劉世堯，冉慧，毛運芝，陳欣瑜

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綦江皺皮木瓜果實有機酸特征性成分鑒定與不同發(fā)育期變化規(guī)律

劉世堯，冉慧，毛運芝，陳欣瑜

（西南大學園藝園林學院/南方山地園藝學教育部重點實驗室，重慶 400715）

【目的】鑒定重慶綦江皺皮木瓜果實有機酸特征性成分，解析果實不同發(fā)育期有機酸變化規(guī)律，為皺皮木瓜果實發(fā)育期有機酸代謝研究提供基礎數(shù)據(jù)。【方法】以重慶綦江皺皮木瓜(‘大羅’木瓜)為研究對象，采用溶劑提取、甲酯化衍生與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測，進行不同發(fā)育期果實有機酸組成及含量測定，藥典委2012版中藥色譜指紋圖譜相似度分析軟件進行共有特征性成分峰匹配，SigmaPlot 10.0進行果實發(fā)育過程總有機酸、強酸味和弱酸味成分變化規(guī)律分析，Simca-P 11.5與SPSS 20.0結(jié)合進行果實發(fā)育期共有特征性成分PCA分析與HCA聚類。【結(jié)果】經(jīng)甲醇提取、甲酯化衍生、氯仿萃取和GC-MS檢測，從綦江皺皮木瓜8個發(fā)育期果實中共分離出共有特征性成分41種，包括低碳羧酸10種、長鏈脂肪酸21種、芳香族有機酸5種、一元酚酸類3種和氨基酸2種，TIC圖基線平穩(wěn)，成分峰分布均勻且分離度高，分離效果好。綦江木瓜從盛花后90 d至果實完熟（160 d）總有機酸含量呈先下降再上升再下降的倒“之”字型，總有機酸與強酸味（=0.970）、弱酸味成分（=0.998）極顯著正相關(guān)；而強酸味成分與低碳羧酸極顯著正相關(guān)（=0.999），與一元酚酸顯著正相關(guān)（=0.747）；弱酸味成分與長鏈脂肪酸極顯著正相關(guān)（=0.999）。綦江木瓜完熟期檢出的強酸味有機酸以蘋果酸、乙酰丙酸、檸檬酸為主，累計相對含量占檢出總強酸味成分的90%以上；蘋果酸在發(fā)育期經(jīng)歷了含量下降、略有上升然后再下降的變化過程，呈從盛花后90—120 d逐漸下降，到130 d略有上升，然后再下降的倒“之”字型；檸檬酸與蘋果酸變化規(guī)律相似，但乙酰丙酸與蘋果酸截然相反，總體呈現(xiàn)上升趨勢，到盛花后130 d增至最高點，之后略有下降（150 d降至最低），進入完熟期再次升高。相關(guān)性分析表明，果實強酸味有機酸總量與蘋果酸、檸檬酸呈極顯著正相關(guān)，但與乙酰丙酸、異檸檬酸和水楊酸弱負相關(guān)。弱酸味成分變化規(guī)律分析表明，在果實發(fā)育期，油酸、亞油酸、棕櫚酸和10-羥基-十六烷酸等多數(shù)弱酸味成分均經(jīng)歷了迅速下降、緩慢上升再下降的變化過程，而十九烷酸卻呈緩慢上升，然后下降再上升的相反過程；相關(guān)性分析表明，以油酸、亞油酸等多數(shù)弱酸味有機酸與總?cè)跛嵛队袡C酸極顯著正相關(guān)，與十九烷酸和硬脂酸弱負相關(guān)。Simca-P主成分分析表明PC1和PC2分別解釋了總變量40.00%和23.20%，樣品主成分得分圖顯示，S1和S2聚為一類，α-酮戊二酸、蘋果酸、奎尼酸、莽草酸、棕櫚酸、亞油酸對樣品此類有機酸組成起決定性作用；S3、S4、S5聚在一起，油酸、10-羥基-十六烷酸對這3個發(fā)育期樣品起決定性作用；S6和S7聚在一起，丙二酸、乙酰丙酸、異檸檬酸、水楊酸是其主要貢獻性成分；S8單獨存在，琥珀酸、十九烷酸、二十四烷酸是其主要貢獻性成分；該結(jié)果與基于SPSS平方歐氏距離的離差平方和聚類分析結(jié)果基本一致?！窘Y(jié)論】綦江皺皮木瓜屬蘋果酸型水果，果實發(fā)育過程中有機酸的積累模式由盛花后90 d的蘋果酸-檸檬酸積累型向完熟期（160 d）乙酰丙酸-蘋果酸-檸檬酸積累型轉(zhuǎn)變，酸積累模式的轉(zhuǎn)變在重慶皺皮木瓜果實酸度與風味品質(zhì)決定中具有重要作用。

皺皮木瓜；有機酸；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；特征性成分；變化規(guī)律

0 引言

【研究意義】皺皮木瓜營養(yǎng)豐富、藥效顯著，是一種藥食兼用型果樹資源[1]。中國是皺皮木瓜的起源地和栽培中心，種質(zhì)資源極為豐富，是全球優(yōu)質(zhì)皺皮木瓜主產(chǎn)地[2]。我國皺皮木瓜人工栽培面積超過6.67萬公頃，鮮果年產(chǎn)量達3×106t，并在逐年增加[3]。重慶綦江是中國皺皮木瓜主產(chǎn)區(qū)之一，擁有0.67萬公頃標準化栽培基地，年產(chǎn)鮮果2×105t，產(chǎn)品深受市場歡迎。在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中皺皮木瓜以藥用為主，但其鮮果營養(yǎng)豐富，富含超氧化物歧化酶（SOD）、萜類、黃酮等多種活性成分，是一種開發(fā)潛力巨大的保健型水果。但皺皮木瓜鮮食酸味濃重、口感較差，因此高酸是發(fā)展皺皮木瓜鮮食產(chǎn)品的主要障礙[4]。有機酸是構(gòu)成水果風味的重要因子，在果實食用風味中具有決定性作用，多年來一直是果實品質(zhì)研究領域的重要主題[5-8]。因此，揭示皺皮木瓜果實有機酸積累規(guī)律對探索皺皮木瓜果實高酸積累機制與果實品質(zhì)改良，具有重要的實踐價值?！厩叭搜芯窟M展】皺皮木瓜（（Sweet）Nakai.）是薔薇科（Rosaceae）木瓜屬（Lindl.）多年生落葉小喬木，特色果樹資源，全國各地廣范分布[9]。劉世堯等[10]采用滴定法測得皺皮木瓜鮮果總酸含量高達6.1%，果汁pH為2.6，果汁可滴定酸含量超過3.57 g/100 mL，僅次于尤力克檸檬（約為4.5 g/100 mL），是蘋果亞科典型高酸水果。前人研究結(jié)果表明，皺皮木瓜中含有六類有機酸，包括低碳羧酸、長鏈脂肪酸、芳香族有機酸、五環(huán)三萜有機酸、酚酸及氨基酸[11]，其中低碳羧酸和酚酸對果實酸度起決定作用，長鏈脂肪酸與氨基酸是果實結(jié)構(gòu)組成與能源貯藏物質(zhì)，五環(huán)三萜有機酸是果實活性成分，芳香族有機酸則是成熟果實香氣構(gòu)成物質(zhì)[12-13]。近年，通過HPLC法、UPLC法、GCMS法從皺皮木瓜果實中分離鑒定出的有機酸約60余種，主要是蘋果酸、檸檬酸、異檸檬酸、a-酮戊二酸、富馬酸、奎尼酸、草酸、烏頭酸、丙二酸等低碳羧酸[14]，高誠偉等[12]采用甲基化衍生與GCMS檢測從云南西雙版納皺皮木瓜中鑒定出有機酸29種，主要有檸蘋酸、苯甲酸、羥基丁二酸、棕櫚酸和蘋果酸以及C9-C18脂肪酸和芳香酸，其中二元酸占41.47%，芳香酸占25.20%；龔復俊等[13]利用相同方法從湖北長陽皺皮木瓜中分離鑒定有機酸27種，主要有蘋果酸、檸檬酸、苯甲酸、琥珀酸、a-酮基戊二酸、苯基乳酸、烏頭酸、4-氧-庚二酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸等，并明確指出皺皮木瓜為蘋果酸型水果。果實有機酸代謝是一個復雜的生理過程，揭示果實發(fā)育過程有機酸代謝規(guī)律可為果實品質(zhì)改良及果樹遺傳育種提供理論支撐[15]。果實發(fā)育期有機酸代謝在柑橘[16]、梨[17]、杏[18]、李[19]等大宗果樹上早已展開，皺皮木瓜作為薔薇科蘋果亞科典型高酸水果，揭示其果實高酸積累規(guī)律可為皺皮木瓜果實品質(zhì)改良奠定依據(jù)，也可為豐富蘋果亞科果樹有機酸代謝路徑研究提供參考。【本研究切入點】皺皮木瓜果實有機酸組成復雜且含量較高，受遺傳背景、產(chǎn)地環(huán)境和發(fā)育期等多重因素影響，但當前皺皮木瓜果實有機酸研究尚處在組分鑒定的初級階段，我國各主產(chǎn)區(qū)與主要地方品種皺皮木瓜果實發(fā)育期有機酸代謝規(guī)律研究尚未開展。【擬解決的關(guān)鍵問題】以我國主產(chǎn)區(qū)重慶綦江皺皮木瓜為對象，采用溶濟提取、甲酯化衍生與GCMS檢測，開展綦江‘大羅’木瓜發(fā)育期果實有機酸組成及含量變化規(guī)律研究，明確綦江皺皮木瓜果實酸性風味特征性構(gòu)成因子與發(fā)育期有機酸代謝規(guī)律，旨在為我國皺皮木瓜果實品質(zhì)改良提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣果于2017年6月16日至8月26日采自重慶綦江三角鎮(zhèn)桐埡村皺皮木瓜標準化栽培基地。按代表性原則，在同一果園內(nèi)選擇生長勢中等、生態(tài)條件和樹型基本一致的5齡以上健康成年植株各5株作為樣株，每次每株選典型大小健康外膛果各1枚，合并樣果作為1個生物學重復，共重復3次。樣果取回、編號并稱重后，沿縱軸“X”型切開，留取果實向陽與背陽面部分，除去果核后把果肉和果皮部分切成0.5 cm3小塊，混合均勻，稱重后立即放入90℃熱激處理2 min去酶活，再放入-80℃超低溫冰箱保存。整個發(fā)育期取樣結(jié)束后，將全部樣品轉(zhuǎn)入45℃恒溫鼓風干燥箱烘至恒重，計算烘干率后用小型粉碎機粉碎，過80目篩的果粉干燥器保存?zhèn)溆?。材料?jīng)西南大學李先源副教授鑒定為皺皮木瓜（（Sweet）Nakai.），品種為綦江‘大羅’木瓜（cv. Daluo）。

1.2 試劑與儀器

濃硫酸、甲醇、氯仿、石油醚、無水硫酸鈉為分析純；試驗用水為超純水。994L型雙門超低溫冰箱（美國Thermo公司），Delta320型pH酸度計（瑞士Mettler-Toledo公司），N-1100S-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA東京理化），DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司），F(xiàn)E-10高速藥材粉碎機（浙江溫嶺市百樂粉碎設備廠），TA2003A型臺式離心機（上海哈菲爾分析儀器有限公司），SHB-III型數(shù)顯恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），Molgene 210a型超純水機（上海摩爾科學儀器有限公司），萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司），SE-812型氮吹儀（北京帥恩科技有限責任公司），Shimadzu 2010 QP Ultra 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、配AOC 2000型三位一體自動進樣器，GCMS Real Time Analysis工作站，GCMS Postrun Analysis解析軟件，NIST2008、NIST2008（S）質(zhì)譜庫（日本島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 果實采樣時期劃分 綦江皺皮木瓜每年3月初開花，花期從3月1日至3月31日持續(xù)開放30 d左右，盛花期為3月15日。果實從坐果到完熟的總發(fā)育期為160 d，包括幼果期（盛花期—盛花后45 d），子房緩慢膨大，經(jīng)歷一次生理落果；膨大前期（盛花后45—90 d），果實緩慢增長；膨大后期（盛花后90—130 d，果實迅速增大）；轉(zhuǎn)色期（盛花后130—160 d），果型和單果重緩慢增加；完熟期（盛花后160 d）等5個主要發(fā)育時期，果實完熟60 d以后落葉，然后進入休眠期。本文從皺皮木瓜果實膨大后期（盛花后90 d）開始采樣，每隔10 d取樣1次，經(jīng)過轉(zhuǎn)色期直到果實完全成熟（160 d）。其中，果實膨大后期取樣5次（采樣時間分別是盛花后90、100、110、120和130 d），果實轉(zhuǎn)色期取樣3次（盛花后140、150和160 d），共取樣8次，分別記作S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8。

1.3.2 果實有機酸甲酯化處理方法 樣品分析于2017年9月在南方山地園藝學教育部重點實驗室完成，參考劉世堯、高誠偉等[10,12]方法并稍作改動。精確稱取各供試樣品粉末0.5 g于25 mL具塞刻度大試管中，分別加入20 mL 硫酸—甲醇（7﹕100），密閉0℃、400 W超聲處理30 min，60℃恒溫水浴甲酯化衍生處理24 h，冷卻至室溫，補足蒸發(fā)損失甲醇，密閉0℃、400 W超聲處理30 min，3 000 r/min離心棄去沉淀。上清液轉(zhuǎn)移到盛有20 mL超純水的分液漏斗中，混勻，再加入20 mL氯仿，劇烈振蕩后靜置2 h，收集下相（氯仿層）即得皺皮木瓜果實有機酸甲酯化衍生物提取液，3 g無水硫酸鈉干燥過夜后，0.22 μm有機濾膜過濾2 mL至進樣瓶，1 μL進樣。

1.3.3 果實有機酸GC—MS檢測條件 氣相色譜條件：色譜柱島津Rxt-5MS弱極性毛細管色譜柱 （30 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣時間為2.5 min，34.1 cm·sec-1恒定線速度，進樣口溫度280℃， 程序升溫（起始溫度70℃，保持1 min，以10℃·min-1的速率升至290℃并保持10 min），傳輸線溫度 230℃，載氣為氦氣，載氣流速50 mL·min-1，柱流量0.87 mL·min-1，吹掃流量3 mL·min-1，色譜分離時間33 min。

質(zhì)譜條件：電離方式：電子轟擊電離（EI源）；電離能量：70 eV；離子源溫度230℃；質(zhì)量范圍（m/z）：30—800 Da；檢測器增益1.0×105；采集方式Scan；溶劑延遲時間：2.5 min。樣品有機酸衍生物GC—MS檢測：供試液經(jīng)0.25 μm有機濾膜過濾后，液體進樣1 μL，不分流進樣，質(zhì)譜檢測時間為32.5 min，得到樣品有機酸衍生物TIC圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

綦江皺皮木瓜每個發(fā)育期樣品均重復3次，結(jié)果以平均值±標準差來表示。檢測所得GCMS數(shù)據(jù)成分峰利用Shimadzu GC/MS Postrun Analysis軟件在NIST2008、NIST2008S質(zhì)譜庫自動檢索，結(jié)合人工文獻檢索定性。共有特征性成分峰匹配采用中國藥典委2012版色譜指紋圖譜相似度分析軟件完成，利用SigmaPlot 10.0進行綦江皺皮木瓜不同發(fā)育期有機酸代謝規(guī)律分析，主成分分析與系統(tǒng)聚類分別在SIMCA-P 11.5和SPSS 20.0中完成。

2 結(jié)果

2.1 有機酸甲基化衍生物GC-MS分離鑒定

樣品干粉經(jīng)甲醇超聲提取與甲酯化衍生、GC-MS檢測，得總離子流色譜圖見圖1-A（盛花后90 d），質(zhì)譜溶劑剪切時間2.5 min，檢測截止時間為35 min。所得TIC基線較穩(wěn)定，有機酸衍生物譜峰分布均勻，成分峰基線分離度良好；主要成分峰保留時間RSD均在1%以下，表明儀器精密度良好。本文從綦江皺皮木瓜盛花后90—160 d發(fā)育期間的8個果實TIC圖（圖1-B）匹配得到共有有機酸成分峰41個，說明樣品發(fā)育期果實有機酸組成穩(wěn)定。41種共有有機酸分別隸屬于低碳羧酸、長鏈脂肪酸、芳香族有機酸、一元酚酸類和氨基酸，其中低碳羧酸10種，包括草酸、丙二酸、乙酰丙酸、富馬酸、a-酮戊二酸、蘋果酸、琥珀酸、反式烏頭酸、檸檬酸、異檸檬酸；長鏈脂肪酸21種，包括月桂酸、杜鵑花酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、山崳酸、順-11-二十碳烯酸、花生酸、順式-5,8,11-二十碳三烯酸、7,10,13-二十碳三烯酸、10,13-二十碳二烯酸、10-羥基-十六烷酸、7-羥基-十八烷酸、十九烷酸、二十四烷酸、9,10-二羥基-十八烷酸、二十一烷酸；芳香族有機酸5種，分別是苯甲酸、DL-扁桃酸、肉桂酸、糠酸、香草酸；匹配奎尼酸、水楊酸、莽草酸等一元酚酸3種，氨基酸2種（L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸）。由此可見，經(jīng)甲醇提取、甲酯衍生化和GCMS檢測，皺皮木瓜發(fā)育期8個樣品檢出有機酸種類，以長鏈脂肪酸和低碳羧酸為主，檢出一元酚酸、芳香族羧酸與氨基酸較少。在所有檢出成分中（表1），低碳羧酸與一元酚酸是皺皮木瓜果實的主要酸味貢獻性成分，長鏈脂肪酸和氨基酸是果實細胞結(jié)構(gòu)構(gòu)成物質(zhì)和能量貯存載體，而芳香族有機酸是果實香味的決定性成分。根據(jù)各成分酸度系數(shù)差異，檢出有機酸又可分為強酸味成分（低碳羧酸和一元酚酸）和弱酸味成分（長鏈脂肪酸、芳香族有機酸和氨基酸）兩大類?？梢?，GCMS法檢出指標數(shù)量多，精確度高，對綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實主要和微量酸性成分均有較好的檢出效果。

A：盛花后90 d樣品TIC積分圖；B：8個發(fā)育期樣品TIC對照圖

2.2 發(fā)育期果實有機酸積累動態(tài)

從重慶綦江皺皮木瓜果實在盛花后90 d（果實膨大后期）到盛花后160 d（果實完全成熟），以各樣品有機酸共有峰面積累加值為指標，在相同供試液提取、甲酯化衍生、儀器檢測與總離子流圖積分條件下，各共有成分峰面積和變化趨勢與各樣品總有機酸含量變化規(guī)律相一致。由圖2-a可知，綦江皺皮木瓜在盛花后90 d，果實有機酸含量很高，但從盛花后90 d至100 d，其果實總有機酸含量突然下降，到盛花后100 d降至最低點；從盛花后100 d開始，果實總有機酸含量又緩慢上升，至盛花后130 d升至最高點，該時間段為果實膨大期的后半程；而到盛花后130 d即進入果實轉(zhuǎn)色期，總有機酸含量再次下降，到盛花后160 d（果實完熟），含量降至最低點。由圖2-b可知，在本文所選綦江皺皮木瓜果實發(fā)育期，低碳羧酸和長鏈脂肪酸類成分相對含量較高，占檢出有機酸的主體，芳香族有機酸、一元酚酸和氨基酸類成分的占比較少。由圖2-c和2-d可知，果實發(fā)育期包括低碳羧酸和一元酚酸在內(nèi)的果實強酸味貢獻性成分與包括長鏈脂肪酸、芳香族有機酸和氨基酸在內(nèi)的弱酸味貢獻性成分，均與總有機酸變化趨勢相一致。Pearson相關(guān)系數(shù)計算結(jié)果表明，綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實總有機酸含量變化趨勢與強酸味有機酸含量、弱酸味類成分含量均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.970和0.998；同時強酸味貢獻性成分與低碳羧酸（=0.999）極顯著正相關(guān)，與一元酚酸（=0.747）顯著正相關(guān)；弱酸味貢獻性成分與長鏈脂肪酸（=0.999）極顯著正相關(guān)（表2）。

表1 重慶綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實共有有機酸檢出信息解析表

表2 發(fā)育期皺皮木瓜果實各類有機酸皮爾遜相關(guān)性分析（n=8）

*表示在≤0.05水平（雙尾檢驗）上顯著相關(guān)；**表示在≤0.01水平（雙尾檢驗）上極顯著相關(guān)；df=6時，α=5%時皮爾遜相關(guān)系數(shù)臨界值為0.707，α=1%時皮爾遜相關(guān)系數(shù)臨界值為0.834。下同

* indicates correlation is significant at≤ 0.05 level of two-tailed test. ** indicates correlation is strongly significant at≤0.01 level of two-tailed test. The Pearson correlation coefficient critical value of two-tailed test is 0.707 when α=5% and 0.834 when α=1% (df=6). The same as below

2.3 果實發(fā)育期強酸味成分變化

在綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實檢出有機酸中，低碳羧酸與一元酚酸酸度系數(shù)低而酸性強，是皺皮木瓜果實酸性風味主要貢獻成分，含量高低對果實酸味強弱具有決定作用[20]，在一定程度上果實發(fā)育期各樣品強酸味成分峰面積和的差異可反映果實酸度變化規(guī)律。本研究結(jié)果表明，在綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實高酸味貢獻性成分中，蘋果酸占有絕對優(yōu)勢，8個時期樣品的平均相對含量達到21.47%，其次是乙酰丙酸（6.56%）、檸檬酸（2.78%）、琥珀酸（0.86%）、草酸（0.72%）、奎尼酸（0.33%）、富馬酸（0.23%）、水楊酸（0.23%）、丙二酸（0.21%）、α-酮戊二酸（0.19%）、莽草酸（0.08%）、反式烏頭酸（0.07%）、異檸檬酸（0.04%）。綦江皺皮木瓜果實發(fā)育過程中，單位鮮果重蘋果酸含量從盛花后90 d到果實完熟（160 d）總體呈逐漸下隆趨勢，其中在盛花后130 d有一個略升高的峰值出現(xiàn)，與果實總有機酸含量變化趨勢基本一致。乙酰丙酸變化規(guī)律與蘋果酸截然相反，總體呈現(xiàn)上升趨勢，到盛花后130 d增至最高點，之后略有下降，到盛花后150 d降至最低，而進入果實完熟期再次升高。檸檬酸也是皺皮木瓜鮮果的重要酸味貢獻成分，其相對含量較蘋果酸少很多，但其含量變化趨勢卻與蘋果酸相似，二者都是總體遞減同時在盛花后130 d有一個升高再下降的轉(zhuǎn)折過程。琥珀酸則表現(xiàn)為下降（盛花后90—120 d），上升（盛花后120 d—130 d），然后下降（盛花后130—140 d）再上升（盛花后140—160 d）的“W”字型變化過程。草酸表現(xiàn)為上升（盛花后90—110 d）、下降（盛花后110—150 d），再上升（盛花后150—160 d）的倒“之”字型變化過程。而一元羧酸類奎尼酸則表現(xiàn)為快速下降（盛花后90—110 d），略有上升（盛花后110—130 d），然后再下降（盛花后130—160 d）的“W”字型變化過程，總體變化趨勢則與蘋果酸和檸檬酸相一致（圖3）。其他檢出有機酸代謝前體和中間成分變化規(guī)律各不相同。皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果表明，在皺皮木瓜盛花后90 d到果實成熟過程中各有機酸之間及其與總強酸味成分總含量都存在不同程度的相關(guān)性，綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實強酸味有機酸總量與蘋果酸（0.960）極顯著正相關(guān)，與奎尼酸（=0.8）、莽草酸（=0.733）、檸檬酸（=0.813）、α-酮戊二酸（=0.757）顯著正相關(guān)，但與乙酰丙酸（=-0.381）、異檸檬酸（=-0.292）和水楊酸（=-0.136）弱負相關(guān)（表3）。

表3 果實發(fā)育期強酸味成分皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析表（n=8）

2.4 果實發(fā)育期弱酸味成分變化規(guī)律

長鏈脂肪酸、芳香族有機酸和氨基酸類成分酸度系數(shù)相對較高，不是果實酸味的主要貢獻物質(zhì)，但卻是皺皮木瓜果肉細胞的結(jié)構(gòu)性成分、能量貯存物質(zhì)和香氣風味基礎，屬弱酸味有機酸。本文從重慶綦江皺皮木瓜全發(fā)育期的樣品中分離出長鏈脂肪酸、芳香族有機酸和氨基酸種類分別為21種、5種和2種，占平均檢出總有機酸成分峰總面積的68.45%。其中以油酸、亞油酸、棕櫚酸和10-羥基-十六烷酸最高，分別占檢出有機酸總量的25.136%、12.079%、6.785%和5.420%，相對含量居中的有9,10-二羥基-十八烷酸（2.646%）、二十四烷酸（2.411%）、苯甲酸（2.079%）、十九烷酸（1.666%）、二十一烷酸（1.663%）、10,13-二十碳二烯酸（1.269%）、7-羥基-十八烷酸（1.102%）、花生酸（0.872%）、順-11-二十碳烯酸（0.532%）、肉桂酸（0.478%）、棕櫚油酸（0.447%）。月桂酸、山崳酸、杜鵑花酸等其他13種檢出有機酸相對含量均小于0.3%，屬微量成分。在綦江皺皮木瓜發(fā)育過程中，果實油酸、亞油酸、棕櫚酸和10-羥基-十六烷酸均呈整體下降趨勢，盛花后90 d果實油酸含量最高，但到盛花后100 d下降至原來的1/2，后又逐漸升高，至盛花后130 d再次下降，盛花后160 d果實完熟期降至最高含量的14%左右。亞油酸、棕櫚酸和10-羥基-十六烷酸相對含量雖有差異，但總體變化趨勢相同，即盛花后90 d最高，至盛花后100 d迅速降低，然后逐漸升高，到盛花后120 d可升至90 d含量水平的1/2—2/3，然后再次下降，完熟期（160 d ）降至最低點，約為最高含量水平的1/5（圖4）。除硬脂酸外的其他12個微量弱酸性有機酸在果實發(fā)育期均具有與上述成分相似的變化規(guī)律。這可能與果實完熟期弱酸味成分向酯類等香氣成分轉(zhuǎn)化有關(guān)。

A：三羧酸循環(huán)相關(guān)有機酸；B：生長調(diào)節(jié)劑類有機酸；C：酚酸類有機酸

皮爾遜相關(guān)性分析結(jié)果表明，弱酸性總有機酸含量分別與油酸（=0.936）、亞油酸（=0.987）、棕櫚酸（=0.959）、10-羥基-十六烷酸（=0.902）、二十一烷酸（=0.896）、7-羥基-十八烷酸（=0.851），及含量相對較低的花生酸（=0.955）、順-11-二十碳烯酸（=0.934）、7-羥基-十八烷酸（0.851）、DL-扁桃酸（=0.874）極顯著正相關(guān)；與9,10-二羥基-十八烷酸（=0.747）、10,13-二十碳二烯酸（=0.725），及含量相對較低的杜鵑花酸（=0.807）、山崳酸（=0.819）、香草酸（=0.781）顯著正相關(guān)，與十九烷酸弱負相關(guān)（表4）。

OA：油酸；9,12-OA：亞油酸；HCA：棕櫚；10-HHA：10-羥基-十六烷酸；9,10-DOA：9,10-二羥基-十八烷酸；TA：二十四烷酸；BA：苯甲酸/安息香酸；NA：十九烷酸；HAS：二十一烷酸

表4 果實發(fā)育期弱酸味成分皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析表（n=8）

OA：油酸；9,12-OA：亞油酸；HCA：棕櫚酸；10-HHA：10-羥基-十六烷酸；9,10-DOA：9,10-二羥基-十八烷酸；TA：二十四烷酸；BA：苯甲酸；NA：十九烷酸；HSA：二十一烷酸；10,13-EA：10,13-二十碳二烯酸；7-HOA：7-羥基-十八烷酸

OA: 9-Octadecenoic acid; 9,12-OA: 9,12-Octadecadienoic acid; HCA: Hexadecanoic acid; 10-HHA: 10-hydroxy-Hexadecanoic acid; 9,10-DOA: 9,10- dihydroxy-Octadecanoic acid; TA: Tetracosanoic acid; BA: Benzoic acid; NA: Nonadecanoic acid; HSA: Heneicosanoic acid; 10,13-EA: 10,13-Eicosadienoic acid; 7-HOA: 7-hydroxy-Octadecanoic acid

2.5 發(fā)育期有機酸組成主成分分析和聚類分析

以全部強酸味有機酸與相對含量在1%以上的弱酸味成分數(shù)據(jù)為基礎，利用Simca-p11.5進行PCA模型擬合，從圖5可以看出，主成分PC1和主成分PC2分別解釋了總變量40.00%和23.20%的總方差貢獻率。根據(jù)樣品數(shù)據(jù)的PCA模型，皺皮木瓜發(fā)育期果實有機酸組成明顯聚成四類：即S1和S2聚為一類，α-酮戊二酸、蘋果酸、奎尼酸、莽草酸、棕櫚酸、亞油酸對此時期樣品有機酸組成具有決定性作用；S3、S4、S5聚在一起，油酸、10-羥基-十六烷酸對這3個發(fā)育期樣品具有決定性作用；S6和S7聚在一起，丙二酸、乙酰丙酸、異檸檬酸、水楊酸是其主要貢獻性成分；S8單獨存在，琥珀酸、十九烷酸、二十四烷酸是其主要貢獻性成分，對本時期樣品具有決定性作用。

以綦江木瓜發(fā)育期果實有機酸41種共有特征性成分相對含量數(shù)據(jù)為基礎，利用SPSS20.0系統(tǒng)聚類分析，采用離差平方和法（Ward法）并按平方歐氏距離（Square Euclidean distance）構(gòu)建聚類分析樹（圖6）。結(jié)果表明，綦江皺皮木瓜從盛花后90 d到160 d果實完全成熟，當聚類距離為5時，8個時期果實有機酸組成可聚為4枝：S1與S2聚為一枝，與S3、S4、S5、S6聚成的第二枝構(gòu)成并列關(guān)系；在第二枝中S4與S5有機酸組成最為相似，二者與S6并列，再與S3構(gòu)成并列關(guān)系；S7為第三枝，S8為第四枝。

3 討論

3.1 綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實有機酸類成分鑒定

高誠偉等[12]利用95%乙醇提取、甲基化衍生結(jié)合GCMS檢測，從云南西雙版納皺皮木瓜中分離出22種有機酸，以檸蘋酸最高（20.74%），其次是苯甲酸（16.51%）、2-羥基丁二酸（12.05%）、棕櫚酸（7.55%）、4-甲氧基苯甲酸（5.82%）、丁二酸（5.94%）、蘋果酸（1.66%）、壬二酸（1.08%）和硬脂酸（0.95%）。龔復俊等[13]通過70%乙醇提取、陰離子柱層析純化、甲基化衍生結(jié)合GCMS檢測，從長陽皺皮木瓜中分離出蘋果酸（64%）、檸檬酸（30%）、苯甲酸、琥珀酸、α-酮基戊二酸、苯基乳酸、烏頭酸、4-氧-庚二酸、4-羥基-3-甲氧基苯甲酸等。本研究利用甲醇提取、甲酯化衍生和GCMS檢測，從綦江皺皮木瓜果實中分離出41種有機酸，檢出數(shù)量遠超已往報道。不分流進樣保證了不同發(fā)育期果實有機酸含量的可比性，恒定線速度保證了后流出化合物峰形和保留時間的穩(wěn)定。綦江皺皮木瓜主要成分是蘋果酸、檸檬酸和乙酰丙酸等，檸蘋酸未被檢出，而首次檢出相對含量較高的乙酰丙酸。乙酰丙酸又名4-氧化戊酸（4-Oxopentanoic acid）、左旋糖酸，或戊隔酮酸，是六糖酸性水解的主要產(chǎn)物，其分子中含有一個羰基、一個梭基和多個α氫，活性很高，而且其不同官能團上的氫原子具有不同的活性，既可作為羧酸又可作為酮參與反應[21]。除以往報道的棕櫚酸和油酸外，本研究還檢出了大量的C9—C24長鏈高級脂肪酸類成分，如棕櫚油酸、亞油酸、杜鵑花酸、月桂酸。首次通過溶劑提取、甲基化衍生的方法檢出L-天冬氨酸與L-苯丙氨酸。

1：草酸；2：丙二酸；3：戊酸；4：富馬酸；5：α-酮戊二酸；6：蘋果酸；7：琥珀酸；8：反式烏頭酸；9：檸檬酸；10：異檸檬酸；11：水楊酸；12：奎尼酸；13：莽草酸；14：棕櫚酸；15：亞油酸；16：油酸；17：10,13-二十碳二烯酸；18：10-羥基-十六烷酸；19：7-羥基-十八烷酸；20：十九烷酸；21：二十四烷酸；22：9,10-二羥基-十八烷酸；23：二十一烷酸；24：苯甲酸。底部橫座標與左側(cè)縱座標表示兩個主成分方差貢獻率，頂部模座標與右側(cè)縱座標表示自變量載荷值

圖6 綦江皺皮木瓜發(fā)育期果實有機酸組成聚類分析樹狀圖

3.2 綦江皺皮木瓜果實發(fā)育期總有機酸變化

以往研究表明成熟果實有機酸的組成與含量不僅受遺傳背景控制，也受產(chǎn)地環(huán)境和栽培管理方法影響，其積累和變化模式各不相同[19]。多數(shù)果樹有機酸通常是在果實生長早期積累，在成熟過程中逐步降低[5]。稀釋作用、呼吸代謝、合成量減少、輸入果實有機酸減少，以及糖異生作用均能導致果實成熟期有機酸含量下降[22]。桃、杏、李、葡萄、柑橘等果實發(fā)育過程中有機酸含量逐漸升高，生長停止轉(zhuǎn)入成熟階段有機酸含量下降[23]。但完熟果實中有機酸含量的多寡最終取決于果實中有機酸的合成、轉(zhuǎn)移、液泡貯藏和分解之間的平衡[24]，這種代謝平衡直接影響著果實酸度。本研究結(jié)果表明，重慶綦江皺皮木瓜果實膨大期后期（盛花后100 d），果實總有機酸含量緩慢上升，至膨大后期結(jié)束時（盛花后130 d）升至最高點；而進入果實轉(zhuǎn)色期，總有機酸含量再次呈下降趨勢變化，到果實完熟時（盛花后160 d），含量降至最低點，結(jié)果與以往其他多數(shù)果實發(fā)育過程總有機酸變化規(guī)律相一致。同時本研究結(jié)果與靳李娜[25]和李娜[26]報道的藥用皺皮木瓜采收期基本一致，但與齊紅[27]研究結(jié)果有差異，該文采用75%乙醇提取、堿溶酸沉結(jié)合電位滴定法檢測山東臨沂皺皮木瓜，從8月1日（12%）至9月15日（20%）果實總有機酸含量持續(xù)增加，9月15日（20%）至9月24日（17%）轉(zhuǎn)為下降。該差異可能是由于重慶與山東的氣候差異引起的，相對重慶綦江，山東臨沂皺皮木瓜盛花期延遲時間約為45 d。本研究結(jié)果與邵文豪等[28]對湖北長陽皺皮木瓜發(fā)育期可滴定酸測定結(jié)果基本一致，但其報道的長陽皺皮木瓜酸度峰值比重慶早了25 d，約為花后105 d。

3.3 綦江皺皮木瓜果實發(fā)育期有機酸代謝規(guī)律

有機酸在果實自身代謝中不僅參與了光合作用、吸吸作用，還參與合成酚類、氨基酸、酯類和芳香物質(zhì)代謝[15]。本研究首次揭示了我國皺皮木瓜發(fā)育期果實有機酸組成變化規(guī)律，結(jié)果表明綦江皺皮木瓜在坐果后，蘋果酸和檸檬酸含量極為豐富，屬蘋果酸-檸檬酸積累型果實；在果實發(fā)育期總有機酸與多數(shù)有機酸主要組分含量總體呈下降，而如乙酰丙酸等部分有機酸組分卻逐漸上升，到果實完熟期乙酰丙酸超過蘋果酸和檸檬酸，形成乙酰丙酸-蘋果酸-檸檬酸積累型果實。綦江皺皮木瓜蘋果酸、檸檬酸、奎尼酸、琥珀酸等主要酸味貢獻性成分及油酸、亞油酸、棕櫚酸和10-羥基-十六烷酸等弱酸味貢獻成分與總有機酸變化規(guī)律具有較高的一致性，而乙酰丙酸、草酸、異檸檬酸和硬脂酸的變化規(guī)律卻與總有機酸截然相反，呈負相關(guān)關(guān)系。在本文檢出的綦江皺皮木瓜特征性共有有機酸成分中，蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、a-酮戊二酸、烏頭酸、異檸檬酸是皺皮木瓜果肉細胞線粒體三羧酸循環(huán)代謝途徑的合成前體和中間產(chǎn)物，在三羧酸循環(huán)途徑中，檸檬酸是異檸檬酸的底物，繼而生成琥珀酸、α-酮戊二酸、富馬酸和蘋果酸[29]，但并沒有呈現(xiàn)出此消彼長的代謝規(guī)律，而是除異檸檬酸外，均呈現(xiàn)出較高的正相關(guān)關(guān)系，這是否與果實發(fā)育過程碳源供應流的變化具有相關(guān)性，需要進一步驗證。在TCA循環(huán)過程中，丙二酸為琥珀酸類似物，是琥珀酸脫氫酶強有力的競爭性抑制物，可通過阻斷三羧酸循環(huán)而促進琥珀酸積累[30]，但本文在果實發(fā)育過程中并未發(fā)現(xiàn)丙二酸與琥珀酸積累量的互抑關(guān)系。莽草酸和奎尼酸分別是莽草酸循環(huán)途徑酚酸類成分的最初底物和中間產(chǎn)物，是肉桂酸、芳香族氨基酸和其他多酚化合物的重要前體[31]，在果實發(fā)育過程中不斷下降，進而促進了果實成熟過程中其他香味物質(zhì)的合成與含量增加。乙酰丙酸（LA）是新一代平臺化合物，其重要衍生素5-氨基乙酰丙酸（5-ALA），是植物體內(nèi)所有卟啉類化合物合成的關(guān)鍵前體，不僅是一種代謝產(chǎn)物，也參與植物的生長發(fā)育，具有類似于植物激素的生理活性，低濃度時能夠調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、提高抗性、促進果實著色[32]，但乙酰丙酸在皺皮木瓜果實中出現(xiàn)的生物學意義仍不清楚，有待于進一步深入研究。水楊酸是植物體普遍存在的內(nèi)源激素，與植物體抗病反應和非生物協(xié)迫應答密切相關(guān)[33]，在皺皮木瓜果實膨大期含量不斷增加，而在轉(zhuǎn)色至完熟期不斷下降，可能與皺皮木瓜發(fā)育期保障果實克服不良條件并順利發(fā)育成熟關(guān)系密切。以長鏈高級脂肪酸為主的多數(shù)弱酸味有機酸成分在果實膨大后期含量上升，從轉(zhuǎn)色期到完熟期含量逐漸下降，這可能是由果實成熟過程中弱極性有機酸向酯類等香氣物質(zhì)轉(zhuǎn)化引起的。

4 結(jié)論

從重慶綦江皺皮木瓜（‘大羅’）發(fā)育期果實中分離得到共有特征性成分41種，所鑒定成分以低碳羧酸與長鏈高級脂肪酸為主，還包括一元酚酸、芳香族有機酸和氨基酸，相對含量較高成分主要有油酸（25.136%）、蘋果酸（21.473%）、亞油酸（12.079%）、棕櫚酸（6.785%）、乙酰丙酸（6.558%）、10-羥基-十六烷酸（5.420%）、檸檬酸（2.776%）、9,10-二羥基-十八烷酸（2.646%）、二十四烷酸（2.411%）、苯甲酸（2.079%）、十九烷酸（1.666%）、二十一烷酸（1.663%）、10,13-二十碳二烯酸（1.269%）、7-羥基-十八烷酸（1.102%）。從盛花后90 d到果實成熟（盛花后160 d），果實總有機酸含量呈現(xiàn)快速下降、緩慢上升再緩慢下降的變化趨勢，在整個發(fā)育期總強酸性有機酸和總?cè)跛嵝杂袡C酸均與總有機酸顯著正相關(guān)。

綦江皺皮木瓜檢出蘋果酸、檸檬酸等多數(shù)強酸性有機酸均與總強酸性有機酸極顯著正相關(guān)；綦江皺皮木瓜檢出油酸、亞油酸、棕櫚酸和10-羥基-十六烷酸等多數(shù)弱酸性有機酸均與總?cè)跛嵝杂袡C酸極顯著正相關(guān)。綦江皺皮木瓜果實發(fā)育過程中有機酸的積累模式由蘋果酸-檸檬酸積累型向完熟期乙酰丙酸-蘋果酸-檸檬酸積累型轉(zhuǎn)變，酸積累模式的轉(zhuǎn)變在重慶皺皮木瓜果實酸度與風味品質(zhì)決定中具有重要作用。

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Identification of the Fruit Characteristic Organic Acids offrom Qijiang, Chongqing by GC-MS and Their Dynamic Change Researching during Its Fruit Developing Period

LIU ShiYao, RAN Hui, MAO YunZhi, CHEN XinYu

(College of Horticulture and Landscape Architecture, South West University/Key Laboratory of Horticulture Science for Southwest Mountainous Regions, Ministry of Education, Chongqing 400715)

【Objective】The study was carried out to identify characteristic organic acids and disclosing their dynamic changing law offruit from Qijiang, Chongqing during its fruit developing period, so as to provide the basic data for thefruit organic acids metabolic research. 【Method】By methanol extracting, methyl derivating and GC-MS detecting, the organic acids composition and their content of 8 developing periodcv. Daluo fruit samples of Qijiang was measured. The 2012 chromatographic similarity analysis software of Chinese Pharmacopoeia Commission was used to match their common constituent peaks. The dynamic law of the total organic acids, strong-sour and weak-sour organic acids were showed in SigmaPlots10.0 software and the PCA and HCA of all the samples was processed separately by Simca-P 11.5 and SPSS 20.0 softwares. 【Result】 The total 41 common characteristic constituents, including 10 short-chain carboxylic acids, 21 long-chain fatty acids, 5 aromatic-organic acids, 3 monobasic-phenol acids and 2 amino-acids, were successfully matched among 8 TICs of different period fruit samplescv. Daluo from Qijiang. The baseline of all the TICs were smooth and stable, the organic acid derivatives peaks' distribution were well-distributed, and the separating-degree of samples’ peaks was high. All target components were well separated. The total organic acids content of Qijiangcv. Daluo fruit from 90thday after its full-bloom stage to 160thdays showed the changing on reversed ‘Z’ that including the sharply decreasing, slowly increasing and then decreasing again. The total organic acids content was significant positive correlated with the strong sour (=0.970) and the weak sour taste organic acids (=0.998). At the same time, the strong sour taste organic acids were significant positive correlated with short-chain carboxylic acids (=0.999) and positive correlated with monobasic phenol acids (=0.747). The weak sour taste organic acids were significant positive correlated with long chain fatty acids (=0.999). The malic acid, laevulic acid and citric acid, whose relative content sum was more than 90%, were the key ingredients of strong sour organic acids. The malic acid content had experienced a reverse ‘Z’ trend that decreased firstly (90thd-120thd), increased slightly (120thd-130thd) and decreased finally (130thd-160thd). The citric acid had a similar process, but the levulic acid had an obviously reverse process of changing with malic acid. Actually the levulic acid showed the increasing progress gradually. The correlation analysis showed that the strong sour taste organic acids had significant positive correlation with malate and citrate, but weakly negative correlation with levulic acid, isocitric acid, and salicylic acid. The analyzing result showed that most of the weak sour organic acids including 9-octadecenoic acid, 9,12-octadecadienoic acid, hexadecanoic acid and 10-hydroxy-hexadecanoic acid experienced the similar accumulating progress which was rapidly decreasing firstly, then slowly increased and decreased in the final stage. However, nonadecanoic acid showed an opposite process that was gradually increasing. Correlation analysis showed that the total weak sour organic acids were positively related to most of them such as 9-Octadecenoic acid and 9, 12-Octadecadienoic acid but negative to nonadecanoic acid. The PCA result by Simca-p 11.5 disclosed that PC1 and PC2 separately distributed 40.00% and 23.20% of the total variance contribution rate. The main component score of each sample showed that: S1 and S2 clustered together which decided by α-Ketoglutaric acid, malic acid, quinic acid, shikimic acid, hexadecanoic acid and linoleic acid. The S3, S4 and S5 got into one branch that mainly because of oleinic acid and 10-hydroxy-Hexadecanoic acid. The S6 was closer to S7 largely because of malonic acid, levulic acid, isocitric acid, salicyluric acid. The S8 formed a unit alone that mostly decided by succinic acid, nonadecanoic acid, tetracosanoic acid. This result was very similar to the other one that clustered by Ward's method with Squared Euclidean Distance in SPSS. 【Conclusion】cv. Daluo in Qijiang,Chongqing is a typical malate-accumulating fruit. During its developing period offruit, the accumulating pattern of organic acids changed from Malate-Citrate accumulating type on 90thdays to Levulinic acid-Malic acid - Citric acid accumulating type on 160thdays after its flower-blooming. The change of acid accumulation pattern played a key role in the determination of acidity and flavor quality offruit in Chongqing.

cv. Daluo; organic acids; GC-MS; fruit developing period; changing law

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.011

2018-06-28；

2018-10-18

國家自然科學基金（31400272）、中央高校基本業(yè)務費（XDJK2015C165）

通信作者劉世堯，E-mail：cqliushiyao@126.com

（責任編輯 趙伶俐）