張威，孟令峰，劉曉東，王佳文，張耀光

(北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學(xué)中心泌尿外科， 北京 100730)

間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征(interstitial cystitis，IC/bladder pain syndrome，BPS)是國際公認(rèn)的診療十分困難的下尿路功能障礙相關(guān)性疾病之一。國際尿控組織與歐洲泌尿外科協(xié)會(huì)提出：IC/BPS與真正的膀胱炎性疾病不同，應(yīng)被歸類為一種慢性疼痛綜合征，是一種與膀胱相關(guān)的疼痛、壓力或不適，至少伴有一種泌尿系統(tǒng)癥狀，例如沒有大量液體攝入的情況下出現(xiàn)的尿頻，或者持續(xù)的尿意感[1]。國內(nèi)外學(xué)者建立了多種IC/BPS動(dòng)物模型，其中嚙齒類動(dòng)物的建模周期短，表現(xiàn)穩(wěn)定，操作簡單，花費(fèi)少，是國內(nèi)外IC/BPS研究的首選[2]。由于IC/BPS不存在標(biāo)準(zhǔn)的病理變化,因此沒有公認(rèn)的造模標(biāo)準(zhǔn)。各類動(dòng)物模型大多表現(xiàn)IC/BPS的一種或幾種表型，哪種模型的表型最全面、最適合用作研究，目前尚無定論。本文對(duì)嚙齒類動(dòng)物中最常用的大鼠模型進(jìn)行了綜述。

1 大鼠IC/BPS模型分類

IC/BPS模型的造模方式主要分為三類：膀胱內(nèi)途徑模型、膀胱外途徑模型和聯(lián)合途徑模型。膀胱內(nèi)途徑模型是通過膀胱內(nèi)灌注的方式，利用灌注物對(duì)于膀胱直接的物理、化學(xué)或者生物性作用，使其產(chǎn)生特定的病理變化；膀胱外途徑模型是通過全身或局部用藥的方式，利用藥物本身或者代謝產(chǎn)物作用于動(dòng)物，引起相應(yīng)的病理生理改變；聯(lián)合途徑模型是將膀胱內(nèi)和膀胱外途徑共同作用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行建模。

2 常用造模方法

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠選擇

由于雌性大鼠尿道短，利于膀胱灌注等操作，大鼠品系的選擇一般以SPF級(jí)SD雌性大鼠為主，偶爾采用白化Wistar大鼠、F344大鼠[3]。研究表明[4]雌激素與IC/BPS的發(fā)病相關(guān)，因此多選擇6 ～ 8周、已性成熟的大鼠。體重一般為200 ～ 250 g。實(shí)驗(yàn)鼠一般需適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d ～ 2周，房間控制光照12 h/黑暗12 h，溫度20 ～ 26℃，濕度50% ～ 70%，自由攝食、水。

2.2 膀胱內(nèi)途徑模型

一般是將大鼠麻醉后經(jīng)尿道膀胱置管灌注藥物，保留一段時(shí)間，待充分反應(yīng)后排出。

2.2.1 麻醉方式

主流的麻醉藥物包括：(1)戊巴比妥鈉：濃度3% ～ 5%，劑量0.3 mL/100 g體重，腹腔注射[5]。(2)烏拉坦：濃度20% ～ 25%，劑量0.7 mL/100 g體重，腹腔注射[6]。(3)水合氯醛：濃度10%，劑量0.3 mL/100 g體重，腹腔注射[7]。(4)乙醚：吸入性麻醉，適合時(shí)間短的操作[8]。以上藥物能夠滿足大多數(shù)的麻醉需求，另有鹽酸賽拉嗪+替來他明-唑拉西泮合劑肌肉注射、混合麻醉氣體(氧氣，N20，氟烷)或異氟醚氣體(5%誘導(dǎo)，2%維持)麻醉的方式[9-11]。

2.2.2 膀胱置管方式

麻醉完全后，將大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)。酒精消毒泌尿生殖區(qū)，PE-50導(dǎo)管導(dǎo)尿，200 μL/min膀胱注入試劑，避免注入過快造成膀胱輸尿管返流和試劑溢出，然后拔除導(dǎo)管[12]。灌注時(shí)間達(dá)到后，重新導(dǎo)尿，排空膀胱。

2.2.3 用于誘導(dǎo)的化學(xué)物質(zhì)

(1)硫酸魚精蛋白(protamine sulfate，PS)/脂多糖

PS是一種堿性蛋白，能與強(qiáng)酸性的肝素結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，而膀胱上皮的氨基葡聚糖(glycosaminoglycan，GAG)層富含肝素，因此當(dāng)PS與膀胱上皮接觸后，便可以破壞GAG層，造成上皮細(xì)胞的損傷。脂多糖是革蘭陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素，可通過誘導(dǎo)肥大細(xì)胞的活化等介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。造模時(shí)用量為10 mg/mL PS 1 mL，2 mg/mL脂多糖1 mL，500 mmol/L氯化鉀溶液1 mL，時(shí)間30 ～ 45 min。Li等[13]采用PS+脂多糖造模，模型膀胱組織切片，光鏡下可見GAG層不規(guī)則；掃描電鏡下可見散在潰瘍面；透射電鏡下可見肥大細(xì)胞數(shù)顯著增加。善輝等[6]采用PS+氯化鉀溶液的方法也取得了類似效果。單用PS造模，濃度要求更高[14]。部分學(xué)者在灌注時(shí)或之后用生理鹽水或磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗膀胱，目的是避免不同試劑產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)以及為試劑提供穩(wěn)定的液體環(huán)境[15]。造模周期從1 d到3個(gè)月不等。善輝等[6]應(yīng)用PS+氯化鉀隔日灌注1次的方案，比較造模1、2、3個(gè)月的差異，發(fā)現(xiàn)模型炎癥反應(yīng)的類型與造模時(shí)間相關(guān)，時(shí)間短者多為急性炎癥，隨時(shí)間延長逐漸過渡為慢性炎癥。

(2)透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase，HA)

HA是1種內(nèi)切糖苷酶，可水解透明質(zhì)酸等GAG成分，啟動(dòng)膀胱炎癥進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子-1的促炎癥作用。造模選用4 mg/mL HA 0.5 mL膀胱灌注，時(shí)間30 min，每周3次，周期為1周、2周和4周不等。Lv等[16]將1周和4周組進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩組均有炎癥細(xì)胞增多、排尿頻率增加，但4周組的尿頻癥狀和病理改變更重。呂夷松等[7]采用了2周的造模周期，也獲得成功。

(3)鹽酸

鹽酸屬于無機(jī)一元酸，具有較強(qiáng)腐蝕性，可直接造成膀胱上皮組織的化學(xué)性損傷。用鹽酸制作的動(dòng)物模型顯示出多種IC樣病理生理改變，如上皮剝脫、炎癥因子增加等[17]。0.1 mol/L 鹽酸 200 μL即可造模。Furuta等[3]用鹽酸膀胱灌注4 min，每周1次，共2周，第2次灌注后等待1, 2, 3周和4周分別取病理，發(fā)現(xiàn)：1 ～ 2周時(shí)肥大細(xì)胞數(shù)顯著增加，而2 ～ 4周，膠原纖維表達(dá)顯著增加。Song等[9]用鹽酸造模發(fā)現(xiàn)，模型鼠1周時(shí)排尿間隔縮短，2周后自行恢復(fù)，病理顯示尿路上皮糜爛。

(4)乙酸

乙酸是一種有機(jī)一元酸，水溶液具有腐蝕性，可直接造成膀胱上皮的損傷。Song等[9]用50 μL 3%的乙酸膀胱灌注，結(jié)果表明乙酸造模所致IC相關(guān)變化能夠自行消失，無法持續(xù)。

2.2.4 模型特點(diǎn)

膀胱內(nèi)途徑的造模方式有很多優(yōu)點(diǎn)：膀胱內(nèi)灌注藥物，能夠保證藥物優(yōu)先作用于膀胱，減少全身用藥的副作用及其他器官的損傷；各類造模試劑相對(duì)容易獲得，價(jià)格適中；造模周期靈活，可以滿足多種實(shí)驗(yàn)進(jìn)程需要；PS/脂多糖與HA造模相對(duì)成功的模擬了間質(zhì)性膀胱炎患者中膀胱GAG層損傷的病理變化，且給藥周期越長，與急性炎癥模型的區(qū)別越明顯，是目前國內(nèi)進(jìn)行治療學(xué)研究應(yīng)用最廣泛的造模方法。當(dāng)然，膀胱內(nèi)途徑也有一些無法避免的劣勢：大鼠清醒狀態(tài)下對(duì)于尿道內(nèi)置管無法耐受，因此每次灌注都需要進(jìn)行麻醉，操作相對(duì)繁瑣，多次麻醉，對(duì)于大鼠健康狀態(tài)可能會(huì)有影響；鹽酸和乙酸造模并無明確病理生理學(xué)支持，造模周期短，病損可恢復(fù)，造模周期長，則與急性化學(xué)性膀胱炎的膀胱黏膜損傷表現(xiàn)非常類似。

2.3 膀胱外途徑模型

多采用皮下或腹腔注射藥物的方式。

2.3.1 用于誘導(dǎo)的化學(xué)物質(zhì)

(1)環(huán)磷酰胺

環(huán)磷酰胺是一種化療藥，本身對(duì)膀胱無毒性，腹腔注射后，通過腎臟代謝產(chǎn)生丙烯醛，該物質(zhì)能夠破壞膀胱上皮黏膜屏障，造成炎癥反應(yīng)及疼痛。腹腔注射劑量為40 ～ 150 mg/kg體重[18]。模型鼠膀胱可見慢性炎癥細(xì)胞浸潤及肥大細(xì)胞脫顆粒。李兆飛等[8]對(duì)比了造模4 h、48 h、10 d、30 d、45 d的病理改變，發(fā)現(xiàn)早期改變多為急性炎癥，30 d后才進(jìn)入慢性炎癥期。

(2)尿溶蛋白II(uroplakin II，UPKII)

UPKI、II和III是尿路上皮的整體膜蛋白家族，在膀胱中高表達(dá)，研究證實(shí)UPKII能夠誘導(dǎo)小鼠膀胱發(fā)生特異性自身免疫反應(yīng)和IC相關(guān)炎癥表現(xiàn)，但該模型的疼痛表現(xiàn)并不顯著[19]。因此，Song等[9]將大鼠腹部皮下注射200 μL的等體積PBS和甘油+200 μg UPKII 進(jìn)行造模，3 ～ 7 d觀察到模型大鼠膀胱過度活動(dòng)，2周時(shí)消失，肥大細(xì)胞的改變也類似，IFN-γ等細(xì)胞因子有顯著性差異，病理提示尿路上皮糜爛。如何建立更為接近IC/BPS表型的自身免疫膀胱炎動(dòng)物模型，是將來的熱點(diǎn)。

(3)曲司尼特

曲司尼特是一種新型抗變態(tài)反應(yīng)藥物。臨床偶然發(fā)現(xiàn)其高劑量給藥可以通過抑制血管成纖維細(xì)胞的活性以及增加血管通透性而造成IC樣改變。Nishijima等[20]通過給大鼠飲用含有大劑量曲尼司特懸浮液的水的方式(2 mg/mL，20 mL/d，共4周)建模。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型大鼠膀胱收縮間隔明顯縮短，部分符合IC/BPS的建模要求。

2.3.2 模型特點(diǎn)

膀胱外途徑造模大多通過特定物質(zhì)代謝以及免疫的方式間接作用于泌尿系統(tǒng)，造成IC/BPS相關(guān)臨床及病理改變，相對(duì)于化學(xué)物質(zhì)對(duì)于膀胱的直接損傷更接近IC/BPS可能的自然發(fā)病機(jī)制，多被用于進(jìn)行IC/BPS病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制的研究；給藥途徑多為皮下或腹腔注射甚至飲水投喂，不需麻醉，操作簡單，對(duì)動(dòng)物的全身影響小；環(huán)磷酰胺獲取相對(duì)簡單，儲(chǔ)存方便，造模30 d以上的模型便能夠表現(xiàn)疼痛和膀胱過度活動(dòng)的典型IC/BPS表現(xiàn)，膀胱組織病理也可見明確慢性炎癥細(xì)胞及肥大細(xì)胞浸潤，因此是目前最常用的膀胱外造模藥物；UpkII構(gòu)建了典型的自身免疫模型，對(duì)IC/BPS的免疫學(xué)病因研究更有意義；而曲司尼特造模則更適合于進(jìn)行IC/BPS的血管生成及通透性障礙的研究[21]。但膀胱外途徑的造模藥物造模周期長；UPKII的保存條件非常苛刻；除環(huán)磷酰胺外，UPKII和曲司尼特均價(jià)格昂貴；且UPKII和曲司尼特的模型動(dòng)物表現(xiàn)以膀胱過度活動(dòng)為主，疼痛癥狀缺失，并非完整的IC/BPS模型，應(yīng)用受限。

2.4 聯(lián)合造模途徑

聯(lián)合造模的組合方式基本就是上述的兩種或幾種方式的聯(lián)合應(yīng)用。邵遠(yuǎn)等[10]采用膀胱灌注PS+脂多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺腹腔注射的方式造模，發(fā)現(xiàn)無論從炎癥等級(jí)還是肥大細(xì)胞的浸潤數(shù)目上，聯(lián)合造模組均優(yōu)于其他組。張祥等[22]將環(huán)磷酰胺的劑量增大后發(fā)現(xiàn)：模型鼠中可見明顯的尿路上皮脫落以及黏膜下層的水腫，雖然大鼠的痛覺反應(yīng)并未納入評(píng)估，但研究基本證實(shí)聯(lián)合造模的可行性。因此，以膀胱灌注PS+脂多糖聯(lián)合環(huán)磷酰胺腹腔注射為代表的聯(lián)合造模方式，更加接近IC/BPS的病理生理改變，價(jià)格適中，造模周期相對(duì)穩(wěn)定，操作簡單，實(shí)用性強(qiáng)，值得在治療學(xué)研究方面推廣應(yīng)用。

3 IC/BPS動(dòng)物實(shí)驗(yàn)新進(jìn)展

3.1 治療方案

近年來逐漸嘗試應(yīng)用各類干細(xì)胞治療IC/BPS，例如脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞[3]；尿源性干細(xì)胞[13]；臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞[17]；牙髓干細(xì)胞[23]等，通過膀胱內(nèi)灌注和膀胱壁注射可以通過激活Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)通路或抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、凋亡過程等復(fù)雜機(jī)制恢復(fù)膀胱的功能和組織學(xué)結(jié)構(gòu)，從而改善間質(zhì)性膀胱炎動(dòng)物模型的炎癥表現(xiàn)和膀胱疼痛及過度活動(dòng)癥狀。

3.2 發(fā)病機(jī)制

目前對(duì)于IC/BPS發(fā)病機(jī)制的研究多聚焦于各類細(xì)胞或炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn)：NALP3炎癥小體[5]；單核細(xì)胞趨化因子-1[15]；細(xì)胞間粘附分子-1[21]等在IC/BPS動(dòng)物模型中均有增加，可通過各種不同的機(jī)制來促進(jìn)肥大細(xì)胞的活化脫顆粒，釋放炎癥介質(zhì)。前列腺素E受體-1,-2,-4有可能在IC中被激活，造成膀胱過度活動(dòng)表現(xiàn)[7,24]。除了炎癥因子，還有抗炎因子的發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α刺激基因-6能夠編碼一種保護(hù)性的炎癥因子，通過與GAG層成分結(jié)合，參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑，具有保護(hù)性抗炎作用[16]。

4 結(jié)語

綜上所述，盡管現(xiàn)階段并未發(fā)現(xiàn)非常理想的能夠擬合IC/BPS所有表征的大鼠模型，但目前有多種可行的造模方案可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行選擇，關(guān)于IC/BPS大鼠模型的研究也取得了一定的成果，相信通過將動(dòng)物模型與臨床基礎(chǔ)研究緊密結(jié)合，未來一定能夠發(fā)現(xiàn)更加滿足研究要求的IC/BPS動(dòng)物模型，解決更多IC/BPS的診療難題。