畢菲菲,韓貞艷,郝振凱,于詠蘭,索 勛,劉賢勇

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193)

1 雞球蟲及雞球蟲病

艾美耳屬(Eimeria)球蟲隸屬頂復(fù)門、真球蟲目、艾美耳科[1]，廣泛寄生于雞、兔、鴨和鵝等動(dòng)物的腸道或肝臟、腎臟等部位[2]。寄生于雞腸道內(nèi)的艾美耳球蟲有7個(gè)種，分別是柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、堆型艾美耳球蟲 (E.acervulina)、毒害艾美耳球蟲 (E.necartrix)、巨型艾美耳球蟲 (E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)和早熟艾美耳球蟲(E.precox)[3]。雞球蟲病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害極大。據(jù)報(bào)道,全世界每年用于抗球蟲藥的費(fèi)用及因球蟲病暴發(fā)造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)24億美元[4]。

2 球蟲抗藥性

自20世紀(jì)40年代以來，多種藥物被嘗試用于防治雞球蟲病。而自1945年開始，美國學(xué)者就從田間分離到了對(duì)磺胺類藥物具有抗藥性的蟲株[5-6]；到了20世紀(jì)60年代，則相繼發(fā)現(xiàn)針對(duì)不同藥物的不同抗藥株[7]?？追爆幍萚8]1994年首次報(bào)道我國12個(gè)地區(qū)都普遍存在柔嫩艾美耳球蟲抗藥株之后，全國各地相繼報(bào)道出現(xiàn)抗藥蟲株。迄今為止，幾乎所有的抗球蟲藥均有抗藥蟲株出現(xiàn)，且抗藥蟲株表現(xiàn)出對(duì)與該藥同類或作用機(jī)理相同的其他藥物一定程度的交叉抗藥性[9]。

寄生蟲抗藥性一般被認(rèn)為是藥物控制寄生蟲的失敗，但抗藥性的廣義定義是對(duì)藥物敏感性的轉(zhuǎn)變[10]。針對(duì)所有生物而言，抗藥性是“在使其他細(xì)胞毀滅或抑制的藥物作用環(huán)境下，一個(gè)細(xì)胞及其后代仍然能暫時(shí)或長期生存或繁殖的能力”[11]。球蟲學(xué)家Chapman博士則認(rèn)為抗藥性是對(duì)存在于球蟲群體中突變體定向選擇的結(jié)果[12]，這為我們進(jìn)行抗藥性機(jī)制研究提供了很好的思路。

3 抗藥性的檢測方法

3.1 雞體試驗(yàn)法 目前檢測雞球蟲抗藥性常用的方法是雞體試驗(yàn)法，此方法是將供試藥物按一定濃度飼喂雞只，經(jīng)一定時(shí)間后接種雞球蟲孢子化卵囊，然后通過不同的抗藥性檢測指標(biāo)單獨(dú)或聯(lián)合來判定球蟲的抗藥性，常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)有如下幾個(gè)。

3.1.1 相對(duì)卵囊產(chǎn)量(Relative oocyst production, ROP) 按照藥品說明書配置藥物并用于相應(yīng)的組別。投藥48 h后，每只雞經(jīng)口接種1×104～1×105個(gè)孢子化卵囊并收集感染后96～168 h的糞便。使用改良麥克馬斯特計(jì)數(shù)板計(jì)算樣品中的總卵囊量。計(jì)算公式：ROP=(感染給藥組平均卵囊產(chǎn)量÷感染不給藥組)×100%。

3.1.2 病變記分減少率(Reduction of lesion scores, RLS) 球蟲感染后第6天或第7天撲殺試驗(yàn)雞，按Johnson[13]等所述方法進(jìn)行病變記分。計(jì)算公式：RLS =(感染不用藥對(duì)照組平均病變記分-感染用藥組平均病變記分)/感染不用藥對(duì)照組平均病變記分×100%。

Mcdougald L[14]等以感染用藥組與感染不用藥組的病變記分計(jì)算出用藥組病變記分減少率，用其判定球蟲對(duì)藥物的抗藥性或敏感性。Jeffers[15]以感染用藥組的平均盲腸病變記分大于或等于感染不用藥對(duì)照組的50%作為對(duì)莫能霉素抗藥性的標(biāo)準(zhǔn)，檢測了美國73個(gè)雞場柔嫩艾美耳球蟲分離株對(duì)1×10-4g/kg莫能霉素的敏感性，結(jié)果證明均無抗藥性。

3.1.3 最適抗球蟲活性(Optimum anticoccidial activity, POAA) 評(píng)價(jià)抗球蟲藥物效果最有用的標(biāo)準(zhǔn)是感染急性期的體重增加。從接種當(dāng)天到第5天或第6天或在最大生長抑制期間測量體重的增加。計(jì)算公式：最適抗球蟲活性POAA=(感染用藥組增重-感染不用藥組增重/不感染不用藥組增重-感染不用藥組增重)×100%。

Mcdougald L[14]等比較了接種后第6天試驗(yàn)期內(nèi)感染用藥和感染不用藥對(duì)照組的增重，結(jié)果顯示，感染用藥組與不感染不用藥對(duì)照組、感染不用藥對(duì)照組增重的差異較顯著。

3.1.4 綜合判定 以POAA≤50%判為+，>50%為-；RLS<50%判為+，RLS≥50%為-；ROP≥15%判為+，ROP<15%為-。

判斷標(biāo)準(zhǔn)為 ---為敏感，--+為輕度抗藥，-++為中度抗藥，+++為嚴(yán)重抗藥。

用上述指標(biāo)，劉穎[16]等初步確定了柳州市區(qū)域性雞球蟲的抗藥性；姚惠娟[17]等發(fā)現(xiàn)野外混合球蟲對(duì)地克株利、馬杜拉霉素、氯羥吡啶、鹽霉素4種抗球蟲藥完全抗藥；謝婷[18]等發(fā)現(xiàn)河池市分離的雞球蟲對(duì)磺胺喹噁啉鈉中度抗藥，對(duì)地克珠利和鹽酸氯苯胍完全抗藥。

3.2 同工酶分析測定法 同工酶分析法是根據(jù)敏感蟲株與抗藥蟲株同工酶譜的不同，先確定某種藥物的抗藥蟲株特異性同工酶譜，再將田間分離的蟲株進(jìn)行同工酶分析，比較分離株和抗藥株的酶譜， 根據(jù)二者差異是否顯著而判斷是否產(chǎn)生了抗藥性[19]。國外學(xué)者利用葡萄糖磷酸變位酶(PGM )作為遺傳標(biāo)記分析了巨型艾美耳球蟲中苯甲氧喹啉抗藥性因子的轉(zhuǎn)移情況[20]。

3.3 超微結(jié)構(gòu)比較法 具有抗藥性的蟲株，其超微結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，以避開藥物作用的位點(diǎn)。比如，莫能菌素在離體條件可顯著影響球蟲敏感蟲株的超微結(jié)構(gòu)，致其裂殖子膨脹、細(xì)胞漿空泡化、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模糊、破損和細(xì)胞整體形態(tài)發(fā)生改變[21-22]。

3.4 RAPD測定法 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random amplified polymorphic DNA, RAPD)是一種以PCR為基礎(chǔ)的基因分析方法。該方法用單一或多個(gè)隨機(jī)核苷酸序列作為引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，避免了PCR特異性引物設(shè)計(jì)上的困難，尤其在對(duì)未知樣本的鑒定方面，顯示了其獨(dú)特的特點(diǎn)[23]。

4 展望

目前雞球蟲的抗藥性檢測方法仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，用來檢測球蟲抗藥性的方法各存在優(yōu)缺點(diǎn)。隨著各位學(xué)者研究的不斷深入，在常用方法的基礎(chǔ)上，發(fā)展出了更多的檢測雞球蟲抗藥性的方法，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，如RAPD 技術(shù)、RT-PCR法是較為精準(zhǔn)的檢測方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。

隨著生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，同時(shí)對(duì)球蟲生物學(xué)特性、代謝機(jī)制和耐藥機(jī)制的解析，有目的地開發(fā)高效、低毒、廣譜的抗球蟲新藥，以及提取中草藥有效成分，研制安全、有效的基因工程苗和核酸疫苗，更好地了解艾美耳球蟲的動(dòng)物流行病學(xué)，藥物的作用方式和對(duì)它們的抗性機(jī)制以及免疫機(jī)制，將有助于改進(jìn)控制雞球蟲病的方法。