周榮易，黨偉利，周正，李華偉，張晰

(河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科，河南省中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院兒童腦病診療康復(fù)中心， 鄭州 450000)

孤獨癥譜系障礙(autism spectrum disorder, ASD)，國內(nèi)簡稱孤獨癥、自閉癥等，是近年臨床上較常見的嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙性疾病，臨床以語言發(fā)育障礙、社會交往及適應(yīng)能力異常、刻板重復(fù)行為和興趣狹窄等為主要特征[1]。近年來，本病全球發(fā)病率不斷增高，美國兒童發(fā)病率約為1/68，男孩發(fā)病率約為女孩的4.5倍[2]。ASD不僅會給兒童的一生帶來嚴重影響，更會給家庭帶來沉重的心理負擔及經(jīng)濟負擔，影響家庭和諧[3]。遺憾的是，目前本病病因及發(fā)病機制不明，亦沒有特效治療藥物[4]，更有報道顯示越來越多的ASD患兒常共患癲癇、注意缺陷多動障礙、焦慮、抑郁等疾病，使得本病的治療復(fù)雜化[5-7]。目前在國際范圍內(nèi)，ASD已不僅僅是一個醫(yī)學問題，更是逐漸成為醫(yī)學背景下的急需解決的社會問題。因此，提高對本病的認知和研究水平變得尤為重要。動物模型因其可控性、易得性及預(yù)知性等特點，提供了優(yōu)于人體研究的優(yōu)勢，在人們對疾病病因及發(fā)病機制的探索中扮演著重要角色，ASD動物模型成為人們探索神經(jīng)系統(tǒng)與孤獨癥發(fā)病關(guān)系的關(guān)鍵。目前，國內(nèi)醫(yī)學界對ASD及其動物模型的認知程度非常有限，為增進了解，本文特對近幾年國際上孤獨癥動物模型的研究進展進行簡要總結(jié)，以資參考。

1 基因模型

早在30年前，ASD發(fā)病的遺傳學基礎(chǔ)就得到了學術(shù)界的認可。基于雙胞胎家庭和人群的研究表明，ASD是所有精神疾病中最易遺傳的疾病之一，遺傳率接近50%[8-9]，同卵雙胞胎患病一致率更是在70%～90%之間[10]。雖然人們已對遺傳因素與ASD發(fā)病的緊密關(guān)聯(lián)性形成了共識，但通過現(xiàn)有的技術(shù)方法，只有約20%的ASD病例找到了確定的遺傳證據(jù)，這些因素通常涉及染色體重排、基因拷貝數(shù)變異(copy number variations, CNV)或點突變[11-12]。基于基因技術(shù)的遺傳動物模型應(yīng)運而生。

1.1 Neuroligins(NLGNs)基因模型

突觸前NLGNs與突觸后神經(jīng)素共同構(gòu)成突觸復(fù)合體，介導突觸的穩(wěn)定性，并影響著谷氨酸能及γ-氨基丁酸能神經(jīng)突觸的分化。在已知的人體內(nèi)表達的五種NLGN基因中(NLGN1、NLGN2、NLGN3、NLGN 4X及NLGN 4Y)，NLGN3和NLGN4與ASD癥狀關(guān)系最為密切。核磁掃描顯示大鼠NLGN3基因敲除/敲入會導致大鼠腦容積顯著降低[13]，導致大鼠出現(xiàn)ASD癥狀，進一步研究顯示，NLGN3基因敲入主要影響GABA抑制性突觸的功能而導致腦內(nèi)遞質(zhì)水平的失衡及腦發(fā)育紊亂[14]。NLGN4基因敲除后的表現(xiàn)與NLGN3類似，通過MRI檢測，NLGN4 KO大鼠的整個大腦以及小腦和腦干的體積減少[15]。同時，分子生物學研究顯示，這些大鼠腦皮層中興奮性PSD-95-免疫標記點顯著減少，海馬CA3區(qū)中的GABAa受體和卟啉免疫反應(yīng)性突觸密度降低[16]。動物模型顯示，NLGNs基因敲除引起腦突觸發(fā)育的改變及腦內(nèi)遞質(zhì)水平的異常，導致ASD癥狀的出現(xiàn)[17]。

1.2 Neurexins(NRXNs)基因模型

NRXNs基因編碼α-和β-尿嘧啶，并且作為NLGN的突觸前結(jié)合體配體，在突觸的融合、分化和成熟中扮演著重要的角色。臨床研究顯示具有NRXN1基因點突變的受試者廣泛存在智力殘疾、發(fā)育遲緩、言語障礙、ASD、癲癇、肌張力減退等一種或多種問題，并且罹患精神分裂癥的風險大大增高[18]，NRXN1基因點突變已經(jīng)證實和ASD發(fā)病有關(guān)。NRXN1含有兩個啟動子，它們產(chǎn)生兩大類同種型Nrxn1α和Nrxn1β[19]。研究顯示，靶向敲除Nrxn1α基因，小鼠會展現(xiàn)出典型ASD核心癥狀，且與野生型(WT)小鼠對照相比，Nrxn1α基因敲除小鼠在腦結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出腦干和皮質(zhì)中抑制性突觸顯著減少現(xiàn)象[20]。此外，CNTNAP2作為NRXN基因家族的成員，主要編碼contactin-associated protein-like 2(CASPR2)基因。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在患有智力障礙及ASD的個體中觀察到CNTNAP2基因的隱性突變。CASPR2基因在促進樹突軸突的發(fā)育[21]、維持突觸的穩(wěn)定性[22]和遞質(zhì)轉(zhuǎn)運中必不可缺[23]。動物實驗顯示，與正常對照組相比，CNTNAP2基因敲除小鼠顯示胼胝體和皮層軀體感覺調(diào)控神經(jīng)元的異常改變，海馬和紋狀體中的小白蛋白免疫反應(yīng)中間神經(jīng)元減少，軀體感覺皮層中的GABA能中間神經(jīng)元減少[24]，下丘腦室旁核中分泌催產(chǎn)素的神經(jīng)元減少等[25]，導致腦內(nèi)突觸結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及遞質(zhì)傳遞的紊亂，出現(xiàn)ASD癥狀。除了NRXN1基因點突變外，NRXN3突變雖較為少見，但臨床上該位點基因的異常也與ASD的發(fā)生相關(guān)。

1.3 其他基因模型

除如上基因外，國內(nèi)外報道的基因模型尚有SH3 and multiple ankyrin repeat domains protein 3 (SHANK3)基因模型[26]、methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2)基因模型[27]、fragile X mental retardation 1 gene (FMR1)基因模型[28]、tuberous sclerosis complex 1/2 (TSC1/2)基因模型[29]等，這些基因均是在ASD臨床個體中發(fā)現(xiàn)并經(jīng)基因敲除動物模型驗證，是對ASD的基因遺傳性的有力佐證，也是研究基因靶點調(diào)控的重點基因。近期還有報道新興的單基因模型出現(xiàn)，如chromodomain helicase DNA-binding protein 8 (CHD8)模型[30]、sodium channel, voltage-gated type IIα subunit (SCN2A)模型、synaptic GTPase activating protein 1 (SynGAP1)模型、glutamate receptor ionotropic, NMDA 2B (GRIN2B)模型等[31]，尚有15q11-q13缺失和15q13.3微缺失[32]、15q11-13重復(fù)[33]、22q11.2缺失綜合征[34]、16p11.2剪除和復(fù)制綜合癥[35]等多基因異常模型。基因異常模型均為特定基因缺失及研究目的而造模，在適用性上有其針對性范圍，故在此不做全面詳細介紹。

2 特發(fā)性ASD動物模型

遺傳因素雖在ASD的發(fā)病過程中占據(jù)重要地位，但ASD病因相當復(fù)雜，多種因素均可能導致ASD的出現(xiàn)，表達單一突變的遺傳模型并不能完美地模擬ASD的所有病理特征。 因此，目前國際上已經(jīng)通過行為學等手法選擇了幾種小鼠和大鼠品系[36]，它們能夠較好的模擬ASD的核心癥狀。被認為是特發(fā)性自閉癥的模型，因它們的ASD相關(guān)行為學表現(xiàn)并非由已知的基因突變引起，因此具有病因的未知性和研究的預(yù)測性。

2.1 近交系BTBR-T+ tf/J 小鼠模型

BTBR-T+tf/J近交系小鼠是目前公認的最具ASD核心臨床特征且能夠穩(wěn)定子代復(fù)制的動物模型[31]。在行為學實驗中，BTBR-T+tf/J小鼠主要表現(xiàn)出交互性社交行為減少、發(fā)聲能力降低和高度刻板重復(fù)的自我理毛行為，這與人類的ASD核心癥狀極為類似[37-38]。有關(guān)BTBR-T+tf/J小鼠行為學特征異常的原因，有研究顯示BTBR-T+tf/J小鼠因編碼尿氨酸3-單加氧酶的基因Kmo的3個單核苷酸多態(tài)性，從而引起氨基酸序列改變[39]。尿氨酸3-單加氧酶可以調(diào)節(jié)色氨酸代謝產(chǎn)物之一的犬尿酸的合成，而犬尿酸在其他精神疾病如精神分裂癥中表達異常。在臨床研究中，多數(shù)學者報道ASD患者多伴有胼胝體發(fā)育不全或胼胝體體積縮小，導致出現(xiàn)言語障礙及社會交流-交往障礙癥狀[40]。影像學研究顯示，BTBR-T+tf/J小鼠最顯著的神經(jīng)解剖學特征是胼胝體的的缺失及海馬神經(jīng)元的極度減少，腦白質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細胞突觸投射異常和腦體積的減小[41]。同時，BTBR-T+tf/J小鼠存在腹側(cè)被蓋區(qū)、扣帶回、外側(cè)丘腦、后丘腦、枕葉和頂葉皮質(zhì)以及皮質(zhì)下區(qū)域的灰質(zhì)體積減少，而嗅球區(qū)、內(nèi)側(cè)前額葉和島葉皮質(zhì)、杏仁核和背側(cè)海馬體積增大[42]。這些發(fā)現(xiàn)與臨床ASD患者中腦灰質(zhì)體積隨時間而不斷減少具有一定的一致性，其余腦結(jié)構(gòu)區(qū)域的異?？赡軐εR床研究具有一定的提示預(yù)測性，需要不斷去研究。

2.2 近交系BALB/cByJ小鼠模型

BALB/cByJ是另一種近交小鼠品系，與具有高社交性的近交小鼠品系例如C57BL/6J和FVB/NJ小鼠相比，顯著表現(xiàn)出社交障礙和刻板行為。影像學上，BALB/cByJ小鼠亦表現(xiàn)出胼胝體體積的縮小。BALB/cByJ小鼠需特定的對照組，且不能完整呈現(xiàn)ASD的全部典型臨床癥狀，目前研究和應(yīng)用相對較少[43-44]。

3 調(diào)控環(huán)境因素ASD模型

3.1 丙戊酸(valproic acid, VPA)暴露

VPA是臨床上常用的抗癲癇藥及情緒穩(wěn)定劑，主要通過調(diào)節(jié)γ-氨基丁酸的濃度減低神經(jīng)元的興奮性而發(fā)揮藥效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，孕期服用VPA的母親子代罹患ASD的風險要較正常人高出三倍[45-46]。在動物實驗中，學者已通過母鼠孕期VPA暴露模擬出新生鼠的典型ASD模型，該模型也是國內(nèi)報道較多的動物模型。Schneider T等[47]通過母鼠孕期腹腔注射VPA以觀察子代行為學的改變，發(fā)現(xiàn)子代大鼠表現(xiàn)出對疼痛敏感性減低、轉(zhuǎn)圈、理毛等刻板樣行為增多、探索性活動減少、群體交往性行為減少等典型行為異常，這與ASD兒童的臨床表現(xiàn)極為類似。同時研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前VPA暴露模型的神經(jīng)病理學改變程度取決于VPA的應(yīng)用劑量及持續(xù)時間[48]。在嚙齒動物實驗中，母鼠孕期暴露于高于治療劑量的VPA會導致子代腦重量的減少[49-50]，而較低劑量不影響腦重[51]。而高劑量的急性暴露會導致大腦皮質(zhì)厚度的減少，而低劑量的慢性暴露會增加皮質(zhì)厚度[52]。長期觀察發(fā)現(xiàn)，VPA暴露會導致子鼠早期前額葉皮質(zhì)和基底外側(cè)杏仁核的厚度減少，以及隨年齡增長而持續(xù)存在的海馬CA1區(qū)厚度變薄[53]。受影響的其他大腦區(qū)域包括小腦體積的逐步縮小以及杏仁核體積的增大[54]。在神經(jīng)遞質(zhì)的檢測中，孕鼠VPA暴露的子代鼠表現(xiàn)出前額葉皮質(zhì)、海馬區(qū)、小腦及外周血液中五羥色胺水平的改變，且這一改變與人類當前的臨床研究結(jié)果高度類似[55]。孕期VPA暴露子代鼠展現(xiàn)出與ASD兒童類似的典型行為學表現(xiàn)，符合目前研究結(jié)果及理論假設(shè)的腦結(jié)構(gòu)及功能的損傷以及腦內(nèi)遞質(zhì)的改變。

除此之外，尚有報道丙酸(propionic acid, PPA)誘導模型[56]、特布他林誘導模型[57]、沙利度胺(Thalidomide)誘導模型[58]、博爾納病病毒(Borna disease virus, BDV)誘導模型等動物模型[59]，造模方法及行為特征與VPA模型類似，而應(yīng)用廣度及認可度上不及VPA模型，在此不做詳細論述。

3.2 母體自身抗體模型

在探尋ASD的致病因素過程中，發(fā)現(xiàn)極少部分患兒母親血清中存在一種抗胎兒腦蛋白的特異抗體(IgE13-IgE18、IgG)[60]。孕期階段，孕母的IgG等可經(jīng)胎盤為胎兒提供被動免疫，保護胎兒的正常發(fā)育，然而母親產(chǎn)生的自身抗體也會經(jīng)由這一途徑影響胎兒。孕期的血腦屏障正在發(fā)育，極不完善，母親產(chǎn)生的抗胎兒腦蛋白的特異性抗體會輕易地影響腦部的發(fā)育，自身抗體的存在可能是ASD等疾病發(fā)病的重要原因，推測部分ASD患兒的發(fā)病可能與母體自身抗體有關(guān)[61]。動物實驗表明，孕母擁有抗胎兒腦蛋白抗體與子代自閉癥有密切關(guān)聯(lián)[62]。在子宮內(nèi)暴露于母體自身抗體的實驗小鼠在胎兒腦發(fā)育期間表現(xiàn)出皮質(zhì)神經(jīng)元過速增值[63]以及在出生后腦發(fā)育期內(nèi)大腦神經(jīng)元和腦體積的異?？焖偕L[64]。在恒河猴孕母自身抗體模型中，子代腦容量亦顯示出異常的增加[65]，這與臨床上攜帶自身抗體母親所描述的患兒癥狀十分類似[66]。

3.3 母體免疫激活(maternal immune activation, MIA)模型

該模型的研究源于對ASD發(fā)病因素的流行病學調(diào)查，大樣本的流行病學資料顯示，孕期尤其是孕前3月內(nèi)的感染與ASD的發(fā)病密切相關(guān)[67]。學者據(jù)此開始研究小鼠暴露于妊娠期母體因感染等因素導致母體免疫激活(MIA)模型子代的行為學及神經(jīng)病理學特征[68]。為了誘導免疫反應(yīng)，將孕期母鼠暴露于多核糖核苷酸-多聚胞苷酸(I：C)(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid, Poly IC)、脂多糖、模擬病毒、細菌感染等環(huán)境，激活母體免疫系統(tǒng)，誘導MIA模型[69]。研究發(fā)現(xiàn)，MIA模型的子代具有與臨床上ASD患兒相類似的行為表現(xiàn)，主要表現(xiàn)為社交能力障礙及重復(fù)刻板行為增多[70-71]。例如，在妊娠期暴露于 Poly IC環(huán)境的C57BL/6J小鼠表現(xiàn)出社交能力的降低以及行為學實驗中高度重復(fù)刻板的挖掘行為[72]。產(chǎn)前暴露于流感病毒也導致后代C57BL/6J和BALB/c小鼠類似的行為改變[73]。藥物研究顯示，MIA后代通過注射抗嘌呤藥物蘇拉明(suramin)可顯著糾正社交行為及刻板行為[74-75]。MIA模型子代在出生后給予抗炎藥物ibudilast能夠較好緩解子代的重復(fù)刻板行為[76]。且在臨床上，應(yīng)用具有抗炎作用的噻唑烷二酮和匹格列酮能夠顯著改善孤獨癥兒童的易怒、刻板行為等，且對年齡較小的患者效果更為顯著[77]。MIA模型順應(yīng)流行病學結(jié)果而產(chǎn)生，且在藥理研究中得到不斷驗證，對ASD發(fā)病機制的研究及未來的治療思路無疑是一個新的啟示。

4 對ASD動物模型的展望

雖然越來越多的研究顯示諸多危險因素與ASD的發(fā)病密切相關(guān)，但這些危險因素均屬早期預(yù)防范疇，對臨床治療均無直接指導意義[78]。國內(nèi)對ASD的認識及研究遠遠遲于國外，詳細的動物模型研究較少[59,69]。動物模型是實驗研究的基礎(chǔ)，高度還原ASD臨床特征及發(fā)病狀態(tài)的動物模型是研究ASD的理想對象。目前圍繞ASD病因及發(fā)病機制而創(chuàng)制的動物模型不斷增多，這一方面顯示出學術(shù)界對本病的不斷重視，同時模型的多樣化也造成了研究上的莫衷一是。縱觀國際及國內(nèi)對動物模型的評價標準，三種有效性廣泛用于評估模型與人類疾病的接近程度[79-81]。模型呈現(xiàn)的有效性越多，其對人類疾病的呈現(xiàn)效果就越好。這些有效性不僅在評估動物模型的可靠性上至關(guān)重要，其在評估藥物治療的療效時也不可替代。第一種是結(jié)構(gòu)有效性，即模型要符合一定的理論假說且病理生理改變應(yīng)與假說或理論相一致。例如基因突變或環(huán)境暴露于某些因素所制造的模型。從這一點來看，較好符合結(jié)構(gòu)有效性的模型首推單基因變異的ASD動物模型，環(huán)境因素模型也能夠較好的符合這一特征。第二種是表面有效性，即模型能夠在行為學等多方面模擬疾病的典型特征。在ASD動物模型中，能夠模擬刻板行為及社交、言語障礙等典型臨床癥狀即具有較好的表面有效性。從這一點而論，幾乎當前所有報道的ASD動物模型均不同程度的符合這一特性，而BTBR模型、VPA模型報道的表面有效性最為接近臨床實際。第三種是預(yù)測有效性，即模型的藥理學反映及非藥理學反應(yīng)與臨床治療表現(xiàn)相一致，并能夠為遠期的治療及發(fā)病機制研究提供預(yù)測性。關(guān)于預(yù)測有效性，由于當前沒有直接藥物可用于治療人類ASD所表現(xiàn)出的社會交往障礙及復(fù)雜多樣的重復(fù)刻板行為，因此無法將藥物對人類和動物行為的影響進行比較分析，進而預(yù)測遠期的效果及探索其發(fā)病機制。所以，從這一角度來看，目前除了特定單基因的靶向研究外，沒有任何一種模型符合這一行特性。綜合以上特性，從目前來看，孕期VPA暴露子代鼠展現(xiàn)出與ASD兒童類似的典型行為學表現(xiàn)、符合目前研究結(jié)果及理論假設(shè)的腦結(jié)構(gòu)及功能的損傷以及腦內(nèi)遞質(zhì)的改變，結(jié)構(gòu)有效性及表面有效性較好，對于研究孕期、胎產(chǎn)因素相關(guān)的ASD病因及發(fā)病機制研究較為符合。BTBR模型能夠突出的模擬刻板行為及社交障礙的特征，具有較VPA模型更優(yōu)的表面有效性，其腦功能及結(jié)構(gòu)的異常亦符合當前的理論假設(shè)，具有較好的結(jié)構(gòu)效度，能夠用于一般性的ASD病因及發(fā)病機制研究，適應(yīng)性更為廣泛。而基因遺傳模型因其明確的造模目的，雖在當前能夠較好的模型三種有效性，但因其特定的應(yīng)用范圍及高昂的價格，限制了應(yīng)用廣度及普適性。因此，在ASD的研究中，建議依據(jù)研究計劃優(yōu)先選擇BTBR模型及VPA模型，更好的服務(wù)于研究工作，推進ASD的不斷深入研究。

總結(jié)而論，孤獨癥是一種復(fù)雜的發(fā)育障礙性疾病，基因異常、腦功能異常等都是近來人們不斷探索的方向。ASD的發(fā)病與多種因素密切相關(guān)，目前，人們雖通過流行病學資料、臨床觀察等多種途徑掌握了一些易感因素，但對疾病的認識還遠遠不夠。充分發(fā)掘利用動物模型是研究孤獨癥發(fā)病原因及治療方法的最佳選擇。當前的模型尚沒有符合三個基本有效性的理想的病理學及病因?qū)W模型。