陳 鋒，吳鄒平，郭菁菁，呂婧薇，鄭宇彬，楊為祝，王思宇，李長征

(福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，福建福州350122)

鑄型透明標本是往血管內注入某種物質，待硬化后將組織用物理和化學的方法使軟組織和透明劑的折光率相近，達到軟組織透明，使骨骼和鑄型枝被顯現(xiàn)[1]。此技術的運用可以為兩棲類動物血液循環(huán)的標本制作提供直觀的全身血管形態(tài)學結構，對兩棲類動物血液循環(huán)研究提供新的模型；對了解牛蛙全身血管和骨骼器官的分布情況，改進醫(yī)學動物試驗方法具有促進作用；在動物標本制作方面為鼠、蛇和魚等其他小型動物鑄型透明標本的制作提供新的思路；在標本應用方面為科研人員對于動物學的器官、骨骼和血管研究、比較解剖學的研究提供直觀的形態(tài)學依據(jù)。目前關于骨骼透明血管鑄型已有報道，但是基本多見于某個器官，小型動物全身標本制作較少，難度較高[2-4]。本方法使用不同的透明方式，調整了填充劑濃度，提高了成功率，制作出的標本效果良好，報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 來自福建地區(qū)健康成年的牛蛙10只，體重(0.25±0.05)kg，不分雌雄。15%過氯乙烯填充劑、無水乙醇、10%甲醛、尿素透明液(尿素240 g、10%甘油1 000 mL、Triton X-100 10 mL)、茜素紅、過氧化氫溶液、任氏液、20 mL塑料注射器、玻璃插管、止血鉗、持針器、鑷子、組織剪、燒杯、玻璃棒、量筒、玻璃缸若干等。

1.2 試驗方法 用鑷子夾取一浸透無水酒精的棉球,塞入牛蛙口腔中,待牛蛙全身肌肉松弛，眼瞼角膜反射消失；打開胸腹腔，剪開下腔靜脈放血，再打開心包，暴露心臟，剪開心室，在動脈干分叉處前插管結扎，然后用任氏液進行沖洗殘余血液與凝塊；將注射器上端連接在玻璃插管上，用力抽取直至不能抽動為止，然后用止血鉗夾住橡膠插管，以防空氣進入管道里面；向其注入配制好的15%過氯乙烯填充劑，見四肢末端有填充劑則停止灌注，每隔1～2 h補注1次，1～3次即可。

去除牛蛙皮膚，將其放入配好的10%甲醛固定(標本體積5～10倍)，固定1周左右；固定后的標本用流水沖洗5 h,過氧化氫漂白6～12 h(中途需更換)，清水沖洗6 h去除殘余過氧化氫，將標本依次浸泡在配置好的80%、90%、100%酒精溶液中脫水各1周左右。

標本放入尿素透明液中，半個月左右，見肌肉呈半透明狀態(tài)，骨骼隱約可見，即停止初步透明；預透明結束后，將標本浸入0.01%茜素紅染液中2～3 d，見骨骼染上紫紅色為止；用水洗去表面浮色，將標本浸入50%甘油溶液中，直到肌肉顏色褪為淡紅色為止，之后分別放入60%、70%、80%、90%甘油中各1周，待充分透明后浸入純甘油中保存。

2 結果

制作出的牛蛙標本肌肉和軟組織呈淡黃色膠凍狀，全身血管清晰可見，骨骼完整且呈玫瑰紅色。所顯示的牛蛙頭骨、四肢骨和脊柱骨顏色清晰均勻，易于識別(見中插彩版圖1)；牛蛙頭部、脊柱區(qū)肩胛骨和四肢骨的血管(見中插彩版圖1和2)以及腹腔內胃、腸的血管(見中插彩版圖3)清晰可見；從整體上能充分顯現(xiàn)骨骼系統(tǒng)和脈管系統(tǒng)在體內的自然分布情況及毗鄰關系。

3 討論

試驗的注意事項：首先，本試驗中所選的牛蛙需滿足發(fā)育成熟、大小適中，太小不利于血管鑄型，太大不利于后期骨骼染色透明；其次，試驗過程中，牛蛙在失去生命體征后半個小時內進行灌注最佳，若放置時間過長，易凝血，導致細小血管堵塞，影響灌注及透明效果；再次，灌注前需充分排血，用任氏液進行沖洗，可以保證蛙心的持續(xù)跳動；從次，血管灌注過程中，用力要均勻緩慢，若力度過大，管道內壓力過大，易導致主動脈弓破裂使灌注失敗，因此需仔細感受壓力并時刻觀察牛蛙四肢及背部細小血管的灌注程度；最后，透明過程中需時刻保持警惕，否則將導致整個試驗失敗，如漂白時要注意觀察標本的漂白程度，見肌肉上顏色基本脫掉即可，太過容易使細小鑄型枝褪色，肌肉間產生大量氣泡等問題。

試驗的改進創(chuàng)新：在透明劑的選擇上 以往的研究多選擇二甲苯和氫氧化鉀為透明劑，其中二甲苯透明效果顯著，但存在使組織收縮、變脆和硬化，影響透明效果等問題[5]，且二甲苯是一種強致癌物，對試驗者生命健康有潛在的威脅，氣體揮發(fā)到空氣中會對周圍環(huán)境造成污染；氫氧化鉀雖無毒無害，但在透明的時間和濃度上很難把握，很容易造成標本的損壞且透明效果不穩(wěn)定；本試驗選擇無毒并具有一定溶解蛋白質作用的尿素和細胞破膜劑Triton X-100[6]，兩者對組織的作用使甘油更易滲透，從而提高組織的透明度，透明后的組織呈膠凍狀，標本形態(tài)完整，利于保存，且透明效果穩(wěn)定可靠，能極大提高透明標本的成功率。

在填充劑濃度的選擇上,選擇過氯乙烯溶劑作為填充劑，其原理為溶劑揮發(fā)后凝固成型，此類填充劑收縮率大,流動性好,適合灌注流程較長的微細血管。以往的研究多集中于哺乳動物的血管灌注，多采用20%～25%過氯乙烯填充劑，以充分保證鑄型枝的飽滿。而牛蛙血管微細，其管徑、彈性和厚度都不如哺乳動物。因此，填充劑的濃度應小于20%，經試驗發(fā)現(xiàn)，選用濃度為15%過氯乙烯填充劑最為適宜。在該濃度下，灌注不會因管內壓力過大而導致填充劑無法到達末端血管；也不會因填充劑濃度過低，揮發(fā)性過高，鑄型支無法完好顯現(xiàn)。

在試驗對象的選擇上 由于哺乳動物的體型相對較大，血管較粗、彈性較好、易于灌注，所以傳統(tǒng)上制作鑄型標本時多采用哺乳動物作試驗對象，然而全身血管鑄型及骨骼透明標本制作的報道僅見于胎兒，因哺乳動物胎兒期標本的不易獲取，使其成為此類標本制作鮮有報道的一個關鍵原因。而本次研究另辟蹊徑，選擇材料易找，難度大、技術要求高、成功率低的兩棲類動物-牛蛙作為對象，因其在全國各地的醫(yī)學院和動物科學院的動物試驗中應用廣泛，有廣闊的市場應用前景。

牛蛙全身動脈血管鑄型透明標本的意義：(1)教學和科研方面 牛蛙作為兩棲恒溫動物，與人體在一定程度上有所相似，因而在眾多生物試驗上被選作試驗對象，然而在教學過程中，學生僅通過課堂講解和教學視頻來熟悉操作流程且無法直觀的了解牛蛙的解剖學構造及重要臟器,在試驗過程中的盲目操作，導致判斷不出相應的解剖部位，極易傷及血管，致使試驗失敗，從而達不到試驗預期效果。目前已有的教學實驗標本-浸制標本、骨骼標本和剝制標本等都存在著一定的不足，它們不但破壞了牛蛙的外形，而且不能很好的展示牛蛙血管和骨骼的位置關系。利用牛蛙全身動脈血管鑄型透明標本，可以多維度的觀察血管的形態(tài)、走行以及血管與周圍肌肉、骨骼和器官的關系。在教學過程中，可以通過對標本的觀察，讓學生有直觀立體的感性認識，加深對牛蛙內部器官結構的印象，提高教學試驗的成功率，減少試驗的耗材。通過該標本的制作也可以為科研人員對于動物學的器官、骨骼和血管研究、比較解剖學的研究、兩棲動物生理、生態(tài)的研究提供直觀的形態(tài)學依據(jù)。(2)養(yǎng)殖方面 隨著牛蛙養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，各種疾病問題相繼出現(xiàn)，對牛蛙養(yǎng)殖技術中疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提出了更高的要求。牛蛙全身血管鑄型透明標本在牛蛙解剖的診斷治療中發(fā)揮了重要的指導作用。