張 雯， 王學(xué)川， 強(qiáng)濤濤， 李曦月， 高 暢

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

組織工程作為一門研究和開發(fā)具有修復(fù)和改善損傷組織功能生物替代物的新興科學(xué)，在組織修復(fù)、器官修復(fù)重建方面發(fā)揮著舉足輕重的作用.該技術(shù)目前在骨組織工程、人造血管、人造皮膚等領(lǐng)域備受關(guān)注.其中作為體外細(xì)胞培養(yǎng)載體的新型支架材料也成為了研究熱點(diǎn).目前主要的支架形式有水凝膠[1]、纖維[2]和多孔結(jié)構(gòu)[3]3種.其中，多孔微球作為一種重要的新型材料，具有密度低、比表面積大、穩(wěn)定性好和表面滲透能力強(qiáng)等特點(diǎn)[4].與傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)方法相比，能更好地模擬復(fù)雜的生理環(huán)境，便于懸浮培養(yǎng)和提高細(xì)胞的表達(dá)水平[5]，因此是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種組織工程支架，并且已經(jīng)應(yīng)用于細(xì)胞的大量培養(yǎng)中[6,7].

膠原蛋白(Collagen,COL)是細(xì)胞外基質(zhì)和連接組織(包括韌帶、腱、軟骨、骨、角膜和皮膚等)的主要成分，一般呈網(wǎng)絡(luò)狀或纖維狀，提供物理支撐以維持細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)完整性[8].膠原蛋白基復(fù)合材料由于其優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，在組織工程支架、傷口敷料、人造血管、人造皮膚等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用.在實(shí)際應(yīng)用過程中，可通過交聯(lián)、混入其它天然和合成高分子或功能無機(jī)物等方法制備復(fù)合材料，以增強(qiáng)其力學(xué)強(qiáng)度，提高熱性能以及生物穩(wěn)定性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)更多的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控[8].細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose,BC)是指由生長(zhǎng)在液態(tài)含糖基質(zhì)中的細(xì)菌產(chǎn)生，并分泌到基質(zhì)中的纖維素，是由葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的高分子聚合物.BC具有高結(jié)晶度、高持水性、三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、高抗張強(qiáng)度和彈性模量等特性[9]，同時(shí)還具有良好的生物相容性[10,11]和可降解性[12,13]，目前已成為國(guó)際上新型組織工程材料的研究熱點(diǎn).

基于組織工程技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的巨大應(yīng)用前景，以及COL-BC基多孔微球作為組織支架所具有的優(yōu)勢(shì)，本研究以COL和BC為基體，進(jìn)行COL、BC的復(fù)合，制備BC/COL多孔微球，并對(duì)其性能進(jìn)行研究，為其應(yīng)用于組織工程支架奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1菌種

木醋桿菌(AcetobacterXylinum)，陜西科技大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室提供.

1.1.2培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基：蔗糖6%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，無水乙醇1.0%.

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖6%，牛肉膏1.5%，Na2HPO40.44%，檸檬酸0.08%，瓊脂1.8%，無水乙醇1.0%.

其余試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑.

1.2 儀器設(shè)備

S-4800電鏡掃描儀,日本日立公司；D/max2200PC全自動(dòng)X-射線衍射儀，日本Rigalcu；VERTEX70傅立葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Brucher公司；STA449F3-1053-M熱重分析儀，德國(guó)耐馳儀器制造有限公司；馬爾文MS2000激光粒度儀，英國(guó)Mastersizer；MG250B恒溫培養(yǎng)箱、HYG-1A恒溫振蕩器，上海新瑞儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1BSA含量測(cè)定

分光光度法.

1.3.2FIIR檢測(cè)

將BC膜、COL膜和BC/COL復(fù)合膜，在VERTEX70傅立葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行測(cè)定.波數(shù)范圍：600～4000cm-1，波數(shù)精度：0.01cm-1，分辨率：優(yōu)于0.09cm-1.

1.3.3XRD測(cè)定

采用D/max2200PC X 射線衍射儀分析BC膜、COL膜和BC/COL復(fù)合膜結(jié)晶結(jié)構(gòu)，工作電壓40kV，電流20mA，λ=0.154nm，Cu靶，Ni過濾片，掃描速度8°/min，掃描范圍5°到60°，步長(zhǎng)0.02°.

1.3.4SEM測(cè)定

將干燥BC膜、COL膜和BC/COL復(fù)合膜進(jìn)行噴金處理，用S-4800型掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照.

1.3.5熱穩(wěn)定性(TG-DSC)分析

采用STA449F3型的熱分析儀分析BC膜、COL膜和BC/COL復(fù)合膜熱穩(wěn)定性，測(cè)試條件溫度范圍0～800℃，升降溫速率10℃/min，稱量范圍5～10mg(小樣品坩堝)，氮?dú)鈿夥?

1.4 BC發(fā)酵

利用AcetobacterXylinum發(fā)酵制備BC，分別進(jìn)行斜面培養(yǎng)(30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d)、種子液制備(30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1d，培養(yǎng)液置于30℃，160r/min搖床震蕩30min釋放菌體細(xì)胞)、發(fā)酵培養(yǎng)(裝液量30mL/250mL三角瓶，接種量20%，30℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)).發(fā)酵結(jié)束后取BC膜用去離子反復(fù)沖洗，直到pH為7.0，冷凍干燥[13].

1.5 BC/COL復(fù)合膜的制備

1.5.1DABC的制備

稱取1g BC懸浮于250mL去離子水中，高速勻漿機(jī)勻漿后轉(zhuǎn)移至500mL圓底燒瓶中，加入0.5g高碘酸鈉，錫箔紙包裹，50℃下氧化10h.反應(yīng)結(jié)束后抽濾，沉淀中加入50mL0.1mol/ L 乙二醇溶液繼續(xù)反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，去離子水洗滌沉淀物5次，收集沉淀，冷凍干燥得DABC[1].

1.5.2CDABC的制備

稱取1.5g膠原蛋白分散于180mL去離子水中，45℃水浴緩慢攪拌至體系均勻得COL凝膠液，繼續(xù)水浴1h.取0.5g DABC分散于180mL去離子水中，45℃水浴1h.COL凝膠液與DABC分散液混合，玻璃棒緩慢攪拌20min.混合凝膠室溫下抽濾，45℃熱水反復(fù)洗滌沉淀物去除未反應(yīng)COL，冷凍干燥得CDABC復(fù)合材料.

1.6 BC/COL多孔微球制備

稱取一定質(zhì)量CDABC，90℃下溶解于5g離子液中，得CDABC/IL溶液.按一定比例混合IL相(CDABC/IL溶液)與有機(jī)相(十六烷)，加入復(fù)合表面活性劑(司盤∶吐溫=1∶1)，一定溫度下攪拌乳化形成乳液.在乳液中加入正丁醇50mL，攪拌3h后靜置2h，待沉淀完全，抽濾收集微球沉淀.依次采用50mL正丁醇，50mL丙酮，50mL蒸餾水洗滌微球，冷凍干燥得BC/COL多孔微球.在實(shí)驗(yàn)過程中，考察CDABC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%、6%、7%，十六烷∶(CDABC/IL)分別為4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，乳化時(shí)間分別為1h、2h、3h、4h、5h，乳化溫度分別為25℃、35℃、45℃、55℃、65℃等時(shí)對(duì)BC/COL多孔微球載藥性能的影響.根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn).

1.7 BC/COL多孔微球的性能

利用FTIR、XRD、SEM、TG-DSC檢測(cè)技術(shù)分別對(duì)BC、DABC、CDABC和BC/COL多孔微球進(jìn)行現(xiàn)代分析儀器檢測(cè)，研究其材料學(xué)特性.

2 結(jié)果與討論

2.1 BC/COL多孔微球制備工藝

2.1.1BC/COL多孔微球制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

BC/COL多孔微球制備工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1～8所示.圖1及圖2所示為CDABC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BC/COL多孔微球制備的影響.由圖1可以看出，隨著CDABC質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，BC/COL多孔微球載藥率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)CDABC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)，BC/COL多孔微球載藥率最高.

由圖2粒徑分析可知，CDABC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時(shí)所制備的BC/COL多孔微球粒徑最接近正態(tài)分布，說明此條件下所制備多孔微球形態(tài)規(guī)整，分布均勻.質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低或過高時(shí)，易導(dǎo)致所制備多孔微球球體不完整，或內(nèi)部結(jié)構(gòu)過于致密，影響其載藥性能.

圖1 CDABC質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)BC/COL多孔微球制備的影響

圖2 不同CDABC質(zhì)量制備BC/COL多孔微球粒徑分析

圖3及圖4所示為乳化時(shí)間及乳化溫度對(duì)BC/COL多孔微球制備的影響.微球制備過程中，CDABC/IL溶液以液滴的形式分散于十六烷相，該穩(wěn)定W/O乳液的形成對(duì)微球的制備起決定性作用.乳化過程中，乳化時(shí)間和乳化溫度對(duì)乳液穩(wěn)定性均有影響.由圖3及圖4可知，乳化時(shí)間小于4h，乳化溫度高于35℃均不利于穩(wěn)定乳液的形成，繼而影響微球載藥性能.圖5及圖6所示，微球粒徑分布也表明在此較優(yōu)工藝下所制備的BC/COL多孔微球粒徑均勻，呈正態(tài)分布，與載藥效果一致.

圖3 乳化時(shí)間對(duì)BC/COL多孔微球制備的影響

圖4 乳化溫度對(duì)BC/COL多孔微球制備的影響

圖5 不同乳化時(shí)間制備BC/COL多孔微球粒徑分析

圖6 不同乳化溫度制備BC/COL多孔微球粒徑分析

圖7、圖8所示為十六烷/(CDABC/IL)比例對(duì)BC/COL多孔微球制備的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，十六烷∶(CDABC/IL)為10∶1時(shí)，BC/COL多孔微球載藥率較高，微球粒徑分布效果較好，說明此工藝下所形成的W/O乳液穩(wěn)定性較好，所制備微球性能良好.

圖7 十六烷∶(CDABC/IL)對(duì)BC/COL多孔微球制備的影響

圖8 不同十六烷∶(CDABC/IL)比例制備BC/COL多孔微球粒徑分析

2.1.2BC/COL多孔微球制備工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，如表1所示.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)BC/COL多孔微球制備影響顯著性依次為CDABC質(zhì)量分?jǐn)?shù)>十六烷∶(CDABC/IL)>乳化溫度>乳化時(shí)間.最優(yōu)工藝為A2B3C2D2，即乳化溫度35 ℃，乳化時(shí)間5 h，十六烷∶(CDABC/IL)=10∶1，CDABC質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%.在此工藝下制備BC/COL多孔微球，其載藥率為254 mg/g.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2 BC/COL多孔微球的性能

2.2.1 紅外光譜分析(FT-IR)

圖9所示為BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球紅外圖譜.BC[14]的紅外圖譜中3 354 cm-1處為O-H 的伸縮振動(dòng)吸收峰，說明分子中含有大量的-OH；2 885 cm-1附近為C-H伸縮振動(dòng)吸收峰；1 419 cm-1、1 311 cm-1附近為C-H彎曲振動(dòng)特征峰；1 103 cm-1、1 055 cm-1以及 1 031 cm-1處為醇中的 C-O 的伸縮振動(dòng)特征峰[13].圖譜所示BC可能存在的有機(jī)化合物基團(tuán)有：-OH、-CH2、C-H、C-O等，與標(biāo)準(zhǔn)BC的結(jié)構(gòu)相符合.COL的紅外圖譜中[15]，1 659 cm-1為酰胺I的吸收峰，1 552 cm-1為酰胺II吸收峰，1 240 cm-1為酰胺Ⅲ吸收峰，譜帶酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ譜帶為膠原蛋白的特征吸收峰，這表明COL三股螺旋結(jié)構(gòu)的存在.DABC的紅外圖譜中，2 721 cm-1是醛基C-H鍵的吸收峰，1 728 cm-1是C=O鍵的特征吸收峰，表明BC中部分-OH被氧化成了醛基.CDABC紅外圖譜中，3 348 cm-1處的吸收峰反映了分子間氫鍵引起的-CHO基的伸縮振動(dòng)， 1 690～1 590 cm-1之間的吸收峰是由-C=N-的振動(dòng)引起的，1 541 cm-1為-NH的變形振動(dòng)，1 300～1 000cm-1之間的吸收峰是由醚的伸縮振動(dòng)引起的，670cm-1為N-H面外彎曲振動(dòng)，證明了CDABC的生成.BC/COL多孔微球紅外圖譜與CDABC紅外圖譜相似，表明微球制備過程中僅為材料形態(tài)的改變，無化學(xué)反應(yīng)發(fā)生.

2.2.2 X射線衍射儀分析(XRD)

圖9 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球紅外圖譜

圖10 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球XRD圖譜

2.2.3 熱穩(wěn)定性(TG)分析

圖11、圖12分別為BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球的TG曲線及DTG曲線.由圖11、12可知，BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球均存在三個(gè)明顯的熱分解階段，第一階段中，BC熱失重率最小為4%，COL最大為12%；第二階段為主要熱失重階段，BC熱失重率為61%，COL為70%；第三階段各組分熱失重速率均顯著降低.

圖11 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球TG曲線

圖12 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球DTG曲線

由表3可知，最大失重值溫度依次為BC(351 ℃)>BC/COL多孔微球(344 ℃)>CDABC(332 ℃)> DABC(327 ℃) >COL(309 ℃).上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BC氧化后發(fā)生了熱性質(zhì)的變化，可能是因氧化后BC自身發(fā)生降解，小分子鏈段增加，導(dǎo)致了加熱分解過程中所需要的熱量減少，故熱分解溫度降低.BC較COL具有良好的熱穩(wěn)定性，BC與COL的復(fù)合能夠改善COL熱性能.

表3 TG和DTG曲線特征數(shù)據(jù)分析

2.2.4 掃描電子顯微鏡(SEM)

圖13所示為BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球的SEM圖譜.由圖13(a)、(b)可知，BC由高密度納米微纖維相互纏繞形成，具有清晰的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；圖13(c)、(d)所示BC氧化形成的DABC由于部分鏈段斷裂，纖維發(fā)生卷曲，纖維排布變得混亂，但仍具有三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；圖13(e)、(f)所示COL結(jié)構(gòu)致密，無孔狀分布，SEM顯示其具有一定的纖維結(jié)構(gòu)；圖13(g)、( h)所示COL與DABC復(fù)合后，BC中的部分孔隙被COL所填充，所形成CDABC孔隙率較復(fù)合前降低，但仍呈現(xiàn)立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；圖13(i)、(j)表明，采用反相懸浮再生法能夠成功制備BC/COL多孔微球.微球形態(tài)較為圓整，其中有大量孔道分布，可為后續(xù)藥物的負(fù)載提供空間.

(a)5 000倍BC (b)20 000倍BC

(c)5 000倍DABC (d) 20 000倍DABC

(e)5 000倍COL (f)10 000倍COL

(g)5 000倍CDABC (h) 10 000倍CDABC

(i) 1 000倍多孔微球 (j)3 000倍多孔微球圖13 BC、COL、DABC、CDABC及BC/COL多孔微球SEM圖譜

3 結(jié)論

研究利用Malaprade反應(yīng)原理，以高碘酸鈉為氧化劑，BC進(jìn)行氧化制備DABC.利用希夫堿反應(yīng)使DABC中的-CHO-與COL中的-NH2反應(yīng)，制備CDABC復(fù)合材料.采用反相懸浮再生法將CDABC制備成BC/COL多孔微球.

BC/COL多孔微球制備最優(yōu)工藝為：乳化溫度35 ℃，乳化時(shí)間5 h，十六烷∶(CDABC/IL)=10∶1，CDABC質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%.在此工藝下制備BC/COL多孔微球載藥率為254 mg/g.

利用FT-IR、XRD、TG及SEM對(duì)BC、DABC、CDABC、BC/COL多孔微球的化學(xué)基團(tuán)、結(jié)晶度、熱性能、及表面形貌進(jìn)行分析，表明BC氧化、CDABC復(fù)合均能成功進(jìn)行，且復(fù)合作用對(duì)材料的形貌、結(jié)晶度及熱性能均有一定改善作用.采用反相懸浮再生法能夠成功制備BC/COL多孔微球，可為后續(xù)藥物的負(fù)載提供條件.