周莉，平洋，譚靜，張亞勛，羅蓓蓓

(河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450002)

1 益生菌概述

益生菌(probiotics)的概念最早源于希臘語(yǔ)，意為“對(duì)生命有益”。2001年，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當(dāng)活性微生物足量且給予宿主健康益處”。但是由于“健康益處”這一概念太過(guò)于模糊，世界衛(wèi)生組織將其進(jìn)一步補(bǔ)充為“對(duì)主體的益處必須實(shí)現(xiàn)，并且被證明超過(guò)安慰補(bǔ)償劑的范圍”[1]。益生菌是指通過(guò)改善人類腸道菌群進(jìn)而改善人體健康狀況的一類活菌，但不是所有的有益菌都稱得上是益生菌，要想成為益生菌需符合以下條件：能夠耐受胃液、膽汁的腐蝕；在腸內(nèi)是存活狀態(tài)且能增殖；能夠改善腸內(nèi)菌群；保證安全性；活菌狀態(tài)且含一定菌數(shù)；經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且容易處理[2]。益生菌不僅具有改善食品風(fēng)味，延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，提高食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的功能，而且其還具有調(diào)節(jié)胃腸道菌群正常和維持人體腸道衛(wèi)生平衡的功能[3]。益生菌在益生菌飲品、益生菌制劑和膳食添加劑中應(yīng)用廣泛，如益生菌飲料乳制品和益生菌膠囊等。

1.1 益生菌中乳酸菌概述

對(duì)于益生菌的研究，越來(lái)越多的學(xué)者將各種食品與益生菌結(jié)合起來(lái)，將益生菌添加到不同食物中進(jìn)行研究[4，5]。在所有益生菌中, 目前研究得最深入、最受重視的一類當(dāng)屬乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB), 乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱。它是一種有利于機(jī)體健康的微生物，革蘭氏陽(yáng)性桿菌或球菌,獲得能量的方式是發(fā)酵碳水化合物,從而產(chǎn)生乳酸。它不僅能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,并產(chǎn)生抑菌代謝產(chǎn)物，抑制腐敗菌的生長(zhǎng)。并通過(guò)與腐敗菌競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝抑菌素等方式,加強(qiáng)腸道生物的屏障功能，促進(jìn)了食品的安全性和人類健康。因此，乳酸菌在食品行業(yè)的開發(fā)應(yīng)用已成為熱點(diǎn)，該領(lǐng)域的發(fā)展對(duì)促進(jìn)人類健康，提升人類健康生活水平具有重大意義。

1.2 乳酸菌分類

乳酸菌作為一類能夠?qū)λ拗魃砉δ墚a(chǎn)生有益作用的活性微生物，數(shù)量巨多，除極少數(shù)外，絕大部分都是人體內(nèi)必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其廣泛存在于人體的腸道中。目前，乳酸菌分為許多種屬，它們各有其不同的特性，從食品應(yīng)用和保健作用來(lái)說(shuō)，目前開發(fā)的菌株尚不多[6]。目前在食品中常用的主要分為3類，即雙歧桿菌屬、乳桿菌屬和鏈球菌屬。乳酸菌分類及其功能見表1。

1.3 乳酸菌的主要生理功能

益生菌進(jìn)入人體腸道后，與腸內(nèi)其他微生物產(chǎn)生了一系列復(fù)雜關(guān)系并最終達(dá)到促進(jìn)宿主健康的目的。益生菌的主要生理功能如下。

1.3.1 生物屏障作用

益生菌產(chǎn)生的有機(jī)酸、細(xì)菌素和蛋白質(zhì)可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，調(diào)節(jié)腸道pH值，抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖；益生菌的表面分子與宿主上皮細(xì)胞分子識(shí)別受體相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)腸道屏障功能[7]。

1.3.2 調(diào)節(jié)腸道菌群平衡

腸道內(nèi)各種微生物相互作用，腸道內(nèi)部分乳酸菌不受外界菌株影響，有一套自我平衡系統(tǒng)，而后迅速增殖形成優(yōu)勢(shì)菌，并抑制致病菌繁殖。嗜熱鏈球菌能夠抑制病原菌生長(zhǎng)，防止壞菌滋生，治療疾病，改善腸道微環(huán)境[8]；長(zhǎng)雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道功能紊亂，維護(hù)腸道微環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用[9]。

1.3.3 營(yíng)養(yǎng)吸收

益生菌在動(dòng)物體內(nèi)還可產(chǎn)生多種消化酶如淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶等，它們促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)特別是下消化道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。乳酸菌不僅可以產(chǎn)生多種酶類，而且能通過(guò)產(chǎn)酸，提高鈣、磷、鐵的利用率，還能促進(jìn)維生素D的吸收和利用[10]。

1.3.4 免疫調(diào)節(jié)

阻止外界環(huán)境中的病原菌入侵，能夠有效地提高干擾素和巨噬細(xì)胞的活性，參與調(diào)解細(xì)胞吞噬功能中細(xì)胞因子的分泌及宿主和抗原之間的免疫反應(yīng)，進(jìn)而提高機(jī)體對(duì)致病菌的免疫力[11]。

1.3.5 抗衰老、抗癌作用

具有抗膽固醇功能，能明顯減少腸管對(duì)膽固醇的吸收，同時(shí)促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懰猁}，從而加快其排出體外，對(duì)延緩機(jī)體衰老有積極作用。嗜酸乳桿菌能夠增加腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量及生命力，并且具有一定的抗癌作用；嗜酸乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌共同培養(yǎng)，其抗癌活性顯著增強(qiáng)，癌細(xì)胞的增殖顯著降低[12]。

2 新型檢測(cè)技術(shù)

目前，乳酸菌鑒定大多仍沿用傳統(tǒng)方法，但是傳統(tǒng)分析法存在一定缺陷：步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)工，并且對(duì)于選擇性培養(yǎng)基的質(zhì)量要求嚴(yán)格，靈敏度低。受操作者經(jīng)驗(yàn)影響較大，難以滿足市場(chǎng)精確鑒定和定量的要求。

2.1 免疫學(xué)技術(shù)

胡陸軍[13]利用ELAA(酶聯(lián)適配體測(cè)定)方法，針對(duì)短雙歧桿菌，線性關(guān)系為y=0.0588x+0.3423(R2=0.984)，檢測(cè)范圍為103～107CFU/mL，檢測(cè)限可以達(dá)到103CFU/mL。針對(duì)兩歧雙歧桿菌，線性關(guān)系為y=0.07663x+0.1471(R2=0.983)，檢測(cè)范圍為104～107CFU/mL，檢測(cè)限為104CFU/mL。

袁耀武等[14]通過(guò)動(dòng)物免疫方法制備了鼠抗長(zhǎng)雙歧(B.longum)和兩歧雙歧桿菌(B.bifidum)的免疫血清及兔抗長(zhǎng)雙歧和兩歧雙歧桿菌的免疫血清，經(jīng)雙夾心ELISA法對(duì)雙歧桿菌發(fā)酵乳制品中雙歧桿菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)最低濃度可達(dá)107CFU/mL，僅耗時(shí)8 h。

2.2 qPCR技術(shù)

發(fā)酵乳制品中副干酪乳桿菌先經(jīng)PMA處理后，采用沸水浴的方法提取副干酪乳桿菌基因組，然后通過(guò)qPCR方法檢測(cè)發(fā)酵乳制品中的活菌[15]。結(jié)果副干酪乳桿菌經(jīng)90 ℃處理6 min，即為膜損傷菌；PMA能夠抑制107CFU/mL死菌DNA的擴(kuò)增，而不影響活菌DNA的擴(kuò)增；PMA-qPCR能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到樣品中的活菌。

2.3 基因組學(xué)分析法

李柏良等[16]基于Illumina Hiseq 2500與Pacbio RSII測(cè)序平臺(tái)對(duì)嗜熱鏈球菌KLDS SM進(jìn)行全基因組測(cè)序并繪制基因組圖譜，結(jié)果表明:菌株KLDS SM的基因組由一個(gè)1856787 bp環(huán)狀染色體組成，GC含量為39.08%，含有1732個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因；菌株KLDS SM具有完整的蛋白水解系統(tǒng)和8種氨基酸的合成能力；15株嗜熱鏈球菌在氨基酸合成方面相對(duì)保守，僅在組氨酸合成途徑方面存在較大的差異。

趙潔[17]采用Illumina Hiseq高通量測(cè)序平臺(tái)完成了185株分離自國(guó)內(nèi)外自然發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌的全基因組重測(cè)序，引入全基因組關(guān)聯(lián)分析完成了嗜熱鏈球菌的功能基因組學(xué)研究，建立了嗜熱鏈球菌的核心基因集和泛基因集，結(jié)果揭示了高突變率主要發(fā)生在嗜熱鏈球菌基因組的假基因區(qū)和基因間區(qū)，并通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析挖掘出與嗜熱鏈球菌表型特征相關(guān)的功能基因。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

陳臣等[18]利用SMM系統(tǒng)篩選植物乳桿菌種特異序列，根據(jù)特異序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，檢測(cè)限為2.26×102CFU/mL。該方法快速靈敏,可以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。

肖其勝等[19]根據(jù)雙歧桿菌屬16S rRNA基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了食品中雙歧桿菌屬的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR檢測(cè)方法。DNA檢測(cè)絕對(duì)靈敏度可達(dá)到2 pg，相對(duì)靈敏度可達(dá)到104CFU/mL。重復(fù)性測(cè)試表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%。

張娜娜等[20]根據(jù)嗜酸乳桿菌NCFM的SPIDR保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物與探針，靈敏度達(dá)到3 pg,相對(duì)靈敏度達(dá)到103CFU/mL；重復(fù)性檢測(cè)表明標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.6%以下。標(biāo)記嗜酸乳桿菌的樣品全部檢測(cè)出嗜酸乳桿菌且含量在5.83×102～3.68×104CFU/mL。

包秋華等[21]根據(jù)乳酸菌的16S rDNA基因序列設(shè)計(jì)嗜酸乳桿菌種特異性引物，應(yīng)用種特異性PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳圖譜和實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜分析，建立快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)發(fā)酵乳中的定量和定性方法。

2.5 磁珠捕獲法

Mullane N R等[22]使用陽(yáng)離子磁珠捕獲法檢測(cè)嬰幼兒配方粉(infant formula milk，IFM)中的阪崎腸桿菌：均質(zhì)1 min，BPW增菌6 h，陽(yáng)離子捕獲，然后培養(yǎng)，如此可在較短時(shí)間內(nèi)可靠檢測(cè)IMF中1～5 CFU/500 g的阪崎腸桿菌。

2.6 LAMP技術(shù)

胡連霞等[23]采用改良環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測(cè)PIF中的阪崎腸桿菌。以阪崎腸桿菌新屬菌種(ATCC29544)的16S～23S rDNA間區(qū)序列作為靶序列，設(shè)計(jì)內(nèi)外引物和環(huán)引物，通過(guò)肉眼觀察白色沉淀，判斷檢測(cè)結(jié)果。LAMP檢測(cè)阪崎腸桿菌的靈敏度為0.10 CFU/mL，人工污染阪崎腸桿菌的IFM的檢出限為1.1 CFU/g。

2.7 DHPLC技術(shù)

楊春華等[24]應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)建立食品中阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)方法，根據(jù)阪崎腸桿菌16S～23S rDNA特異基因序列的特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)。檢測(cè)低限可達(dá)到25 CFU，且具有很好的特異性。

2.8 PCR-DGGE技術(shù)

王營(yíng)等[25]應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)，并結(jié)合種特異性PCR技術(shù)檢測(cè)酸奶中的乳酸菌組成。優(yōu)化DGGE檢測(cè)相關(guān)條件，結(jié)果表明最佳DGGE條件為:凝膠變性梯度范圍30%～60%，電泳時(shí)間300 min。利用上述條件能有效區(qū)分植物乳桿菌、乳雙歧桿菌,但是無(wú)法區(qū)分保加利亞乳桿菌與嗜酸乳桿菌，嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌與干酪乳桿菌;在此結(jié)果基礎(chǔ)上，再采用種特異性PCR技術(shù)，能夠有效區(qū)分上述存在共遷移現(xiàn)象的菌株。

2.9 T-RFLP技術(shù)

張思璐等[26]采用源于16S～23S rRNA基因間隔區(qū)序列的乳酸桿菌屬特異性引物L(fēng)AB-rev，乳酸桿菌的屬特異性引物，6-FAM熒光標(biāo)記后結(jié)合16S上游通用引物7f用于乳酸桿菌的PCR擴(kuò)增。選取HaeⅢ和HhaⅠ進(jìn)行限制性酶切，最后對(duì)酶切后的產(chǎn)物末端測(cè)序得到T-RFLP峰譜圖，成功搭建T-RFLP技術(shù)用于微生態(tài)環(huán)境中乳酸桿菌檢測(cè)的平臺(tái)。

2.10 MLST方法

劉文俊[27]應(yīng)用傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵方法對(duì)43株嗜熱鏈球菌和39株保加利亞乳桿菌進(jìn)行了酸奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌與發(fā)酵、產(chǎn)酸和風(fēng)味形成特性相關(guān)的功能基因多位點(diǎn)序列分型(MLST)方法，進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育和遺傳進(jìn)化研究。結(jié)果表明：43株嗜熱鏈球菌的發(fā)酵時(shí)間在4.5～24.5 h，19株菌發(fā)酵時(shí)間小于10 h，其中10株菌的產(chǎn)酸速率在10° T/h以上。39株保加利亞乳桿菌的發(fā)酵時(shí)間在8.5～24.5 h，23株菌的發(fā)酵時(shí)間小于15 h，其中有14株菌的產(chǎn)酸速率在3° T/h以上。

2.11 流式細(xì)胞技術(shù)

程志才等[28]添加熒光標(biāo)記QEPV的M17培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜熱鏈球菌，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)QEPV能否被嗜熱鏈球菌吸收。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，F(xiàn)AM-QEPV與FITC-QEPV能夠穿過(guò)嗜熱鏈球菌細(xì)胞膜，推測(cè)QEPV能夠被嗜熱鏈球菌吸收、利用。并且0.5 mg/mL的QEPV能有效促進(jìn)嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)繁殖，提高嗜熱鏈球菌的發(fā)酵能力。

2.12 色差分析法

王佳等[29]借助細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)儀對(duì)加入指示劑后的樣品顏色(RGB)變化進(jìn)行檢測(cè)，建立了色差值b值與嗜熱鏈球菌數(shù)目之間的標(biāo)準(zhǔn)方程，相關(guān)系數(shù)可達(dá)到0.9820。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確度分析，與國(guó)標(biāo)計(jì)數(shù)法檢測(cè)結(jié)果差異不顯著。

3 總結(jié)

作為益生菌中重要的有益菌，在食品工業(yè)日益發(fā)達(dá)的今天，如何更好地將益生菌應(yīng)用于食品工業(yè)中，使人們對(duì)益生菌中乳酸菌有更加清晰的認(rèn)識(shí)，這是每一位科研工作者值得深思的問(wèn)題。大量的研究已證實(shí)益生菌的重要性和功能性，然而它們最大的缺點(diǎn)是活菌期時(shí)間短。在今后的研究方向中，利用分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程等手段進(jìn)行基因改造，培育出功能強(qiáng)大、能長(zhǎng)久定居腸道的益生菌，保持益生菌穩(wěn)定，并使益生菌達(dá)到足夠量從而充分發(fā)揮其益生作用是技術(shù)核心問(wèn)題。提高乳酸菌菌體的生理功能穩(wěn)定性，減少發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的不穩(wěn)定性，使益生菌長(zhǎng)期保存也是熱門研究方向。相信隨著研究的深入，益生菌能夠在未來(lái)給人類的健康和社會(huì)的發(fā)展帶來(lái)更大益處，具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。