易禮智，程征宇，王 琴，徐 輝

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上最常見(jiàn)惡性腫瘤之一[1]，也是我國(guó)第四常見(jiàn)的惡性腫瘤，其引起的死亡率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[2]。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是CRC患者死亡的主要原因。盡管隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，近年來(lái)結(jié)直腸癌的臨床診斷和治療方法及藥物研究有了很大的進(jìn)步，但CRC的長(zhǎng)期生存率并未明顯提升[3]。因此，探討結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制仍具有重要的意義。泛素特異性蛋白酶18 (Ubiquitin-specific peptidase 18，USPl8)是干擾素激活基因15(interferon(IFN)-stimulated gene 15，ISG15)的一個(gè)特異性蛋白酶，同時(shí)也是與ISG15結(jié)合的一個(gè)至關(guān)重要的調(diào)節(jié)蛋白[4]。最近有研究[5-7]顯示，USP18的表達(dá)在一些腫瘤如膀胱癌、乙肝病毒相關(guān)的肝細(xì)胞癌等里面異常的異常升高可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。本文研究USP18在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義，期望能為臨床結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)及治療策略。

1材料與方法

1.1材料 收集某人民醫(yī)院手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸癌的石蠟組織標(biāo)本114例，其中男性72例，女性42例；年齡26～76歲，平均年齡53.8歲。另外收集40對(duì)新鮮的結(jié)直腸癌組織和癌旁正常腸黏膜組織置于液氮中保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA裂解液(Trizol)及熒光定量PCR試劑購(gòu)自Takara公司，BCA法蛋白定量試劑盒及PVDF膜購(gòu)自Pierce公司，ECL發(fā)光液購(gòu)自凱基生物公司，兔抗人USP18抗體、β-actin鼠抗人單克隆抗體、及鼠、兔二抗均購(gòu)自proteintech公司，SP二步法試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1蛋白免疫印跡法 提取組織蛋白并測(cè)濃度后，取等量的總蛋白變性后經(jīng)10%SDS．PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫下用5%的封閉血清BSA封閉1 小時(shí)，兔抗人USP18抗體(1:300)、β-actin鼠抗人單克隆抗體(1:1000)稀釋，4℃孵育過(guò)夜，次日用含0.1% 吐溫的TBS(PBST)緩沖液漂洗5 分鐘，重復(fù)三次，加入抗兔或抗鼠(1:10000)二抗，室溫孵育1小時(shí)，PBS-T漂洗5 分鐘，重復(fù)三次后常規(guī)顯色發(fā)光。

1.2.2實(shí)時(shí)定量PCR 采用Trizol裂解組織后，提取RNA并測(cè)濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。引物序列：USP18上游 5'-CCTGAGGCAAATCTGTCAGTC- 3' 和 5'-CGAACACCTGAATCAAGGAG TTA-3'；GAPDH 上游 5'-GTCCACCAC CCTG TTGCTGTA-3'、下游：5'-CTTCAACA GC GACACCCACTC-3'。GADPH基因作為參照基因。PCR反應(yīng)體系20ul，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 分鐘，95℃變性 10秒，58℃退火40秒，72℃延伸 30秒，共40個(gè)循環(huán)。導(dǎo)出PCR目的基因和參照基因的Ct值，計(jì)算2-ΔΔCt值進(jìn)行相對(duì)定量。2-ΔΔCt值越大，說(shuō)明該基因的表達(dá)量越高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3免疫組化 石蠟組織連續(xù)切片后，經(jīng)脫蠟脫水后，檸檬酸高溫高壓5 分鐘進(jìn)行抗原修復(fù)，依次孵育一抗和二抗，DAB顯色。USP18以細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)顯微鏡下腫瘤細(xì)胞的染色范圍分為4個(gè)等級(jí)：0分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%；1分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%；2分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%；依據(jù)對(duì)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)定，0分：無(wú)著色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。兩者計(jì)分的乘積作為染色結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：陰性(-)：0分；弱陽(yáng)性(+)：1～4分；陽(yáng)性(++)：5～8分；強(qiáng)陽(yáng)性(+++)：9～12分。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分析采用SPSS20．0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，USP18的表達(dá)水平和臨床病理相關(guān)資料的相關(guān)性采用Wilcoxon Signed Ranks檢驗(yàn)分析和Spearman相關(guān)分析。

2結(jié) 果

2.1在新鮮結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) 在40例新鮮的結(jié)直腸癌組織中，mRNA水平上，有26例CRC組織中USP18蛋白的表達(dá)顯著高于正常黏膜組織，14例低于正常黏膜組織(圖1A)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：CRC組織中USP18的表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)量(P=0.006)(圖1B)。蛋白水平上，在8例配對(duì)組織中，有7例CRC組織中USP18蛋白的表達(dá)顯著高于正常黏膜組織，1例低于正常黏膜組織(圖1C)。

圖1：USP18在40對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織mRNA水平(圖A: N:正常組織，T：癌組織，圖B：*P=0.006)和8對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織中蛋白檢測(cè) (圖C: β-Actin為內(nèi)參)

2.2在結(jié)直腸癌石蠟組織中的表達(dá)情況 USP18的表達(dá)定位于胞漿與胞核，在結(jié)直腸癌組織中，USP18 的表達(dá)率為95.7%%，癌旁正常黏膜組織中的表達(dá)率為25.3%，結(jié)直腸癌組織中USP18的表達(dá)要明顯高于癌旁正常粘膜組織(圖2)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.876，P<0.001)。

2.3結(jié)直腸癌組織中USP18蛋白表達(dá)及臨床病理參數(shù)的關(guān)系 分析結(jié)果顯示：癌組織中USP18表達(dá)的高低與腫瘤分化程度、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，均P<0.05，而與腫瘤患者的性別、年齡、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)，P>0.05。見(jiàn)表1。

圖2USP18 在正常組織和癌組織的表達(dá)(A圖：正常組織40X10倍，B圖：癌組織，40X10倍)。

參數(shù)例數(shù)高表達(dá)低表達(dá)Pλ2年齡0.3430.899<6030219>=60846618性別87270.1631.944男725814女422913分化程度0.00112.487高41347中503713低23167是否遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移0.0404.197否795623是35314淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.0039.002是58526否563521浸潤(rùn)深度0.3051.469累及全層28199未累及全層866818

3討 論

本文主要探討了USP18在結(jié)直腸癌新鮮組織及石蠟組織中的表達(dá)情況。USPl8位于染色體22q11.2，是一種泛素特異性蛋白酶，也是類泛素干擾素刺激基因15(ISGl5)[8, 9]。USP18在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路中起著很重要的作用，包括p53相關(guān)細(xì)胞的存活，NF-κB的活性等，USPl8的增加，會(huì)使信號(hào)處理途徑、細(xì)胞增殖異常，胸腺T細(xì)胞凋亡。因此，USP18與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展也是密切相關(guān)的。目前關(guān)于USP18在腫瘤中的作用報(bào)道較少,僅見(jiàn)于少數(shù)幾種腫瘤如乙肝病毒相關(guān)的膀胱癌[6]、肝細(xì)胞癌[7]、黑色素瘤[10]、乳腺癌[11]、腎癌[12]和前列腺癌[13]等。而在結(jié)直腸癌中尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究首先檢測(cè)了USP18在40例配對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織中的mRNA水平及8例配對(duì)新鮮結(jié)直腸癌組織中的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，USP18在結(jié)直腸癌組織中的mRNA及蛋白水平均明顯高于正常組織。而后我們?cè)?14例配對(duì)結(jié)直腸癌石蠟組織中檢測(cè)了USP18的表達(dá)情況。結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)要明顯高于癌旁正常粘膜組織。結(jié)合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，USP18的表達(dá)與分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與腫瘤患者的性別、年齡、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)。這表明結(jié)直腸癌組織中USP18的升高可能與結(jié)直腸癌的增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究報(bào)道[14]顯示USP18在白血病的潛伏期和發(fā)展期有重要的調(diào)節(jié)作用[14]；乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中USP18的缺失可以誘導(dǎo)由化療和干擾素α(IFN-α)引起的凋亡的增加[15]；沉默USP18，同樣也能引起膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡的增加[16]；敲低USP18后，可以直接導(dǎo)致急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)細(xì)胞增殖降低和凋亡增加，可以作為治療APL的一個(gè)臨床抗腫瘤治療靶點(diǎn)[17]。這些報(bào)道都說(shuō)明USP18與腫瘤的增殖及發(fā)展有密切的關(guān)系。在機(jī)制方面，目前有研究報(bào)道[18,19]稱USP18影響腫瘤的發(fā)展主要是通過(guò)調(diào)控干擾素信號(hào)通路，因?yàn)镮FNs可以抑制蛋白質(zhì)ISGylation從而在抗腫瘤應(yīng)答中起重要作用。另有研究報(bào)道[11]顯示USPl8基因的缺失能夠抑制腫瘤活性，可以通過(guò)上調(diào)Cxcr3配體來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，尤其是CxcllO；USPl8還可以調(diào)控CD4+T細(xì)胞的抗腫瘤作用[20]；活化的UBP43酶可以直接影響細(xì)胞周期蛋白D1的穩(wěn)定性：敲除UBP43可以抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。在后續(xù)的研究中，我們將著重研究USP18促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和增殖的分子機(jī)制及其在臨床治療中的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，USP18在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示USP18可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。本研究為結(jié)直腸癌的治療提供一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。