衛(wèi)兵艷，樊林花，劉茂林，軒瑞晶，劉田福

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是以血糖升高為主要特征的代謝綜合征，長期持續(xù)的高血糖會引發(fā)多種并發(fā)癥，當高血糖累及腎微血管時，出現(xiàn)糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)，DN是導致DM患者出現(xiàn)慢性腎功能衰竭(chronic renal failure， CRF)的最主要原因，也是導致DM患者死亡的首要原因之一[1]。 據(jù)報道，DM患者每年約有10%死于CRF[2]。DN在早期治療效果較好，一旦錯過最佳治療時間，將會由大量尿蛋白而發(fā)展至尿毒癥(uremia)、CRF以至危及患者的生命。故早期診斷DN、明確其發(fā)病機制對于預防和治療DN有很重要的臨床意義。

層粘連蛋白(laminin，LN)是一種非膠原糖蛋白，表達區(qū)域集中在腎小球系膜基質(zhì)區(qū)。有研究發(fā)現(xiàn)DM患者還未出現(xiàn)腎病表現(xiàn)時，尿LN就有升高，出現(xiàn)腎病時有明顯升高[3]。因此，檢測尿LN有助于DN的診斷。周脂素(perilipin，Plin)也稱脂滴相關蛋白，與胰島素抵抗及脂代謝異常有密切的關系，其在DM大鼠的肝臟中表達增高[4]，而目前就Plin在DN中研究尚未見報道。本實驗通過制作DN大鼠模型，觀察尿LN對早期DN的診斷價值，同時重點研究Plin在DN模型中的表達情況，為進一步明確DN發(fā)病機制尋找新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠14只，8～10周齡，體重(200 ± 20)g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心【SCXK(晉)2015-0001】，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級環(huán)境中【SYXK(晉)2015-0001】。實驗操作過程中符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：IACUC2018-002)。

1.1.2 試劑及儀器

高糖高脂飼料(北京科澳力飼料有限公司，D12450B)，鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ, Sigma，S0130)，考馬斯亮藍染料(Bio-Rad，1610786)，尿LN ELISA 試劑盒(Nanjing Senbeijia Biotechnology Co. Ltd.，G01012078)，EastepTMSuper Total RNA Extraction Kit(Promega，LS1040)，GoScript Reverse Transcription Mix Oligo(dT)(Promega，A2790)，GoTaq Gpcr Master Mix(Promega，A6002)，Plin抗體(Abcam，ab66514)，Plin及β-actin引物由大連TaKaRa 公司合成。

熒光定量PCR儀(QuantStudio 6 Flex，ABI，美國)，酶標儀(Epoch，BioTek，美國)，血糖儀及試紙(ACCU-CHEK，Roche，美國)，顯微鏡(BX51，Olympus，日本)，化學發(fā)光成像儀(G-Box，Chemi XX9, Syngene，英國),麻醉機(I-21025 Comerio，Ugo Basile S.R.L，意大利)。

1.2 方法

1.2.1 制作DN大鼠模型

配置1%的STZ溶液：稱取1 g的STZ溶于100 mL新配制的0.2% 構椽酸鹽緩沖液中,充分溶解后待用。

14只雄性SD大鼠進行隨機分組，對照組6只，喂飼普通維持飼料，模型組8只，喂飼高糖高脂飼料，在SPF環(huán)境持續(xù)飼養(yǎng)28 d，于第28天晚上7點開始空食，12 h后模型組腹腔注射1% STZ(30 mg/kg)，對照組腹腔注射等劑量構椽酸鹽緩沖液。2 d后刺尾使用血糖試紙檢測血糖，血糖值≥ 16.7 mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀的即DM大鼠模型制作成功。繼續(xù)維持飼養(yǎng)42 d，并監(jiān)測24 h尿蛋白(每周1次)，當24 h尿蛋白≥30 mg/kg，即DN大鼠模型制作成功。

1.2.2 尿液相關指標的檢測

從第5周開始，每周固定留取一次24 h尿標本，記錄每次尿量，然后取5 mL，離心后，取上清測量尿蛋白?？瞻坠芗?0 μL蒸餾水、標準管加50 μL標準蛋白、樣品管加50 μL的上清，每孔再各加3 mL 考馬斯亮藍 (Coomassie brilliant blue, CBB)，靜置5～10 min，595 nm測吸光度值。根據(jù)公式計算：尿蛋白濃度=(樣品管吸光度值/標準管吸光度值)×標準蛋白濃度。

尿LN測定：設空白孔、標準孔、樣品孔；標準品按倍比稀釋后各加50 μL，取50 μL尿液上清加入樣品孔；封板膜封板后，37℃，30 min；揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加350 μL洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干；每孔加酶標試劑50 μL，37℃，30 min；棄液，加350 μL洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干；加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光，10 min；加終止液50 μL(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)；15 min以內(nèi)酶標儀上空白孔調(diào)零，450 nm波長測OD值；根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

1.2.3 腎組織的處理

每只鼠稱重后，2.5%異氟烷面罩吸入麻醉，仰面固定，剪開腹部，摘下左右兩腎。所有大鼠均選左側(cè)腎進行稱量，記錄重量，之后放入裝有4%中性甲醛離心管中進行固定，48 h后進行石蠟包埋，切片，HE染色。右腎投入液氮灌中凍存，用于后續(xù)的RNA和蛋白提取。

1.2.4 Real-time PCR檢測腎組織Plin mRNA水平的表達

依照EastepTMSuper Total RNA Extraction Kit說明，取凍存腎皮質(zhì)約20 mg，提取RNA，酶標儀上檢測RNA的濃度計純度后，按照GoScript Reverse Transcription Mix Oligo (dT)說明進行反轉(zhuǎn)錄。最后按照GoTaq Gpcr Master Mix的說明進行qPCR，每個樣本重復3次。所用Plin引物為：Forward primer：5,-CGAGTCACAACCCCACGAT-3,Reverse primer:5,-TCAGCCCAGAGAGGAA-3,。反應體系：Forward / Reverse primer 0.4 μL、RNA 2 μL、Mix 10 μL、CXR 0.2 μL、ddH2O 7 μL，總體積 20 μL。反應條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60℃15 s，95℃15 s。

1.2.5 Western blot 檢測腎組織中Plin蛋白的表達

提取腎組織總蛋白，BCA 法定量，加入loading buffer后煮蛋白變性，進行SDS-PAGE電泳，之后進行濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后洗膜，封閉，一抗孵育過夜(4℃，80 r/min)，二抗孵育1 h(80 r/min)，PBST洗3次膜之后進行顯影。DAB顯色劑顯影，ImageJ軟件對WB條帶定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重、腎重、腎重/體重的結(jié)果

將每只大鼠的腎重量和體重進行比值發(fā)現(xiàn)：模型組的腎重/體重明顯高于對照組的大鼠，差異有顯著性(P< 0.05)。另外，對比對照組，模型組的大鼠體重明顯降低，差異有顯著性(P< 0.05)，結(jié)果見表1。

2.2 兩組大鼠的尿量、24 h尿蛋白以及尿?qū)诱尺B蛋白的變化情況

通過對比發(fā)現(xiàn)：相比對照組，在第5周時，模型組的尿量和尿LN已經(jīng)明顯升高，差異有顯著性(P< 0.05)，24 h尿蛋白在6周時開始出現(xiàn)明顯增高，差異有顯著性(P<0.05)。并且，尿中的這三項指標隨時間推移都呈上升趨勢，結(jié)果見表2，圖1。

表1 兩組大鼠體重、腎重及腎重/體重的結(jié)果Table 1 Body weight, kidney weight and kidney-to-body weight ratios of the two rat

注：和對照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05.

表2 兩組大鼠尿量、層粘連蛋白、尿蛋白的變化情況Table 2 Changes of urine volume, laminin and protein content in the two rat groups

注：和對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05，**P< 0.01。

圖1 兩組大鼠的尿量、尿?qū)诱尺B蛋白以及24 h尿蛋白的變化Figure 1 Changes in urine volume,laminin and 24-hour urinary protein levels in the two rat groups

2.3 腎病理改變

HE染色結(jié)果顯示:模型組大鼠腎出現(xiàn)典型的病理改變，腎小球肥大,系膜增生，有微小血管瘤形成。腎小管管腔變形，管腔內(nèi)散在有脫落的上皮細胞，間質(zhì)內(nèi)有纖維組織增生，還可見單核、淋巴等炎癥細胞浸潤，見圖2。

圖2 大鼠腎組織的病理改變(×200) Figure 2 Pathological changes of kidney tissues (H&E staining, ×200)

2.4 腎組織Plin mRNA的檢測結(jié)果

模型組腎組織Plin的mRNA表達明顯升高，是對照組的(3.26 ± 0.37)倍，差異有顯著性(P< 0.05)，見圖 3。

圖3 大鼠腎Plin的qPCR檢測結(jié)果Figure 3 Expression of Plin mRNA in the rat kidneys detected by qPCR

2.5 兩組大鼠腎組織Plin蛋白Western blot檢測結(jié)果

模型組Plin蛋白表達明顯升高，是對照組的(2.98 ± 0.59)倍，差異有顯著性(P<0.05)，見圖 4。

圖4 兩組大鼠腎組織Plin蛋白表達情況Figure 4 Expression of Plin protein in the rat kidneys

3 討論

糖尿病腎病作為引起終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)主要病因[5]，對人類生命健康構成了很大的威脅。其主要病理改變特點是微血管內(nèi)皮細胞損傷導致基膜增厚，血管阻塞引起組織缺氧，繼而腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化，最終導致CRF。其發(fā)病機制也較復雜，涉及腎小球血流動力學改變、生化代謝紊亂、氧化應激、細胞因子與遺傳易感性等多種因素,但其確切的發(fā)病機制尚未能完全闡明[6]。

對于DN大鼠模型的制作，目前最常使用單側(cè)腎動脈結(jié)扎+高糖高脂飼料喂養(yǎng) +小劑量STZ腹腔注射的三聯(lián)法[7]，該方法造模時間短，但有創(chuàng)傷性，手術本身對大鼠的發(fā)病過程存在影響。本研究通過高糖、高脂飼料誘導大鼠的胰島素出現(xiàn)抵抗，再給予小劑量SZT破壞胰島細胞，這樣就可以達到僅出現(xiàn)胰島素分泌障礙，而不是不分泌胰島素的目的，很好的模擬了II型DM的發(fā)病過程[8]。在此基礎上持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)使其病變繼續(xù)發(fā)展，直至出現(xiàn)腎損害，達到DN病變。很好的模擬了DN的發(fā)生發(fā)展過程，但造模周期較長。造模結(jié)果顯示DN組大鼠的腎重/體重比明顯增高，24 h尿蛋白增高，HE染色出現(xiàn)典型的病理改變等，證明模型制作成功。

尿?qū)诱尺B蛋白是ECM的主要成分，在腎小球間質(zhì)纖維化中表達增高[3]，實驗結(jié)果顯示模型組大鼠的尿LN增高比尿蛋白出現(xiàn)早，且隨時間的推移不斷升高。LN的分子量為900×103，屬于大分子物質(zhì)，DN早期腎小球濾過率增加，LN排除增加，且DM持續(xù)的高血糖刺激腎血管上皮細胞合成LN增多[9]，DN早期LN增高的原因在于腎排除及合成LN增多。因此，尿LN能較早的反應DN腎ECM的變化，對DN的早期診斷有很好的警示作用。

Plin包被在細胞脂滴表面，對脂肪調(diào)節(jié)具有雙重作用，主要通過雙向調(diào)節(jié)脂滴內(nèi)中性脂肪的水解來實現(xiàn)細胞內(nèi)脂質(zhì)的平衡：當細胞需要能量供應時，促進中性脂肪水解，能量充足時，則抑制脂肪水解，防止因過量脂肪酸堆積而引起脂毒性損傷[10]。另外，雌激素也能通過抑制Plin來減少肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積[11]。糖脂代謝異常往往相伴發(fā)生，故越來越多的學者開始研究Plin在糖代謝方面的作用，在糖代謝異常大鼠模型的肝臟組織中Plin表達增高，其可能促進了糖代謝異常合并非酒精性脂肪肝的發(fā)生[12]。在小鼠糖耐量模型中，Plin能夠降低心臟的氧化應激反應進而使微血管內(nèi)皮細胞的凋亡率降低[13]。這些研究結(jié)果提示Plin可能在DM 的并發(fā)癥DN中也發(fā)揮著一定的作用，故本實驗通過對DN模型大鼠腎組織Plin表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，Plin的mRNA及蛋白表達均有明顯的增加，說明DN的發(fā)生和Plin的高表達有關，詳細機制還需要做進一步的研究。