趙鑫 常穎 劉玉俠 王寶 盧衛(wèi)平 王啟文

(1吉林省腫瘤醫(yī)院 ，吉林 長(zhǎng)春 130012；2吉林省腫瘤防治研究所)

肺癌在我國(guó)已經(jīng)成為常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率居高不下，其常規(guī)治療方法有手術(shù)、化療、放療等，但治療后有許多病人會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，其原因與化療、放療后機(jī)體的免疫功能下降有關(guān)。針對(duì)這一現(xiàn)狀，對(duì)放化療后患者提高免疫力進(jìn)行預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)就顯得尤為重要。如何提高免疫力，預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，目前的研究已經(jīng)證明樹(shù)突細(xì)胞(DCs)、細(xì)胞因子活化的殺傷細(xì)胞(CIK)、自然殺傷細(xì)胞(NKs)、γδT細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)提高機(jī)體的免疫功能發(fā)揮著重要作用。而近年來(lái)的研究證實(shí)，γδT細(xì)胞在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。眾所周知，體內(nèi)起主要作用的抗腫瘤細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞。T細(xì)胞根據(jù)表面抗原受體(TCR)的不同分為αβT細(xì)胞及γδT細(xì)胞。在機(jī)體內(nèi)，αβT細(xì)胞主要通過(guò)主要組織相溶性抗原(MHC)限制性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，參與獲得性免疫，使其應(yīng)用受限。而γδT細(xì)胞是一種介于獲得性免疫與天然免疫之間的細(xì)胞，其功能不受MHC限制，不依賴于抗原的處理和遞呈過(guò)程，所以近年來(lái)對(duì)其研究較多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用抗人TCR γ/δ聯(lián)合白細(xì)胞介素(IL)-2及唑來(lái)膦酸聯(lián)合IL-2兩種方法進(jìn)行γδT的體外誘導(dǎo)擴(kuò)增，并對(duì)肺癌細(xì)胞A549進(jìn)行體外殺傷實(shí)驗(yàn)，為γδT細(xì)胞的研究和用于肺癌的治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料 IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司， 噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)：美國(guó)Sigma公司，胎牛血清：Hyclone公司；IL-2：北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司；淋巴細(xì)胞分離液：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所；唑來(lái)膦酸：深圳海王藥業(yè)有限公司；抗人TCRγ/δ，PE標(biāo)記的抗人TCRγ/δ克隆B1:Biolegend公司。 生物倒置顯微鏡(Olympus)：日本；低溫低速離心機(jī)(SORVALL RTT)：美國(guó)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀：Labsystems Dragon；超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；HERA CEEL 240iCO2培養(yǎng)箱，Thermo Scientific公司；流式細(xì)胞儀，BD公司。肺癌細(xì)胞A549：購(gòu)于上海生物細(xì)胞研究所。

1.2方法

1.2.1人外周血γδT細(xì)胞的體外誘導(dǎo)、培養(yǎng)、鑒定 抽取健康志愿者外周血，用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血淋巴細(xì)胞，計(jì)細(xì)胞數(shù)為1×106/ml,加至100 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)。誘導(dǎo)方法1：取1瓶以上分離的細(xì)胞，加入抗人TCRγ/δ 0.4 μg/ml,IL-2 300 IU/ml,放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，每3天半量補(bǔ)加抗人TCRγ/δ、IL-2等細(xì)胞因子并換液，培養(yǎng)至第6天時(shí)，用流式細(xì)胞儀對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行γ/δT細(xì)胞表型鑒定及殺傷活性實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)方法2：另取1瓶分離的細(xì)胞，加入唑來(lái)膦酸10 μmol/L,IL-2 500 IU/ml,培養(yǎng)方法同1。取以上抗人TCRγ/δ加IL-2及唑來(lái)膦酸加IL-2的細(xì)胞進(jìn)行γ/δT細(xì)胞表型鑒定。方法：分別取以上培養(yǎng)的細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為(5～10)×105/100 μl ，加PE抗人TCRγ/δ 20 μl，冰上孵育15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，最后加PBS 500 μl，混勻，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2γδT殺傷實(shí)驗(yàn)(MTT法) 接種腫瘤細(xì)胞。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μl/孔。將經(jīng)過(guò)兩種方法培養(yǎng)鑒定的γδT細(xì)胞調(diào)細(xì)胞數(shù)為2.5×106/ml,按以下設(shè)計(jì)加入到已經(jīng)接種了A549的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔，每個(gè)樣品設(shè)6復(fù)孔。第1組：抗人TCRγ/δ +IL-2，第2組：抗人TCRγ/δ +IL-2+A 549，第3組：唑來(lái)膦酸+IL-2，第4組：唑來(lái)膦酸+IL-2+A549，第5組：A549。以上細(xì)胞培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h加MTT(5 mg/ml) 20 μl/孔，培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清，每孔加150 μl DMSO，震蕩混勻，在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。殺傷活性計(jì)算方法：殺傷活性=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞OD值)×100%/靶細(xì)胞OD值×100%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

抗人TCRγ/δ聯(lián)合IL-2誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞表達(dá)率為62.10%，對(duì)A549的殺傷活性為82.47%；唑來(lái)膦酸聯(lián)合IL-2誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞表達(dá)率達(dá)61.50%，對(duì)A549的殺傷活性為81.09%，兩組細(xì)胞表達(dá)率及對(duì)A549的殺傷活性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

3 討 論

肺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位均居惡性腫瘤之首。雖然肺癌早期通過(guò)手術(shù)治療可以取得較好的治療效果，甚至部分患者通過(guò)手術(shù)切除后可以達(dá)到治愈。但是因?yàn)榉伟┏跗跓o(wú)明顯癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已處于晚期，使其治療效果和預(yù)后較差。在肺癌患者中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例總數(shù)的80%〔1〕，NSCLC根據(jù)病理類型可分為肺鱗癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌等，其中肺腺癌占NSCLC的大多數(shù)。對(duì)于晚期患者，多數(shù)已不適合手術(shù)，只能采取化療、放療等方法治療，或者是手術(shù)后需要進(jìn)行化療、放療等后續(xù)治療，但是這些治療會(huì)使患者的免疫功能遭受打擊，使免疫功能明顯下降，導(dǎo)致治療不能順利進(jìn)行，影響效果。

免疫治療作為腫瘤治療的方法之一，目前在腫瘤的治療中發(fā)揮著一定作用。在免疫治療過(guò)程中，免疫細(xì)胞可以直接參與殺傷腫瘤細(xì)胞及通過(guò)分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α等具有殺傷活性的細(xì)胞因子進(jìn)行抗腫瘤反應(yīng)，還可以通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)提高機(jī)體免疫力達(dá)到主動(dòng)抗腫瘤的效果，因此在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著重要作用〔2〕。目前已有多種免疫細(xì)胞用于惡性腫瘤的治療，在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。

眾所周知，T淋巴細(xì)胞是主要的抗腫瘤細(xì)胞。γδT細(xì)胞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種功能強(qiáng)大的T淋巴細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)具有殺傷和調(diào)節(jié)雙重作用〔3〕，同時(shí)維護(hù)機(jī)體的免疫平衡，所以在腫瘤的綜合治療中發(fā)揮著非常重要作用，在抗感染等方面也發(fā)揮著重要作用〔4，5〕。在抗腫瘤過(guò)程中，γδT細(xì)胞能夠以MHC非限制性地方形式特異性識(shí)別腫瘤抗原，作為抗原提呈細(xì)胞(APC)起到抗原遞呈作用，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，并通過(guò)分泌IL-2、TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)等細(xì)胞因子促進(jìn)其他免疫細(xì)胞的活化〔6〕，對(duì)腫瘤細(xì)胞直接殺傷。另外，γδT細(xì)胞還能與其他多種免疫細(xì)胞相互作用，激發(fā)這些細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，γδT細(xì)胞能殺傷多種自體腫瘤細(xì)胞或異基因來(lái)源的腫瘤細(xì)胞系，而不會(huì)影響正常細(xì)胞的功能〔7～9〕。但是由于γδT細(xì)胞在外周血中所占比例較少，只有1%～10%〔10〕，使其研究和應(yīng)用得到限制。如何獲得較多數(shù)量的γδT細(xì)胞，對(duì)其功能進(jìn)行深入研究成為首要解決的問(wèn)題〔11〕。

唑來(lái)膦酸是雙磷酸鹽類藥物，臨床上主要用于腫瘤患者如乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、胃癌等多種實(shí)體瘤化療后引起的骨轉(zhuǎn)移和高鈣血癥的治療〔12〕。研究發(fā)現(xiàn)唑來(lái)膦酸還能活化人外周血γδT細(xì)胞〔13〕，它既能促進(jìn)γδT細(xì)胞的生長(zhǎng)，也能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)〔14,15〕,而且與其他誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的化學(xué)試劑相比，其價(jià)格要低很多。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)其特性，用其聯(lián)合IL-2培養(yǎng)誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞與用γδT CR聯(lián)合IL-2誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞進(jìn)行比較，兩種誘導(dǎo)方法無(wú)論是在表達(dá)率還是殺傷活性方面沒(méi)有明顯差異，為γδT細(xì)胞的擴(kuò)增及應(yīng)用提供了經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法。