(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

“遺傳學(xué)”課程是高等農(nóng)林院校生物科學(xué)、生物技術(shù)、林學(xué)、草業(yè)科學(xué)、園藝以及自然保護區(qū)等專業(yè)的核心主干課程之一，是一門重要的專業(yè)必修課程。隨著分子遺傳學(xué)和生物技術(shù)的快速發(fā)展與進步，基因工程、基因組學(xué)以及基因的表達與調(diào)控等內(nèi)容均已寫入高等農(nóng)林院校本科專業(yè)的“遺傳學(xué)”課程教材中，有實驗條件的高校也已將基因工程、DNA聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”課程實驗教學(xué)中，唯獨缺少從細胞遺傳學(xué)過渡到分子遺傳學(xué)的連接橋梁和紐帶的分子細胞遺傳學(xué)。這種相對有缺陷的課程教學(xué)內(nèi)容體系，不僅影響“遺傳學(xué)”課程知識體系的構(gòu)建，也不利于推動分子細胞遺傳學(xué)研究的進步。其中，以熒光原位雜交(FISH)為代表的分子細胞遺傳學(xué)實驗技術(shù)在染色體精準識別、染色體作圖、染色體畸變、物種進化以及功能基因定位等方面發(fā)揮了重要作用。因此，將分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入本科生“遺傳學(xué)”課程教學(xué)中就顯得非常必要。

一、分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容長期未納入高等農(nóng)林院?！斑z傳學(xué)”本科課程教學(xué)的原因

細胞遺傳學(xué)是“遺傳學(xué)”課程與細胞學(xué)有機結(jié)合而建立的一門遺傳學(xué)分支科學(xué)，是從細胞學(xué)的角度，特別是從染色體的結(jié)構(gòu)和功能、染色體與其他細胞的相互關(guān)系來研究生物遺傳變異規(guī)律的科學(xué)。而分子細胞遺傳學(xué)是分子生物學(xué)實驗技術(shù)與細胞遺傳學(xué)相結(jié)合而建立的另一門遺傳學(xué)分支科學(xué)，其主要在分子層面上進行細胞遺傳學(xué)研究。與經(jīng)典細胞遺傳學(xué)相比，分子細胞遺傳學(xué)的研究范圍更為廣泛，涵蓋了染色體生物學(xué)的各方面內(nèi)容以及分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。

目前，分子細胞遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域主要包括染色體與細胞核的結(jié)構(gòu)和功能、基因組變異、基因表達和進化、染色體畸變以及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和腫瘤遺傳學(xué)中的基因組變異等。通過分子細胞遺傳學(xué)研究，可以將看不見摸不著的抽象基因定位在染色體上，從而實現(xiàn)染色體物理圖譜的繪制。自20世紀80年代以來，盡管分子細胞遺傳學(xué)實驗技術(shù)取得了飛速發(fā)展，但有關(guān)分子細胞遺傳學(xué)的內(nèi)容一直未寫入高等農(nóng)林院校本科生的“遺傳學(xué)”課程教材中。究其原因，筆者認為主要與當(dāng)時分子細胞遺傳學(xué)的相關(guān)理論和技術(shù)難題未攻克有關(guān)。

(一)分子細胞遺傳學(xué)缺乏相對獨立的理論體系

原位雜交是分子細胞遺傳學(xué)研究的核心技術(shù)和手段，其基本原理是利用核酸分子單鏈之間互補堿基序列，將有放射性或非放射性標記的外源核酸單鏈(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或核糖核酸(RNA)單鏈進行互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。從上述定義可以看出，核酸原位雜交最基本的原理是利用核酸鏈間的堿基互補配對原則，即分子遺傳學(xué)中的查爾格佛(E.Chargaff)定則。因此，諸多學(xué)者對分子細胞遺傳學(xué)的地位提出了質(zhì)疑，甚至有的學(xué)者認為因其缺乏相對獨立的理論體系，分子細胞遺傳學(xué)不能稱為遺傳學(xué)的一門分支科學(xué)，原位雜交亦僅僅是一項技術(shù)而已。

(二)原位雜交技術(shù)作為分子細胞遺傳學(xué)研究的核心技術(shù)存在局限性

原位雜交技術(shù)的起源可追溯到20世紀60年代末期，Gall等[1]以攜帶放射性標記的非洲爪蟾核糖體基因為探針，與其卵母細胞染色體進行雜交，首次實現(xiàn)了核糖體基因的染色體定位，標志著放射性原位雜交技術(shù)的誕生。由于放射性標記存在安全隱患，危險性大，Rayburn等[2]以更為安全的生物素取代放射性同位素進行探針標記，與小麥體細胞染色體進行雜交，獲得了小麥特異DNA序列在染色體上的準確位置。生物素?zé)晒鈽擞浱结樔〈派湫酝凰貥擞浱结槼晒?yīng)用于原位雜交，促進了熒光原位雜交技術(shù)(FISH)的快速發(fā)展[3]。

20世紀80年代，熒光原位雜交技術(shù)進入快速發(fā)展時期。由于研究目的多樣化，研究人員對熒光原位雜交技術(shù)進行改良，產(chǎn)生了一系列改良型熒光原位雜交技術(shù)。Durnam等[4]以核基因組為探針進行原位雜交，辨別體細胞內(nèi)異源染色體，發(fā)展了基因組原位雜交(GISH)技術(shù)。Nederlof等[5]利用不同的熒光素標記探針，同時定位了不同探針靶序列在染色體上的分布，建立了多色熒光原位雜交體系(M-FISH)。但由于中期染色體高度凝縮，致使高分辨率染色體物理圖譜的構(gòu)建幾無可能。為了克服中期染色體高度凝縮這一缺陷，促使以間期細胞為研究對象的纖維熒光原位雜交技術(shù)(Fiber-FISH)的產(chǎn)生，顯著提高了染色體圖譜的分辨率[6]。21世紀初，隨著人工合成染色體技術(shù)的興起，使植物單條染色體作圖成為可能。Lysak等[7]以人工合成細菌單條染色體為探針，與擬南芥染色體進行熒光原位雜交，發(fā)展了細菌人工染色體熒光原位雜交(BAC-FISH)技術(shù)，實現(xiàn)了植物單條染色體作圖。

近年來，隨著基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，部分植物種，如擬南芥、水稻、楊樹以及葡萄等物種基因組測序工作的完成，科學(xué)家可以根據(jù)物種的單條染色體序列，將染色體DNA序列設(shè)計為覆蓋整條染色體的寡核苷酸短鏈，通過PCR擴增后，制備成寡核苷酸(Oligos)探針，與染色體進行雜交，從而獲得高分辨率的染色體圖譜。Han等[8]首次利用該技術(shù)對黃瓜的3號和7號染色體進行了作圖研究。該方法最大的優(yōu)勢就是可以根據(jù)研究需要，對任何染色體或片段進行人工設(shè)計，缺點是受制于是否有基因組序列。

綜上所述，盡管原位雜交技術(shù)取得了長足進步，但其不同發(fā)展階段的技術(shù)自身存在一定的局限性，故此農(nóng)林高等院校在確定“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容時只能選擇放棄。

二、分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入高等農(nóng)林院?！斑z傳學(xué)”本科課程教學(xué)的必要性

目前，隨著熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展，植物細胞遺傳學(xué)研究取得了突破性進展。但由于染色體形態(tài)差異，導(dǎo)致小染色體物種難以開展分子細胞遺傳學(xué)研究，因此部分植物種的分子細胞遺傳學(xué)研究不能代表植物細胞遺傳學(xué)的全部。盡管如此，筆者仍然認為有必要盡快將分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入到高等農(nóng)林院校相關(guān)專業(yè)的“遺傳學(xué)”課程教學(xué)中。

(一)納入分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容是遺傳學(xué)構(gòu)建完整知識體系的客觀需要

我國高等農(nóng)林院校現(xiàn)行《遺傳學(xué)》教材，大多包括遺傳的細胞學(xué)基礎(chǔ)、遺傳物質(zhì)的分子基礎(chǔ)、孟德爾遺傳、連鎖遺傳和性連鎖、基因突變、染色體畸變、數(shù)量性狀的遺傳、細菌和病毒的遺傳、細胞質(zhì)遺傳、基因工程、基因組學(xué)、基因的表達與調(diào)控、遺傳與發(fā)育、群體遺傳與進化等內(nèi)容[9]，唯獨缺少分子細胞遺傳學(xué)的內(nèi)容。這種不完整的“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容，顯然不利于學(xué)生系統(tǒng)地學(xué)習(xí)遺傳學(xué)知識。因此，以熒光原位雜交技術(shù)為核心的分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容不應(yīng)被忽視，而應(yīng)納入到高等農(nóng)林院校本科生的“遺傳學(xué)”課程教學(xué)中，這有助于學(xué)生構(gòu)建完整的遺傳學(xué)知識體系，促進遺傳學(xué)的發(fā)展。

(二)分子細胞遺傳學(xué)在遺傳學(xué)研究中具有舉足輕重的地位

染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體，攜帶有控制生物性狀發(fā)育所需要的全部基因。因此，精確識別每一條染色體，獲得精準的核型分析圖是開展染色體生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的染色體制片和核型分析技術(shù)促進了染色體生物學(xué)的快速發(fā)展。但這些傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)技術(shù)均存在一定的局限性，導(dǎo)致從形態(tài)上難以準確區(qū)分每一條染色體，特別是對于染色體小且數(shù)目多的物種而言，這種局限性猶為明顯。熒光原位雜交技術(shù)是在傳統(tǒng)染色體技術(shù)上發(fā)展起來的，是傳統(tǒng)細胞遺傳學(xué)實驗技術(shù)的拓展與補充，可以彌補傳統(tǒng)技術(shù)的不足。王坤波[10]以基因組DNA和核糖體DNA(rDNA)為探針，利用熒光原位雜交技術(shù)對棉屬21個種進行了核型分析，并對4個四倍體棉花種的親緣關(guān)系進行鑒定。佘朝文[11]將顯帶技術(shù)和熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合起來，對花生進行了核型分析，建立了花生的核型公式為：2n=4x=40=38m+2sm(SAT)，核型不對稱類型屬于2A型。熒光原位雜交技術(shù)在植物中的廣泛應(yīng)用，使其在繼顯帶技術(shù)后，成為核型分析又一重要工具，促進了植物細胞遺傳學(xué)的快速發(fā)展。

1953年，沃森(J.D.Watson)和克里克(F.Crick)提出了著名的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，標志著分子遺傳學(xué)的誕生?；虻母拍钜矎慕?jīng)典“孟德爾遺傳因子”發(fā)展至現(xiàn)代遺傳學(xué)的基因概念，即基因是染色體上可轉(zhuǎn)錄一條完整RNA分子，或編碼一條多肽鏈的一段DNA序列。因此，基因既看不見又摸不著，更感覺不到它的存在，顯得十分抽象。利用已知序列的熒光標記探針與染色體雜交可確定基因在染色體上的物理位置，從而構(gòu)建染色體物理圖譜。張新新[12]利用熒光原位雜交技術(shù)和原位PCR技術(shù)，將巴西橡膠樹乳膠合成相關(guān)的4個基因HMGR1、HbRT1、HbCPT、HCPT-3分別定位在3、6、9、10號染色體上。盡管這種物理圖譜的分辨率相對偏低，要求兩個分子標記之間至少相距1 000 kb才可以成功定位，但仍然對于植物的分子輔助育種和比較基因組學(xué)研究有重要意義。張永泰[13]對蕓薹屬基本種進行物理圖譜繪制，并根據(jù)定位信息分析探針序列在植物基因組中的進化趨勢，為種屬間的基因組進化關(guān)系研究提供了重要信息。

基因工程是將外源基因?qū)肷锘蚪M中，改良生物性狀的有效技術(shù)和手段。常用的轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法包括PCR檢測和Southern、Northern以及Western雜交。這些傳統(tǒng)的分子生物學(xué)檢測方法可以從不同水平檢測目的基因是否整合至核基因組并是否進行了性狀表達，但均不能確定目的基因插入至染色體的具體位置。有關(guān)研究表明，轉(zhuǎn)化植株性狀遺傳定性與轉(zhuǎn)入目的基因表達以及插入位置密切相關(guān)。另外，外源基因的插入位置也不是完全隨機的，其優(yōu)先插入到染色體的遠端區(qū)[14]。因此，精準確定目的基因在染色體上的位置顯得尤其重要。由于目的基因序列已知，因此以目的基因為探針，利用熒光原位雜交技術(shù)，不僅可以檢測外源基因是否導(dǎo)入核基因組，還可以直觀地觀察到外源基因在染色體上的位置[15]。金危危等[16]利用熒光原位雜交技術(shù)成功對水稻轉(zhuǎn)基因植株進行鑒定，發(fā)現(xiàn)外源基因成功導(dǎo)入核基因組，并將Barnase-ps1基因定位在8個株系的10條染色體臂上，因此熒光原位雜交技術(shù)可作為轉(zhuǎn)基因生物鑒定的一種既準確又高效的檢測方法。熒光原位雜交等分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)在染色體識別和核型分析、染色體物理圖譜繪制、比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物外源基因鑒定等方面具有重要作用，應(yīng)引起科技工作者的高度重視。

三、將分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”本科課程教學(xué)的實施建議

基于我國高等農(nóng)林院校現(xiàn)行“遺傳學(xué)”課程教材缺少分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容的事實，筆者就在農(nóng)林院?！斑z傳學(xué)”課程教學(xué)中增加分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容提出如下建議。

首先，將以熒光原位雜交技術(shù)為代表的分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”課程教學(xué)，構(gòu)建涵蓋孟德爾經(jīng)典遺傳學(xué)、細胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)、分子細胞遺傳學(xué)、數(shù)量遺傳學(xué)以及群體遺傳學(xué)等學(xué)科的完整“遺傳學(xué)”課程知識體系。

其次，優(yōu)化整合“遺傳學(xué)”課程實驗教學(xué)內(nèi)容，引入“植物根尖材料的收集、預(yù)處理與固定”“植物根尖細胞染色體制片”“切口平移法制備45S rDNA分子探針”“植物熒光原位雜交與信號檢測”等實驗。

四、將分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容納入“遺傳學(xué)”本科課程教學(xué)的意義

筆者將分子細胞遺傳學(xué)納入“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容后，彌補了《遺傳學(xué)》教材缺少分子細胞遺傳學(xué)內(nèi)容的缺憾，豐富了“遺傳學(xué)”課程教學(xué)內(nèi)容，構(gòu)建了更為完整的遺傳學(xué)知識體系，促進了知識的融會貫通，強化了創(chuàng)新意識，提高了創(chuàng)新能力。

開設(shè)“植物根尖材料的收集、預(yù)處理與固定”“植物根尖細胞染色體制片”“切口平移法制備45S rDNA分子探針”“植物熒光原位雜交與信號檢測”等實驗，不僅優(yōu)化了“遺傳學(xué)”課程實驗資源，而且還將相對孤立的實驗整合為一個整體，使“遺傳學(xué)”課程實驗既包含了細胞遺傳學(xué)內(nèi)容又包含了分子遺傳學(xué)內(nèi)容，保證了實驗內(nèi)容的系統(tǒng)性和完整性。

資助項目：北京林業(yè)大學(xué)2018年教改項目“熒光原位雜交納入本科遺傳學(xué)實驗教學(xué)的探索與實踐”，項目編號BJFU2018JY045。