路雁惠， 郭 斌， 張銳毅， 溫璐璐， 吳凱敏， 李燕飛， 何謙益, 賈延劼

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為21-25 nt的小分子非編碼單鏈RNA，可靶向與特異性mRNA結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，Let-7家族為目前研究較為深入的miRNA之一，當(dāng)let-7在人體正常表達(dá)時，控制細(xì)胞增殖、分化、死亡，同時也參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸[1]。外泌體是直徑約為20～150 nm的脂質(zhì)雙分子層囊泡結(jié)構(gòu)，其內(nèi)富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)。外泌體可以富集腦內(nèi)部分miRNA，因此腦脊液中的外泌體miRNA有可能是顱內(nèi)病理生理學(xué)變化的重要證據(jù)[2，3]。結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，由結(jié)核分枝桿菌感染引起，目前仍然是全世界最嚴(yán)重的傳染病之一，但當(dāng)前該疾病的診斷局限性嚴(yán)重減緩了消除結(jié)核病的步伐，結(jié)核性腦膜炎中尤為明顯。有研究證實肺結(jié)核患者中l(wèi)et-7b和miR-30b的水平顯著上調(diào)，與結(jié)核病的疾病發(fā)展有關(guān)[4]。本實驗通過檢測結(jié)核性腦膜炎和病毒性腦膜炎、正常腦脊液中的外泌體中l(wèi)et-7家族各miRNA表達(dá)差異，探討let7家族對結(jié)核性腦膜炎和病毒性腦膜炎、正常對照者的鑒別作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料 從2017年1月-2018年1月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科就診的住院患者中，選取15例結(jié)核性腦膜炎患者(簡稱結(jié)腦組)，男性6例，女性9例，平均年齡(35±10.75)歲。15例病毒性腦膜炎患者(簡稱病腦組),男性8例，女性7例，平均年齡(28±16.43)歲。15例正常腦脊液患者(簡稱對照組)，男性5例，女性10例，平均年齡(30±6.50)歲，分別收集每位患者腦脊液標(biāo)本。所有被研究者有以下任一情況者均排除在本研究以外：(1)中樞神經(jīng)系統(tǒng)急慢性炎性脫髓鞘性疾病、結(jié)締組織病、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等引起患者腦脊液檢測相關(guān)生化指標(biāo)異常的神經(jīng)系統(tǒng)疾??；(2)妊娠和哺乳期婦女；(3)不符合實驗納入標(biāo)準(zhǔn)者。本實驗由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員審核批準(zhǔn)，同時獲得所有實驗對象及其委托人同意，簽署授權(quán)委托同意書和知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 腦脊液外泌體提取 患者入院后于無菌條件下行腰椎穿刺術(shù)后用普通干燥管收取患者腦脊液約5 ml，在4 ℃，500 g離心10 min，去除污染細(xì)胞及碎片等雜質(zhì)，將離心后所得上清液用移液槍移至EP管中，放置于-80 ℃低溫冰箱保存。采用ExoQuick Precipitation試劑盒(SBI公司)分離提取外泌體。

1.2.2 外泌體鑒別 采用透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)：吸取外泌體懸液滴于銅網(wǎng)上，室溫下靜置30 min，再向銅網(wǎng)上滴加3%磷鎢酸溶液，靜置5 min，透射電鏡下拍照；Western blot測定外泌體標(biāo)志物含量：取超離得到的外泌體100 μl，加入5 μl含有1%蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液(碧云天，海門，中國)，冰上裂解30 min，12000 r/min離心10min，取上清液，BCA 法蛋白定量，加入適量5×樣品緩沖液后，煮沸10 min。20 μl的樣品上樣至15%的SDS聚丙烯凝膠中電泳，接著轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉液封閉處理1 h。加入一抗(CD63和CD9單克隆抗體),4 ℃過夜孵育，次日室溫恢溫30 min，回收一抗后，TBST洗滌3次,每次10 min,加入二抗,室溫孵育1 h。 TBST緩沖液洗滌3次，每次10 min，應(yīng)用ECL法顯色,在凝膠成像系統(tǒng)中掃描顯像。

1.2.3 熒光定量PCR檢測目的基因 根據(jù)Trizol法應(yīng)用miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑盒(QIAGEN公司)，提取腦脊液miRNA及外泌體miRNA，具體步驟按說明書操作。紫外分光光度計測吸光度值確定RNA 的濃度和純度。于PCR儀上，37 ℃，溫育60 min，進(jìn)行Poly(A)加尾，混勻后，在PCR儀上42 ℃，60 min；72 ℃,5 min反應(yīng)結(jié)束后，冰上冷卻。-20 ℃保存逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA待測。常規(guī)PCR檢測各基因擴(kuò)增效果及熒光定量PCR檢測目的基因miRNA相對表達(dá)，具體步驟如下：PCR反應(yīng)條件：95 ℃，10 min預(yù)變性；然后95 ℃變性10 s，變性，接著60 ℃，復(fù)性10 s，最后72 ℃延伸30 s，循環(huán)參數(shù)40個。反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳法檢測各個基因PCR結(jié)果。常規(guī)PCR檢測靶基因擴(kuò)增效果，熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃，預(yù)變性10 min后；調(diào)定參數(shù)為(95 ℃，10 s；60 ℃，30 s,采集熒光)條件下，熱循環(huán)40個，60 ℃～95 ℃熔解曲線。內(nèi)參以U6為參考標(biāo)準(zhǔn)，每個獨立樣本檢測3次，計算處理實驗組及對照組每個樣本中miRNA 的△Ct值(注：靶基因miRNA的相對表達(dá)含量2-△△Ct表示)。

2 實驗結(jié)果

2.1 外泌體的形態(tài)學(xué)特征 實驗通過ExoQuick試劑盒提取腦脊液外泌體后，應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)在3組不同腦脊液中均可看到邊界較清晰、中間較周圍淡染的類圓形或橢圓形囊泡，形態(tài)、大小均勻，囊泡內(nèi)可見致密低電子影(見圖1)。

2.2 CD9、CD63在腦脊液外泌體中的表達(dá) 瓊脂糖電泳、蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，腦脊液中外泌體表達(dá)CD9、CD63蛋白(見圖2)，該實驗結(jié)果進(jìn)一步說明腦脊液中外泌體的存在。

2.3 腦脊液外泌體let-7家族的表達(dá) 實驗通過miRNA提取劑分別提取外泌體及腦脊液let-7家族中l(wèi)et-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i，其中 let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7g、let-7i均有不同程度表達(dá)，let-7f不表達(dá)，let-7b表達(dá)含量最高(見圖3),而腦脊液中l(wèi)et-7家族中l(wèi)et-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7g、let-7i未表達(dá)。

2.4 腦脊液外泌體中l(wèi)et-7b的實時熒光定量PCR結(jié)果 實時熒光定量PCR檢測let-7b在3組不同腦脊液外泌體中的相對表達(dá)，通過統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果如下(見圖4)：(1)結(jié)腦組腦脊液外泌體中l(wèi)et-7b的表達(dá)顯著低于對照組，差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)；(2)病腦組與對照組相比，病腦組let-7b表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(*P<0.05)；(3)結(jié)腦組與病腦組相比,結(jié)腦組let-7b表達(dá)下調(diào)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(nsP>0.05)。

圖1 A:為結(jié)核性腦膜炎腦脊液中外泌體(×40.0 k)；B:為病毒性腦膜炎腦脊液中外泌體(×25.0 k)；C:為正常對照組腦脊液中外泌體(×70.0 k)

圖2 CD9、CD63在腦脊液外泌體中的表達(dá)

注：M為Marker；1-8為let-7a至let-7i；9為內(nèi)參U6

圖4 不同組腦脊液外泌體中l(wèi)et-7b的相對表達(dá)量

3 討 論

最近發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞通訊機(jī)制：胞外囊泡(EV)通訊，包括脫落微泡、外泌體、凋亡小體等類型，其中外泌體可包裹多種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及miRNA等，在生理和病理條件下形成并釋放、與靶細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的物質(zhì)傳遞、信息交流[5]。也被證實在外泌體中存在大量RNA以及miRNA，且具有miRNA富集作用[6,7]。如科學(xué)家運(yùn)用基因芯片分析研究發(fā)現(xiàn)miR-451、miR-16、miR223、let-7b、let-7i在人體血清外泌體中含量較高，表現(xiàn)出特異的靶向性以及獨特的生物學(xué)特性[8]。

Let-7家族作為miRNA家族中的一員，最早在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，參與其發(fā)育調(diào)節(jié)過程，具有高度保守性[9]。哺乳動物體內(nèi)，let-7家族有l(wèi)et-7a(1-3)、et-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f(1-2)、let-7g、let-7i、miR-98、miR-202共13個，分布于肺、肝臟、胰腺等不同組織器官的單核細(xì)胞、上皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞中，參與細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、腫瘤增殖等多種生命過程的調(diào)控。如Johnson等[10]科學(xué)家通過體外實驗顯示let-7在正常肺組織細(xì)胞中表達(dá)水平增高，抑制細(xì)胞增殖；而肺癌細(xì)胞中l(wèi)et-7表達(dá)水平上調(diào)時，抑制癌細(xì)胞的增殖[11]。朊蛋白感染的神經(jīng)元外泌體中miR-146a表達(dá)下調(diào)，let-7家族中的let-7b、let-7i[12]。

腦膜炎是病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體等病原體侵犯軟腦膜及脊髓膜引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，如結(jié)核性腦膜炎、隱球菌性腦膜炎、腦膜神經(jīng)梅毒等。結(jié)核性腦膜炎是一種肺外結(jié)核病，但近年來由于抗生素濫用、免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致結(jié)核耐藥菌菌株的大量產(chǎn)生，發(fā)病率逐漸升高。但結(jié)核桿菌常規(guī)培養(yǎng)時間長、假陰性結(jié)果多，耽誤患者確診診斷時機(jī)并推遲治療時間[13,14]。

腰椎穿刺腦脊液檢查是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的主要手段，早期腦膜炎患者腦脊液的表現(xiàn)并不特異，尋求結(jié)核性腦膜炎早期診斷標(biāo)志物是目前的一個研究熱點。Tripathi[15]等科學(xué)家通過體外實驗結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染的THP-1巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)let-7b的下調(diào)促進(jìn)了THP-1細(xì)胞的凋亡，MTB清除增強(qiáng)。在肺結(jié)核患者中l(wèi)et-7b通過調(diào)控TLR-NF-κB信號通路參與介導(dǎo)的結(jié)核病的發(fā)展[7]。Kar[16]等研究報道let-7b在腦海綿狀血管畸形(CCM)病理標(biāo)本中檢測表達(dá)下調(diào)，可能與CCM的形成有關(guān)。

綜上所述，本實驗檢測3組患者腦脊液外泌體中l(wèi)et-7b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中l(wèi)et-7b的表達(dá)水平下降，本課題組另一實驗let-7d在結(jié)核性腦膜炎具有相似表達(dá)[17]。除此之外有研究報道抗NMDAR腦炎患者let-7b的表達(dá)水平亦顯著下調(diào)[18]。結(jié)合外泌體膜的穩(wěn)定性及l(fā)et-7b的高保守性，腦脊液外泌體中l(wèi)et-7b的表達(dá)可作為結(jié)核性腦膜炎的潛在的臨床診斷標(biāo)志物，進(jìn)行疾病的診斷及相關(guān)腦炎的鑒別診斷。let-7b調(diào)控除了與Fas蛋白、TLR-NF-κB信號通路有關(guān)，具體的調(diào)控作用機(jī)制、結(jié)核性腦膜炎疾病治療前后的變化及在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中生理病理變化仍需進(jìn)一步的探索研究。

總而言之，let-7b在結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液外泌體中表達(dá)下調(diào)，可作為該疾病的診斷及相關(guān)腦炎的鑒別診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，但其具體的調(diào)控作用機(jī)制、結(jié)核性腦膜炎疾病治療前后的變化及在其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中生理病理變化仍需進(jìn)一步的探索研究。