楊 琨，王 雁

天津市眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科臨床學(xué)院 天津市眼科研究所 天津市眼科學(xué)與視覺科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

視網(wǎng)膜的退行性病變，如青光眼、視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)和年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)等，均可導(dǎo)致不可逆的視力損傷。在胚胎發(fā)育過程中，視網(wǎng)膜與中樞神經(jīng)系統(tǒng)一樣都是由神經(jīng)外胚層的細(xì)胞發(fā)育而來，成年哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜曾一度被認(rèn)為損傷后無再生修復(fù)能力，然而近年研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動(dòng)物的眼中存在沉寂的視網(wǎng)膜干細(xì)胞(retinal stem cells，RSCs)，這些干細(xì)胞在一定條件下可以被激活并分化為視網(wǎng)膜神經(jīng)元而修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜[1- 4]。Wnt信號通路是傳遞生長刺激信號的重要通路，研究表明，Wnt信號通路在視網(wǎng)膜的發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，在視網(wǎng)膜神經(jīng)元的分化以及維持其神經(jīng)元特性方面發(fā)揮重要作用[5]。

Wnt信號通路

Wnt最初是從乳腺癌小鼠中克隆出來的原癌基因int- 1，由Nusse等[6]在1982年發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，果蠅無翅基因Wg與int- 1的基因序列具有高度的同源性，因此將二者合稱為Wnt。Wnt蛋白家族廣泛存在于多細(xì)胞真核生物中，是一條高度保守的信號通路，通過自分泌或旁分泌在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[7]。

經(jīng)典的Wnt信號通路為Wnt/β-catenin途徑。Wnt在細(xì)胞上的受體是卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)rz)，F(xiàn)rz胞外n端具有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(cysteine rich domain，CRD)，能與Wnt結(jié)合，其輔助受體為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein，LRP)5/6。Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frz及LRP5/6受體結(jié)合，作用于胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白(dishevelled，Dsh)，活化后的Dsh抑制由軸抑制蛋白(axis inhibition protein，Axin)、結(jié)腸腺癌息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)和糖原合成激酶- 3β(glycogen synthase kinase- 3β，GSK- 3β)三者共同形成的降解復(fù)合物Axin-APC-GSK- 3β與β連鎖蛋白(β-catenin)的結(jié)合，從而切斷細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的降解途徑，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚并進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)的T細(xì)胞因子(T cell factor，Tcf)/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)因子(lymphoid enhancer factor，Lef)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合，調(diào)節(jié)C-myc、Cyclin D1、Ngn- 2等靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化。研究表明，Wnt/β-catenin參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑傳遞著多種細(xì)胞生長刺激信號，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，能夠明顯促進(jìn)多種神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[5，8]。

Wnt信號通路調(diào)控著視網(wǎng)膜的干細(xì)胞修復(fù)

Wnt信號通路通過其受體、配體和調(diào)節(jié)子的有序表達(dá)來調(diào)控RSCs的增殖和分化[9- 10]。對斑馬魚的研究顯示，Wnt信號上調(diào)可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積聚，促使視網(wǎng)膜細(xì)胞重新去分化進(jìn)入細(xì)胞周期而修復(fù)損傷視網(wǎng)膜，同時(shí)，β-catenin還能與性別決定區(qū)域Y-框2(sex-determining region Y-box 2，Sox2)通過協(xié)同作用促進(jìn)視網(wǎng)膜膠質(zhì)細(xì)胞去分化的過程，因此魚類的視網(wǎng)膜損傷后，在Wnt信號通路的作用下，能有效修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜，恢復(fù)視功能，兩棲類動(dòng)物的視網(wǎng)膜修復(fù)過程也和魚類相類似[11- 12]。一般認(rèn)為，這種視網(wǎng)膜自我修復(fù)的功能只存在于兩棲類和魚類等低等脊椎動(dòng)物中，然而最近研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的視網(wǎng)膜中，Wnt通路激活后，其視網(wǎng)膜神經(jīng)元也可以重新回到視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的狀態(tài)，隨后通過加入外源性造血干細(xì)胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)后，可以使這些視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)元分化，最終發(fā)育成終末分化的神經(jīng)元[13]。這種通過上調(diào)信號通路及干細(xì)胞融合介導(dǎo)的細(xì)胞重編程能否成為一種組織再生的潛在機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

研究顯示，視網(wǎng)膜的損傷可能會(huì)激發(fā)其干細(xì)胞的潛能而進(jìn)行自我修復(fù)，為了研究視網(wǎng)膜損傷后細(xì)胞修復(fù)的情況，Han等[14]通過激光光凝的方法破壞小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigmentosa epithelial，RPE)，發(fā)現(xiàn)Wnt通路的靶基因Cyclin D1、Otx2和Mitf的表達(dá)水平出現(xiàn)反應(yīng)性增高，其中，調(diào)控RPE細(xì)胞增殖的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Otx2和Mitf的表達(dá)與Wnt信號的上調(diào)呈正相關(guān)，該研究表明，Wnt信號在RPE增殖修復(fù)的過程中發(fā)揮了重要的促進(jìn)作用，通過操控Wnt信號的表達(dá)水平有可能激發(fā)RPE細(xì)胞的干細(xì)胞潛能，實(shí)現(xiàn)RPE細(xì)胞的再生治療。

最新研究證實(shí)，作為哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中最主要的膠質(zhì)細(xì)胞，Müller膠質(zhì)細(xì)胞(Müller glia，MG)在特定條件下也可以去分化而修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜[15- 16]。MG細(xì)胞的增殖及其干細(xì)胞潛能是由經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路通過Lin28/let- 7 miRNA途徑調(diào)控的[17- 18]。視網(wǎng)膜損傷后，Wnt/β-catenin通路因細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin積聚而激活MG細(xì)胞的增殖，與此同時(shí)，β-catenin在通路的下游與Lin28啟動(dòng)子結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄，使MG細(xì)胞重新回到去分化增殖狀態(tài)。同時(shí)，在Lin28缺失的情況下，即使上調(diào)了Wnt/β-catenin通路，MG細(xì)胞的增殖也變得非常有限。因此，在哺乳動(dòng)物中，Wnt/β-catenin-Lin28-let7 miRNA的信號通路在調(diào)控MG細(xì)胞的去分化增殖方面發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[19]。Yao等[1]采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在一種先天性光感受器受損的Gnat1rd17Gnat2cpfl3雙突變小鼠模型中，通過玻璃體腔內(nèi)注射ShH10-GFAP-β-catenin激活Wnt通路，2周后再轉(zhuǎn)入Otx2、Crx和Nrl等3個(gè)基因誘導(dǎo)MG細(xì)胞的分化，4周后發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記的MG細(xì)胞分化成為了視桿細(xì)胞，這些MG來源的視桿細(xì)胞，從形態(tài)上與原來的視桿細(xì)胞相類似，并且使這種先天失明小鼠模型的視覺沖動(dòng)得到了恢復(fù)。該研究進(jìn)一步明確了哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜細(xì)胞在Wnt信號作用下的確可以被重新激活，分化為有功能的光感受器，從而實(shí)現(xiàn)哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜的修復(fù)功能。

視網(wǎng)膜的干細(xì)胞來源

睫狀邊緣帶/色素睫狀緣來源的干細(xì)胞在低等脊椎動(dòng)物中，如魚類和兩棲類動(dòng)物，視網(wǎng)膜修復(fù)的干細(xì)胞來源于其周邊睫狀邊緣帶(ciliary marginal zone，CMZ)的色素細(xì)胞。CMZ的色素細(xì)胞在性質(zhì)上與RSCs相類似，可以產(chǎn)生視網(wǎng)膜所有的神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞[20]。孵育的小雞眼中也存在CMZ細(xì)胞，但其活躍度遠(yuǎn)不及魚類和兩棲類動(dòng)物[21]。哺乳動(dòng)物中不存在CMZ的組織結(jié)構(gòu)，取而代之的是進(jìn)化后的色素睫狀緣(pigmented ciliary margin，PCM)，其組織結(jié)構(gòu)上與CMZ類似，人們曾一度認(rèn)為哺乳動(dòng)物的PCM也能像魚類一樣，能修復(fù)損傷的視網(wǎng)膜，但最終發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中所謂PCM來源的RSCs實(shí)際上只是普通的色素上皮細(xì)胞，盡管它們在加入生長因子時(shí)能表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物，但無論在體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，它們都無法分化成為視網(wǎng)膜神經(jīng)元。為此，哺乳動(dòng)物PCM來源的細(xì)胞是否能成為視網(wǎng)膜再生的干細(xì)胞來源還有待進(jìn)一步探索[22]。

RPE來源的干細(xì)胞RPE細(xì)胞是低等脊椎動(dòng)物中內(nèi)源性視網(wǎng)膜再生的重要細(xì)胞來源，此類動(dòng)物的視網(wǎng)膜被損傷或完全切除后，可由來自RPE的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，這種現(xiàn)象被稱為轉(zhuǎn)分化[23- 24]。Spence等[25]研究發(fā)現(xiàn)，雞類的神經(jīng)視網(wǎng)膜中也存在類似的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，在孵育3～4 d的雞胚中切除神經(jīng)視網(wǎng)膜后，部分RPE細(xì)胞去分化成視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(retinal progenitor cells，RPCs)，并進(jìn)一步增殖分化成為新的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。雞胚中RPE細(xì)胞的去分化過程與兩棲類動(dòng)物非常類似，然而雞胚中RPE細(xì)胞無法在視網(wǎng)膜損傷后自我去分化，需要添加成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2)和配對盒蛋白6(paired box protein 6，Pax6)進(jìn)行誘導(dǎo)才能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)分化過程。哺乳動(dòng)物的RPE細(xì)胞在一定條件干預(yù)下，也可以發(fā)生類似的轉(zhuǎn)分化過程，這種轉(zhuǎn)分化后的細(xì)胞被稱為RPE轉(zhuǎn)化的多能干細(xì)胞(RPE stem cell，RPESC)，RPESC在體外表現(xiàn)出很強(qiáng)的自我增殖及分化能力，但其能否作為一種新的視網(wǎng)膜修復(fù)的細(xì)胞來源尚待進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[26- 28]。

MG細(xì)胞來源的干細(xì)胞MG細(xì)胞與視網(wǎng)膜其他神經(jīng)細(xì)胞有著共同的干細(xì)胞來源，在魚類及兩棲類中，MG細(xì)胞始終充當(dāng)著膠質(zhì)細(xì)胞和RSCs的雙重角色。正常情況下，MG細(xì)胞處于分裂的靜止期，視網(wǎng)膜損傷后，他們重新進(jìn)入細(xì)胞分裂期并去分化成為RSCs，進(jìn)而對視網(wǎng)膜進(jìn)行修復(fù)[29- 30]。與魚類和兩棲類相比，哺乳動(dòng)物的MG細(xì)胞在視網(wǎng)膜損傷后并不能自發(fā)的去分化增殖而修復(fù)視網(wǎng)膜，但在添加維甲酸或強(qiáng)制性表達(dá)Math3、NeuroD1和Pax6等基因后，MG細(xì)胞便具備去分化增殖的能力而成為RSCs，同時(shí)，其去分化的效率也會(huì)得到很大提升[31]。此外，作為神經(jīng)干細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一的Sox2也參與了MG干細(xì)胞潛能激活的過程。在光損傷的視網(wǎng)膜中，MG細(xì)胞的Sox2表達(dá)顯著增加，其表達(dá)水平與MG細(xì)胞的去分化增殖呈正相關(guān)，因此，Sox2也可能是激活MG干細(xì)胞潛能的必要因素之一[12]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，前神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Ascl1與轉(zhuǎn)錄因子Lin28是哺乳動(dòng)物MG細(xì)胞進(jìn)入重編程程序的關(guān)鍵因子[12，32]。Ueki等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在未損傷的小鼠視網(wǎng)膜中，MG細(xì)胞Ascl1的表達(dá)并不明顯，當(dāng)視網(wǎng)膜受損時(shí)，MG細(xì)胞中Ascl1的表達(dá)明顯增加并產(chǎn)生類似于斑馬魚視網(wǎng)膜再生早期時(shí)的反應(yīng)。Jorstad等[4]采用具有神經(jīng)毒性的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)制作視網(wǎng)膜損傷模型，同時(shí)使MG細(xì)胞特異性過表達(dá)Ascl1，再加入組蛋白去乙?；敢种苿┨幚砗?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MG細(xì)胞開始朝視網(wǎng)膜神經(jīng)元分化，與損傷的視網(wǎng)膜建立了新的神經(jīng)元突觸聯(lián)系，這種新的突觸聯(lián)系對光照能產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)，而且通過示蹤技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，再生的神經(jīng)元均來自于增殖的MG細(xì)胞。除了Ascl1與Lin28之外，α7煙堿乙酰膽堿受體激動(dòng)劑(α7 nicotinic acetylcholine receptor agonist，α7nAChR)也是哺乳動(dòng)物MG細(xì)胞激活的重要因素之一。Webster等[16]使用含有α7nAChR的滴眼液PNU- 282987處理成年大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有視網(wǎng)膜損傷及外源性生長因子加入的情況下，實(shí)驗(yàn)大鼠視網(wǎng)膜中出現(xiàn)了多種類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)元的自我增殖，而且這種視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)元的增殖與PNU- 282987的給藥劑量呈現(xiàn)出劑量依賴的方式。通過BrdU標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，這些增殖的視網(wǎng)膜細(xì)胞和神經(jīng)元均來自于活化后的MG細(xì)胞，且分化后可自行遷移至光感受器層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，與其他細(xì)胞建立新的突觸連接。該研究印證了成年哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中存在著內(nèi)源性的神經(jīng)元再生的假設(shè)。由此可見，在特定條件下，哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中的MG細(xì)胞可以作為視網(wǎng)膜損傷修復(fù)的干細(xì)胞來源。

結(jié)語及展望

調(diào)控干細(xì)胞增殖和分化的信號通路是一個(gè)非常復(fù)雜而且龐大的系統(tǒng)，現(xiàn)已證實(shí)，在哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中，MG細(xì)胞可以在視網(wǎng)膜損傷后通過上調(diào)Wnt信號通路而重新進(jìn)入去分化增殖狀態(tài)。除了MG細(xì)胞以外，視網(wǎng)膜內(nèi)是否還存在著更多的干細(xì)胞來源，Wnt信號通路的各種受體、配體及調(diào)節(jié)子如何發(fā)揮作用等問題仍需要進(jìn)一步探索。明確這些干細(xì)胞的信號調(diào)控方式，就能在視網(wǎng)膜損傷時(shí)，使這些沉寂的RSCs重新被激活，從而給視網(wǎng)膜病變的干細(xì)胞治療帶來新的曙光。