧化應(yīng)激壓力？植物對真菌的入侵有抵抗防御的能力，其中升高其體內(nèi)活性氧水平可能是機制之一；而真菌也會進化出有利于其自身生存的抵抗機制，其可能通過合成一些次級代謝產(chǎn)物（如真菌毒素）來適用寄主的氧化應(yīng)激壓力。這些問題的解答將有助于人們加深對曲霉屬真菌毒素生物合成機制及其生物學意義的理解，能夠為研究控制糧食中的真菌毒素的生物合成的抑制劑提供靶向信號通路或靶分子。