高青，曾貴榮，歐陽冬生,3*

(1. 中南大學湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，長沙 410008； 2. 中南大學臨床藥理研究所，遺傳藥理學湖南省重點實驗室，長沙 410078； 3. 復雜基質(zhì)樣本生物分析湖南省重點實驗室，長沙 410000；4. 北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所，北京 100193； 5. 湖南省藥物安全評價研究中心/新藥藥效與安全評價湖南省重點實驗室，長沙 410331)

癲癇(epilepsy，EP)是全球最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，由多種病因引起，以腦神經(jīng)元過度放電導致反復性、發(fā)作性和短暫性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征[1]。耐藥性癲癇是臨床上癲癇防治的重大難題，雖然近些年來已有不少抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDs)面世，但仍有20%～30%的患者對AEDs治療反應(yīng)差，癲癇發(fā)作難以控制，且通常伴隨多種嚴重并發(fā)癥的發(fā)生[2]。癲癇動物模型是研究致癇機制和篩選AEDs的重要手段，Openchowski等[3]于1883年首次采用冷凍大腦組織制作腦內(nèi)致癇灶，成為癲癇模型制備的開端。隨后研究者采用不同的方法構(gòu)建了多種模型，如最大電休克(maximal electroshock, MES)模型和戊四唑(pentylenetetrazol，PTZ)模型是研究藥物抗驚厥活性的標準模型。然而，這兩種模型篩選出的藥物僅能控制癲癇癥狀，對耐藥性癲癇無效，無法滿足臨床治療需求。6 Hz角膜點燃癲癇(6 Hz corneal kindling seizure，6 Hz)模型作為一種較好的多藥耐藥癲癇模型，在沉寂了半個世紀后煥發(fā)出新的生機，本文就6 Hz模型的研究進展作簡要綜述。

1 歷史發(fā)展

點燃(kindling)模型與人類癲癇的形成與發(fā)生極為相似，能貼近模擬癲癇發(fā)作的臨床癥狀，是研究致癇機制和AEDs的理想模型。電點燃杏仁核、蒼白球、梨狀皮質(zhì)、海馬和角膜等部位均可誘發(fā)癲癇發(fā)作，其中杏仁核和海馬點燃較為常見，杏仁核模型是良好的難治性癲癇模型[4-5]。6 Hz模型是利用電刺激動物角膜構(gòu)建的一種點燃模型，最早于上世紀50年代被提出，基于該模型在顯性表現(xiàn)和腦電圖模式上與精神運動性癲癇的臨床表現(xiàn)之間的相似性，Toman等[6]將其作為精神運動性癲癇發(fā)作模型。但由于利用該模型考察苯妥英(phenytoin，PHT)的療效時與臨床所見不一致，被認為對PHT不敏感，其后6 Hz模型在AEDs開發(fā)中的使用便十分罕見[7]。直到2001年，Barton等[8]發(fā)現(xiàn)了6 Hz模型對左乙拉西坦(levetiracetam，LEV)具有敏感性，并將其作為頑固性癲癇模型，該模型才得到重新發(fā)展。時至今日，6 Hz模型已越來越多地應(yīng)用于AEDs的篩選，被認為是耐藥性癲癇潛在治療藥物的篩選工具，美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)已將其納入推薦的抗驚厥藥物開發(fā)計劃(Anticonvulsant Drug Development，ADD)[9]。

2 6 Hz模型制作和特征

2.1 制作方法

Toman等首次設(shè)計的6 Hz模型是采用角膜電極，施加頻率6 Hz，電流強度50 μA，脈沖寬度1 ms的刺激，持續(xù)時間3 s[10]。Barton等[8]于2001年重新研究該模型，使用7種已確定的AEDs和5種第二代AEDs對電流強度進行改進。該研究在CF1品系小鼠中建立，使用Grass S48刺激器刺激角膜，固定頻率6 Hz，脈沖寬度0.2 ms，持續(xù)時間3 s。在放置角膜電極之前，將0.5%的丁卡因和0.9%的鹽水滴入小鼠的眼睛，刺激后立即手動限制和釋放動物，觀察是否存在癲癇發(fā)作活動。通過概率計算97%的實驗對象產(chǎn)生癲癇發(fā)作的電流強度(CC97)為22 mA，此時6 Hz刺激并不能區(qū)分所測試的AEDs的臨床類型。增加電流強度為1.5× CC97即32 mA時，可降低6 Hz模型對PHT和拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)的敏感性。當電流強度為2× CC97即44 mA時，只有LEV和丙戊酸(valproic acid，VPA)對刺激顯示出完全的保護作用，但是這些藥物的療效與較低刺激強度時相比有所降低。Barton等的研究開啟了6 Hz模型的新紀元，此后，模型制作方法根據(jù)研究需求不斷發(fā)展改善。

目前，6 Hz模型制作方法大體相同，多采用NMR1小鼠，CF1小鼠和Swiss albino小鼠作為研究對象。首先使用含麻醉劑的生理鹽水浸泡角膜刺激電極，或刺激前在動物眼部滴加麻醉劑和生理鹽水，以誘導局部麻醉，并確保良好的傳導性。然后將電極完全接觸眼部進行角膜刺激，大多以固定頻率6 Hz，脈沖寬度0.2 ms，持續(xù)時間3 s刺激實驗動物，使用1.5× CC97和2× CC97的電流強度誘發(fā)癲癇。電刺激時束縛小鼠，每次刺激結(jié)束后立即放開觀察記錄行為學情況。動物完全點燃需長期刺激，一般每天進行兩次，每次刺激之間至少間隔4 h，連續(xù)3周[11-12]。因為NMR1和CF1小鼠在國內(nèi)并不常見，陸海美等[13]采用國內(nèi)常用的C57BL/6J與 ICR 小鼠構(gòu)建模型。該團隊認為44 mA刺激下C57BL/6J小鼠造模成功率最高，且耐藥性更強，更適合6 Hz模型的建立，這項研究為6 Hz模型在國內(nèi)的應(yīng)用提供了新思路。

2.2 模型特征

在點燃過程開始時，小鼠表現(xiàn)出一系列行為變化，包括刻板行為，斯特勞布舉尾反應(yīng)，有時還有輕微的肌陣攣。此外，小鼠還表現(xiàn)出社交障礙，學習和記憶能力受到嚴重損害。一般根據(jù)Racine量表[14]觀察判斷動物點燃情況， 經(jīng)過幾天的刺激后，大約50%～60%的小鼠開始出現(xiàn)第二次全身性驚厥(階段3-5)，當顯示至少連續(xù)10次繼發(fā)性全身性驚厥時，判斷小鼠被充分點燃。小鼠達到完全點燃狀態(tài)后，通過每周兩次每日刺激維持這種狀態(tài)[11]。除行為學外，小鼠腦電圖和腦組織也發(fā)生變化，小鼠在6 Hz誘導的癲癇發(fā)作過程中, 腦電圖出現(xiàn)明顯的癲癇樣放電。利用免疫組化還發(fā)現(xiàn) C57BL/6J-44 mA 組完全點燃的小鼠海馬 GFAP 標記的膠質(zhì)細胞激活明顯增加, 其為顳葉癲癇的特征病理標志之一[13]。

值得注意的是，Leclercq和Kaminski[15]研究認為小鼠遺傳背景和實驗條件對于不同AEDs在6 Hz模型中的敏感性有影響，模型制作方法和模型中AEDs的初始觀察應(yīng)當考慮小鼠品系和實驗條件。

3 致癇機制

3.1 腦內(nèi)葡萄糖的攝取和利用

腦組織幾乎完全依賴葡萄糖為能源，腦區(qū)14C-2-脫氧葡萄糖(14C-2-deoxyglucose, 2-DG)攝取的評估可作為腦葡萄糖利用和區(qū)域功能活動的指標。Gray等[16]通過放射自顯影技術(shù)量化腦區(qū)2-DG攝入分布，評估6 Hz模型動物的腦內(nèi)代謝活動。研究發(fā)現(xiàn)，6 Hz刺激后大腦皮質(zhì)區(qū)、外側(cè)杏仁核和尾殼核中2-DG攝取顯著增加，大腦皮層的不同功能區(qū)域，如運動、感覺和邊緣區(qū)域被非選擇性激活。然而，2-DG攝取的增加并不均勻，這表明在細胞微電路水平上，對與癲癇發(fā)作相關(guān)的功能活動的改變有一定的選擇性。其他許多大腦區(qū)域不受刺激的影響，包括海馬結(jié)構(gòu)、杏仁核、丘腦和下丘腦的內(nèi)側(cè)核，在激活和未激活的區(qū)域之間存在非常清晰的邊界，表明特定的通路參與了癲癇的發(fā)生和傳播。6 Hz刺激后，實驗動物不同腦區(qū)營養(yǎng)物質(zhì)攝入和利用受到影響，從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝活動，誘發(fā)癲癇發(fā)作。

3.2 MAPK信號通路

6 Hz刺激可能通過影響MAPK信號通路，參與癲癇發(fā)生發(fā)展。c-Fos是參與細胞外刺激后細胞增殖和分化的早期反應(yīng)基因，可作為神經(jīng)活動的標記物，并且與急性刺激后的神經(jīng)和行為反應(yīng)有關(guān)[17]，p38MAPK通路可通過激活c-Fos誘導細胞凋亡。Barton等[8]通過c-Fos免疫定位發(fā)現(xiàn)22 mA和32 mA刺激時染色局限于杏仁核和梨狀皮質(zhì)，但海馬、丘腦和下丘腦Fos蛋白水平?jīng)]有升高。而44 mA刺激時，梨狀皮質(zhì)、杏仁核和齒狀回立即出現(xiàn)c-Fos水平升高，梨狀皮質(zhì)反應(yīng)最強。近期也有研究發(fā)現(xiàn)，6 Hz刺激可增強視覺、海馬旁和運動皮質(zhì)及邊緣系統(tǒng)的c-Fos免疫反應(yīng)性，而完全點燃的小鼠眼眶皮質(zhì)中的Fos蛋白減少[18]，該結(jié)果與Barton等的類似研究高度一致，闡明了6 Hz刺激后大腦的激活過程。Barton的研究認為海馬并未參與大腦的活動過程，Carmela等[19-20]改進模型，使用重復4次的6 Hz刺激對此進行了探索。該團隊首先使用FosB/ΔFoSB作為神經(jīng)元激活標記物，刺激后海馬和海馬旁皮質(zhì)FosB/ΔFoSB免疫反應(yīng)性增強，但沒有神經(jīng)元損傷或炎癥發(fā)生。然后，該團隊又使用p-ERK1/2作為標記物進一步驗證，ERK1/2信號通路是最早發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑。角膜刺激后整個海馬特別是CA1區(qū)的p-ERK1/2免疫反應(yīng)逐漸增加，絕大多數(shù)p-ERK1/2免疫陽性細胞與FosB/ΔFoSB抗體共同標記，表明在癲癇激活的神經(jīng)元亞群中兩者之間存在關(guān)系，p-ERK1/2的表達變化明確說明6 Hz模型中海馬區(qū)域參與癲癇發(fā)作的加重過程。

3.3 神經(jīng)遞質(zhì)

已知在癲癇發(fā)作中起作用的主要神經(jīng)遞質(zhì)是谷氨酸(glutamate, Glu)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)、乙酰膽堿(acetylcholine, Ach)、去甲腎上腺素(noradrenaline, NA)、多巴胺(dopamine, DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)[21-22]。Glu和谷氨酰胺循環(huán)是大腦中Glu保持平衡的一個重要機制，谷氨酰胺合成酶缺失，細胞內(nèi)及胞外Glu水平升高，癇性發(fā)作時Glu蓄積作用于受體和離子通道，使突觸過度興奮，從而誘發(fā)癇性發(fā)作[23]。有研究將8種離子型Glu受體拮抗劑和8種代謝型Glu受體調(diào)節(jié)劑作用于6 Hz模型，刺激時Glu增高，誘發(fā)癲癇發(fā)作，所有被測試的化合物產(chǎn)生劑量依賴性的保護作用[24]。此外，6 Hz刺激可降低小鼠腦中內(nèi)源性5-HT、DA、NA和GABA水平，增高Glu水平，這種神經(jīng)遞質(zhì)的改變可由VPA恢復[25]。Kausar等[26]使用DSP-4研究NA在6 Hz模型中的作用，DSP-4可誘導小鼠腦內(nèi)NA耗竭，增加小鼠精神運動性驚厥的易感性，說明腦內(nèi)低NA含量可加重6 Hz小鼠的癲癇發(fā)作。上述研究說明，6 Hz刺激可能對實驗動物腦組織產(chǎn)生影響，導致神經(jīng)遞質(zhì)變化，誘發(fā)癲癇發(fā)作。

4 應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 AEDs篩選

近年來，6 Hz模型在AEDs的篩選中得到廣泛應(yīng)用，被納入NIH推薦的ADD計劃。由于6 Hz模型對電壓門控Na+通道的經(jīng)典調(diào)節(jié)劑反應(yīng)性差，而MES模型有利于篩選Na+通道調(diào)節(jié)劑，兩者結(jié)合使用可用來篩選新的AEDs[9,27]。目前，已使用6 Hz模型篩選出一批具有潛在抗癲癇作用的化合物，如表1所示。

表1 6 Hz模型篩選的潛在抗癲癇藥物Table 1 Potential antiepileptic drugs screened by 6 Hz corneal kindling seizure model

4.2 已上市AEDs評估

6 Hz模型也用來評估已上市藥物，研究已上市AEDs的聯(lián)合應(yīng)用，由于該模型對LEV具有敏感性，LEV與其他AEDs的聯(lián)合使用研究最多。LEV與PHT、VPA、CZP、卡馬西平(carbamazepine, CBZ)、托吡酯(topiramate, TPM)、氨己烯酸(vigabatrin, VGT)、奧卡西平(oxcarbazepine, OXC)和噻加賓(tiagabine, TGB)以一定比例聯(lián)合使用在6 Hz模型中具有協(xié)同作用[37-38]。此外，拉考酰胺(lacosamide, LCM)與CBZ、LTG、LEV、TPM和加巴噴丁(gabapentin, GBP)的聯(lián)合應(yīng)用在6 Hz模型中同樣具有協(xié)同作用[39]。提示可以使用6 Hz模型評估已上市AEDs，尋找耐藥性癲癇的新療法。

4.3 其他應(yīng)用

除篩選新型AEDs和評估已上市AEDs外，6 Hz模型還有其他應(yīng)用。在6 Hz模型中，小鼠產(chǎn)生癲癇的電流強度對正常飲食喂養(yǎng)小鼠的體重不敏感，因此，6 Hz模型可以用來評估體重為混雜影響因素的抗驚厥方案[40]。此外，6 Hz模型小鼠表現(xiàn)出異常的行為表型，小鼠極度活躍，不會產(chǎn)生類似焦慮的行為，但快感缺失，有社交障礙，學習和記憶能力也受到嚴重損害。因此，6 Hz模型也可以用來模擬一些神經(jīng)行為合并癥，研究癲癇的嚴重并發(fā)癥[18]。

5 模型優(yōu)缺點

6 Hz模型通過角膜電刺激造模，制作簡單，耗時短，點燃后腦內(nèi)異常癇性放電持續(xù)時間長。比起化學點燃模型，電點燃可避免外來物質(zhì)的相互作用對后續(xù)實驗的影響，并且有助于發(fā)作閾值的測定。但是，造模過程中電刺激過大易導致實驗動物死亡，且作為一個急性模型，6 Hz模型不能很好的反應(yīng)導致耐藥癲癇治療失敗的慢性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和神經(jīng)細胞的改變[34]。該模型雖已成功使用小鼠造模，并應(yīng)用于各種AEDs，但在大鼠中極少建立類似的模型[41]。對于給定的電流強度，6 Hz角膜刺激后小鼠和大鼠癲癇發(fā)作的程度和性質(zhì)并不相同[42]。應(yīng)當通過模擬小鼠造模方式研究大鼠模型，完善6 Hz模型體系，彌補小鼠造模的缺陷。

6 結(jié)語

耐藥是臨床上癲癇防治的重大課題，6 Hz角膜點燃癲癇模型對多種AEDs產(chǎn)生抵抗，在行為學、腦電圖和病理改變上與人類耐藥性癲癇表型極為相似，是一種優(yōu)良的耐藥性癲癇模型，已被NIH納入推薦為癲癇治療篩選的必備模型。然而，目前對6 Hz模型構(gòu)建方法有待完善，發(fā)病機制研究較少，評估標準缺乏。因此，未來需深入系統(tǒng)優(yōu)化造模方案、探究模型病理機理、建立動物模型標準，為探究耐藥性癲癇發(fā)病機制和開發(fā)新的AEDs提供應(yīng)用基礎(chǔ)和保障。