蘇杰 馬春梅 邵宏超 楊馥宇 劉巖 葛嫣然

自噬是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器，并將其包裹進(jìn)囊泡，與溶酶體形成自噬溶酶體，對(duì)包被物進(jìn)行降解的過(guò)程[1-2]。自噬調(diào)控機(jī)制的異?？蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生發(fā)展，甚至誘發(fā)癌變[3-4]。研究指出，高遷移率族蛋白1(high mobility group protein 1，HMGB1)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并有證據(jù)表明其與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的浸潤(rùn)及自噬相關(guān)[5]。miR-34a已被證實(shí)與肝癌相關(guān)，能降低肝癌細(xì)胞的惡性行為，可作為潛在的抗腫瘤治療靶點(diǎn)[6]。但對(duì)于miR-34a如何調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬鮮有報(bào)道。因此本研究通過(guò)測(cè)定HMGB1及miR-34a的表達(dá)，探討HMGB1與miR-34a調(diào)節(jié)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤Y79細(xì)胞系(深圳豪地華拓生物)，胎牛血清、Opti-MEMⅠ培養(yǎng)液、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，慢病毒載體系統(tǒng)(中國(guó)吉?jiǎng)P基因公司)，miR-34a、HMGB1慢病毒包裝系統(tǒng)(廣州復(fù)能基因公司)，Trizol裂解液(美國(guó)Thermo公司)，磷酸化綠色熒光蛋白-LC3質(zhì)粒由廣州華韻生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成；高純度質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，miR-34a的RT-PCR試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)；Attune NxT流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo公司)，熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Lavisin Biotec公司)，Multiskan Go酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，CM-120透射電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組Y79細(xì)胞株細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，呈團(tuán)片狀，孵育細(xì)胞覆蓋達(dá)到培養(yǎng)瓶的80%以上時(shí)傳代。吸棄舊培養(yǎng)液，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Y79細(xì)胞，使用PBS緩沖液漂洗1次，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞間隙變寬。使用3 mL無(wú)菌巴氏管輕柔吹打細(xì)胞，離心，去上清，加入新的培養(yǎng)液置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d傳代1次。分組：取處于對(duì)數(shù)期的Y79細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，將轉(zhuǎn)染miR-34a的慢病毒載體、轉(zhuǎn)染HMGB1載體及共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1的慢病毒載體及培養(yǎng)液接種至Y79細(xì)胞。按照接種載體分組，將Y79細(xì)胞株分為4組，分別為轉(zhuǎn)染miR-34a組、轉(zhuǎn)染HMGB1組、共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組及陰性對(duì)照組。

1.2.2miR-34a慢病毒載體的構(gòu)建及cDNA轉(zhuǎn)染獲取的人miR-34a序列，從Genbank中查閱HMGB1的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成miR-34a及HMGB1前體引物，采用PCR方法擴(kuò)增含miR-34a及HMGB1前體片段，并克隆至慢病毒載體系統(tǒng)。將帶有miR-34a及HMGB1前體的片段轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞。將4×105mL-1細(xì)胞加注于96孔板中，用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為90%～95%，在Opti-MEMⅠ中加入0.9 μg DNA，在另外培養(yǎng)孔中加入2.0 μL 胎牛血清，室溫下孵育5 min，將兩種試劑混合均勻后共孵育20 min后移至細(xì)胞培養(yǎng)板，并置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的環(huán)境中孵育24 h?？偡磻?yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄條件設(shè)為42 ℃，20 min；98 ℃，5 min；4 ℃，5 min，最后將cDNA儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。

1.2.3細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR檢測(cè)miR-34a的表達(dá)人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤總RNA提取，加入Trizol溶液裂解人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤RNA，應(yīng)用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行分析。取總RNA 4 μL，80 ℃水浴5 min，加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，44 ℃孵育72 min終止，留取產(chǎn)物待用。本研究所使用siRNA序列為miR-34a：上游引物5’-CAACAGAAGGCTCGAGCCTCCTGCATCCTTCTTC-3’，下游引物5’-ATTCTGATCAGGATCCTGGAGCTCACTTTCCCAG-3’；以GAPDH為對(duì)照：上游引物5’-TAAAGGAACCAGAATCCTGGTCCGGTGT-3’，下游引物5’-CTC-GTTGTCATCTGGCAGGACCGTGTTA-3’。擴(kuò)增參數(shù)，95 ℃ 9.8 min，60 ℃ 48 s，73 ℃延伸50 s，72 ℃最終延伸10 min，10 ℃保存。基因表達(dá)分析采用2-△△Ct法測(cè)定相對(duì)含量，將GAPDH設(shè)為內(nèi)參，取Ct值?！鰿t=Ct目的基因-CtGAPDH；△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對(duì)照組。

1.2.4Caspase3活性檢測(cè)取處于對(duì)數(shù)期的Y79細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)基中，每孔加5×103個(gè)細(xì)胞，孵育72 h后，利用Capase3檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase3活性，以酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)405 nm處的吸光度(absorbance，A)值表示活性變化，每份樣品檢測(cè)6次，取平均值。

1.2.5流式細(xì)胞儀定量分析自噬的單丹磺酰尸胺陽(yáng)性細(xì)胞率取4組對(duì)數(shù)期Y79細(xì)胞，密度為4×105mL-1接種于6孔板，用含miR-34a的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，用含50 μmol·L-1單丹磺酰尸胺(monodansyl cadaverin，MDC)的新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2環(huán)境中孵育15 min，PBS洗滌兩次后加500 μL PBS上機(jī)，上機(jī)前使細(xì)胞混勻懸浮呈單個(gè)細(xì)胞，插入流式細(xì)胞儀，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定MDC陽(yáng)性細(xì)胞染色的熒光強(qiáng)度。

1.2.6透射電孔子顯微鏡下觀察自噬超微結(jié)構(gòu)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Y79細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，陰性對(duì)照組使用RPMI-1640培養(yǎng)液，其余3組使用miR-34a RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，1000 r·min-1離心5 min，后將細(xì)胞收集于離心管中，加入戊二醛液，1000 r·min-1離心10 min，靜止30 min，送電鏡室，經(jīng)脫水、浸透、固化、切片，30 g·L-1醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后采用CM-120透射電子顯微鏡觀察并拍片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-34a轉(zhuǎn)染及效果miR-34a轉(zhuǎn)染Y79細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，轉(zhuǎn)染率達(dá)到87%，且細(xì)胞狀態(tài)良好。轉(zhuǎn)染72 h后，RT-PCR測(cè)定各組miR-34a及HMGB1的mRNA水平。轉(zhuǎn)染miR-34a組的miR-34a表達(dá)水平(2.04±0.46)明顯高于陰性對(duì)照組(1.03±0.21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組HMGB1(0.42±0.08)的表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染HMGB1組(1.08±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察(×200)。A：陰性對(duì)照組明視野；B：陰性對(duì)照組熒光顯色；C：轉(zhuǎn)染miR-34a組明視野；D：轉(zhuǎn)染miR-34a組熒光顯色；E：轉(zhuǎn)染HMBG1組明視野；F：轉(zhuǎn)染HMBG1組熒光顯色；G：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMBG1組明視野；H：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMBG1組熒光顯色

2.2Caspase3活性檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞培養(yǎng)72 h，利用Caspase3 試劑盒檢測(cè)四組Caspase3活性，四組Caspase3活性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.983，P=0.002)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a 組Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)[(10.75±2.87)個(gè)·mm-2]明顯高于陰性對(duì)照組[(3.48±0.74)個(gè)·mm-2]，轉(zhuǎn)染HMGB1組Caspase3陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)[(2.46±0.94)個(gè)·mm-2]明顯低于共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組[(6.21±1.74)個(gè)·mm-2]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

2.3熒光顯微鏡下Y79細(xì)胞MDC染色情況不同處理組細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)液處理Y79細(xì)胞72 h后，MDC染色增強(qiáng)，熒光顆粒呈點(diǎn)狀分布在自噬泡附近區(qū)域，由圖2中染色可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染miR-34a組可見(jiàn)MDC陽(yáng)性顆粒明顯增多，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組次之，陰性對(duì)照組可見(jiàn)極少量MDC陽(yáng)性熒光顆粒，轉(zhuǎn)染HMGB1組陽(yáng)性顆粒最少(圖2)。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDC陽(yáng)性率流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理組Y79細(xì)胞MDC陽(yáng)性率，四組72 h后Y79細(xì)胞陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=102.480，P<0.05)，miR-34a組MDC陽(yáng)性率(56.94%)明顯高于陰性對(duì)照組(2.15%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組MDC陽(yáng)性率(43.11%)明顯高于轉(zhuǎn)染HMGB1組(10.32%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.5透射電子顯微鏡下觀察各組細(xì)胞自噬超微結(jié)構(gòu)透射電子顯微鏡下觀察不同處理組自噬在Y79細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)改變，可見(jiàn)陰性對(duì)照組72 h瘤細(xì)胞形態(tài)基本無(wú)改變，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)染miR-34a組可見(jiàn)自噬溶酶體結(jié)構(gòu)(圖4)。

圖2Y79細(xì)胞MDC染色情況。A：轉(zhuǎn)染miR-34a組；B：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組；C：陰性對(duì)照組；D：轉(zhuǎn)染HMGB1組

圖3流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組MDC陽(yáng)性率。A：陰性對(duì)照組；B：轉(zhuǎn)染HMGB1組；C：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組；D：轉(zhuǎn)染miR-34a組

圖4透射電子顯微鏡觀察不同處理組自噬超微結(jié)構(gòu)(×400)。A：陰性對(duì)照組；B：共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組；C：轉(zhuǎn)染miR-34a組(紅色箭頭：自噬溶酶體；白色箭頭：殘留的消化底物)

3討論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤，目前臨床主要的治療方法有眼球摘除、化療及放療，然而以上治療方式對(duì)患者影響較大，對(duì)患者的生活造成極大的不便[7-8]?；蛑委熥鳛橐环N新的治療方式目前尚處于研究探索階段[9]，miR-34家族是一類高度保守的miRNA，主要有miR-34a、miR-34b、miR-34c三種。其中miR-34a主要在腦內(nèi)表達(dá)，季青山等[10]研究表明，在腫瘤細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)量明顯下降。有研究指出，miR-34a是p53介導(dǎo)的抗腫瘤過(guò)程中重要環(huán)節(jié)，p53可激活miR-34a發(fā)揮抗腫瘤作用，而miR-34a可通過(guò)正反饋上調(diào)p53增強(qiáng)抗腫瘤作用[11]。HMGB1具有穩(wěn)定染色質(zhì)及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的功能，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，敲除HMGB1后，幼鼠很快死亡[12]。并有報(bào)道指出，在多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)HMGB1與腫瘤的發(fā)展及浸潤(rùn)存在聯(lián)系，抑制HMGB1通路可有效抑制細(xì)胞增殖及侵襲[13]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，自噬在腫瘤治療中可發(fā)揮重要作用，自噬能清除細(xì)胞內(nèi)的致癌物質(zhì)及受損的細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、清除細(xì)胞垃圾，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及代謝[14-15]。既往研究指出，細(xì)胞自噬功能的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系，腫瘤細(xì)胞的自噬能力低于正常組織細(xì)胞[16]，這提示，細(xì)胞自噬能力的降低可能對(duì)腫瘤的發(fā)展有利。miR-34a正反饋?zhàn)饔门c細(xì)胞自噬作用均具有抗腫瘤作用，目前國(guó)內(nèi)外已有利用兩種途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究[17-18]，但兩者對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的研究較少，且miR-34a對(duì)自噬功能是否具有調(diào)節(jié)作用的報(bào)道也較少。因此，本研究通過(guò)miR-34a及HMGB1轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，觀察其對(duì)自噬的影響并探討其機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示：RT-PCR檢測(cè)miR-34a的轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染miR-34a后，miR-34a的表達(dá)明顯升高，高于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1后，miR-34a表達(dá)下降。Caspase3是一種蛋白酶，其是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的剪切酶，同時(shí)也是CTL細(xì)胞殺傷的重要組成部分[19]。Caspase3活性檢測(cè)顯示：轉(zhuǎn)染miR-34a組Caspase3活性最高，轉(zhuǎn)染HMGB1組活性最低，而共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1后Caspase3活性呈上升趨勢(shì)，提示轉(zhuǎn)染HMGB1后可降低Caspase3的活性，增強(qiáng)腫瘤的浸潤(rùn)及發(fā)展。通過(guò)本研究結(jié)果可以得出，轉(zhuǎn)染miR-34a可提高機(jī)體對(duì)腫瘤的抑制作用，miR-34a可能通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)提高抗腫瘤活性。

MDC是一種可在分子水平檢測(cè)自噬發(fā)生情況的方法，其在細(xì)胞內(nèi)可被細(xì)胞中酸性成分結(jié)合并聚集在自噬囊膜周圍，因此可根據(jù)MDC的熒光強(qiáng)度及熒光顆粒的數(shù)量分析自噬的活化情況[20-21]。本研究中，通過(guò)熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測(cè)MDC，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a組可見(jiàn)MDC陽(yáng)性顆粒明顯增多，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組次之，陰性對(duì)照組可見(jiàn)極少量MDC陽(yáng)性熒光顆粒，轉(zhuǎn)染HMGB1組最少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-34a組MDC陽(yáng)性率明顯高于其余三組，轉(zhuǎn)染HMGB1組MDC陽(yáng)性率最低，共轉(zhuǎn)染組居中。這提示，miR-34a可提高細(xì)胞自噬能力，其在體內(nèi)發(fā)揮作用的途徑可能通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組自噬泡未見(jiàn)明顯改變，共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組自噬泡的出現(xiàn)早于Y79細(xì)胞核的改變并出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)，miR-34a轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)自噬溶酶體囊膜，說(shuō)明miR-34a可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生自噬，該結(jié)果與Wu等[20]研究結(jié)果一致，同樣與本研究流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果相符。

綜上所述，本研究結(jié)果表明通過(guò)上調(diào)miR-34a能夠降低視母細(xì)胞瘤的增殖，并通過(guò)觀察HMGB1轉(zhuǎn)染情況，推測(cè)miR-34a在體內(nèi)可能通過(guò)抑制HMGB1的表達(dá)提高細(xì)胞的自噬能力，從而提高抗腫瘤作用，也為我們以后制定抗腫瘤方案提供有力的理論基礎(chǔ)。