賀靜瀾，張明，劉瑞瑩，萬貴鈞，潘衛(wèi)東，陳法軍

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近零磁場(chǎng)下干擾磁響應(yīng)關(guān)鍵基因?qū)诛w虱壽命的影響

賀靜瀾1，張明1，劉瑞瑩1，萬貴鈞1，潘衛(wèi)東2，陳法軍1

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2中國科學(xué)院電工研究所生物電磁學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190）

【目的】隱花色素（cryptochrome, Cry）和鐵硫簇蛋白IscA（iron-sulfur cluster assembly,即MagR）是生物體內(nèi)潛在的磁受體蛋白，本研究通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)，分別敲減褐飛虱（）體內(nèi)的磁響應(yīng)關(guān)鍵基因、和，旨在探明近零磁場(chǎng)（near-zero magnetic field，NZMF）環(huán)境下，以上3種基因在褐飛虱壽命調(diào)節(jié)過程中的作用，從而間接探討這3種基因?qū)Υ艌?chǎng)的響應(yīng)情況?！痉椒ā坎捎肦NAi技術(shù)，以實(shí)驗(yàn)室正常磁場(chǎng)環(huán)境下穩(wěn)定飼養(yǎng)的短翅初羽化褐飛虱雌雄成蟲為材料，通過向其體內(nèi)注射雙鏈RNA（dsRNA）分別抑制磁響應(yīng)關(guān)鍵基因、和，隨后立即分別放入正常磁場(chǎng)（geomagnetic field，GMF）和近零磁場(chǎng)中，于每日相同時(shí)間觀察記錄試蟲壽命。同時(shí)于注射后的1、2和3 d通過RNAiso Plus法提取GMF中褐飛虱雌成蟲總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈DNA，后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)該基因的表達(dá)情況，以確定基因干擾效率?！窘Y(jié)果】注射ds后，褐飛虱雌雄成蟲壽命在近零磁場(chǎng)和正常磁場(chǎng)間均無顯著差異。注射ds后，近零磁場(chǎng)中褐飛虱雌雄成蟲壽命比正常磁場(chǎng)分別顯著延長(zhǎng)27.78%和50.04%；此外，與注射ds處理相比，正常磁場(chǎng)下注射ds的雌成蟲壽命縮短，而近零磁場(chǎng)下注射ds的雌成蟲壽命延長(zhǎng)，但二者差異均不顯著；近零磁場(chǎng)和正常磁場(chǎng)下注射ds的雄成蟲壽命均縮短（25.41%和10.73%），且正常磁場(chǎng)下差異顯著。近零磁場(chǎng)中，注射ds的雌成蟲壽命較注射ds的壽命顯著縮短了16.48%，而雄成蟲壽命在磁場(chǎng)間、干擾處理間的差異均不顯著?！窘Y(jié)論】磁場(chǎng)變化下褐飛虱雌雄成蟲體內(nèi)3種磁響應(yīng)關(guān)鍵基因?qū)ζ鋲勖恼{(diào)節(jié)功能存在差異。其中，對(duì)磁場(chǎng)變化存在敏感響應(yīng)，表現(xiàn)為敲減該基因與磁場(chǎng)變化的互作顯著地影響雌雄成蟲壽命，且表現(xiàn)出“性二型性”；也可對(duì)磁場(chǎng)變化產(chǎn)生明顯響應(yīng)，但該響應(yīng)只存在于雌成蟲；此外，對(duì)磁場(chǎng)變化無響應(yīng)，該基因或與褐飛虱雌雄成蟲壽命調(diào)節(jié)無關(guān)。

磁場(chǎng)強(qiáng)度變化；褐飛虱；磁響應(yīng)基因；RNA干擾；成蟲壽命；磁生物學(xué)效應(yīng)

0 引言

【研究意義】磁場(chǎng)能以機(jī)械力的方式作用于一定范圍內(nèi)的磁體或運(yùn)動(dòng)電荷[1]。根據(jù)磁場(chǎng)的強(qiáng)度（用磁感應(yīng)強(qiáng)度B表示，單位為特斯拉，T），可人為地將磁場(chǎng)劃分為弱磁場(chǎng)（＜1 mT）、中等強(qiáng)度磁場(chǎng)（1 mT—1 T）、強(qiáng)磁場(chǎng)（1—5 T）和超強(qiáng)磁場(chǎng)（＞5 T）[2]。地球磁場(chǎng)（geomagnetic field，GMF）的平均場(chǎng)強(qiáng)為50 μT左右，屬于弱磁場(chǎng)范圍，而強(qiáng)度比地磁場(chǎng)更小的弱磁環(huán)境又可進(jìn)一步被定義為亞磁場(chǎng)（亞磁空間），也可稱近零磁場(chǎng)（near-zero magnetic field，NZMF）[3]。生物磁響應(yīng)（magnetic response）指生物感知磁場(chǎng)強(qiáng)度及方向的信息，并直接或間接地通過行為、生理、代謝等作出從宏觀表型到微觀分子水平響應(yīng)的現(xiàn)象[4]。目前對(duì)于弱磁場(chǎng)，尤其是地磁場(chǎng)，人們更側(cè)重于研究其對(duì)生物行為的影響，如以家鴿為代表的遷徙性動(dòng)物極有可能利用自地磁信息進(jìn)行定向和導(dǎo)航[5]；至于強(qiáng)磁場(chǎng)和超強(qiáng)磁場(chǎng)，人們則更關(guān)注這類磁場(chǎng)對(duì)人體造成的潛在威脅，如核磁共振成像時(shí)的短時(shí)強(qiáng)磁空間等[6]；因此磁場(chǎng)生物學(xué)效應(yīng)的研究一度集中于中等強(qiáng)度磁場(chǎng)[7]；而隨著近千年來地球磁場(chǎng)的不斷衰弱，針對(duì)強(qiáng)度低于地磁場(chǎng)強(qiáng)度——即近零磁場(chǎng)的生物磁響應(yīng)研究也逐漸增多。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，如果長(zhǎng)期處于該磁場(chǎng)環(huán)境下，動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)將產(chǎn)生障礙[8-12]，早期發(fā)育過程受到明顯影響[13-14]，而短期暴露近零磁場(chǎng)環(huán)境也會(huì)影響人體的健康[15-17]?？梢娺M(jìn)行有關(guān)近零磁場(chǎng)下生物的磁生理響應(yīng)研究，進(jìn)而推測(cè)地球磁場(chǎng)的變化對(duì)生物的不利效應(yīng)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大量研究有力地證實(shí)了生物可對(duì)磁場(chǎng)變化作出響應(yīng)，而相較于此，對(duì)于生物磁響應(yīng)機(jī)制的探索卻一直未有定論。事實(shí)上，生物對(duì)地磁場(chǎng)感知的關(guān)鍵在于“磁受體”（magnetoreceptor）的確定，對(duì)此學(xué)者們提出了多種假說，而其中有兩種得到了廣泛認(rèn)可，即磁顆粒介導(dǎo)的磁受體假說與依賴光的自由基對(duì)假說。前者認(rèn)為，生物可借助體內(nèi)的磁鐵礦（Fe3O4）顆粒感受磁場(chǎng)[18]，后者則認(rèn)為生物體內(nèi)的隱花色素（cryptochrome，Cry）可受光激發(fā)產(chǎn)生自由基對(duì)反應(yīng)，是理想的磁受體[19]。這兩種假說均具有堅(jiān)實(shí)的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，且目前科學(xué)家們更傾向于認(rèn)同生物磁響應(yīng)過程是這兩種機(jī)制共同作用的結(jié)果[20]。此外，近期我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了另一種潛在的磁受體[21]，即鐵硫簇蛋白IscA（iron-sulfur cluster assembly），IscA也被認(rèn)為是一種潛在的磁受體蛋白（magnetoreceptor protein，MagR）。該蛋白可與隱花色素結(jié)合形成復(fù)合物，體外實(shí)驗(yàn)證明該復(fù)合物不僅可感受磁場(chǎng)，且自身具有磁特性。同時(shí)，另一項(xiàng)側(cè)重于體內(nèi)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究也支持鐵硫簇蛋白中的一種：IscA1具有磁感受功能，但后者的研究結(jié)果表明該蛋白可不依賴隱花色素單獨(dú)調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)[22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)于昆蟲的磁生理響應(yīng)多集中于中等磁場(chǎng)和強(qiáng)磁場(chǎng)，而對(duì)于弱磁場(chǎng)特別是地磁場(chǎng)和近零磁場(chǎng)環(huán)境下昆蟲的生理變化研究較少[23]。褐飛虱（）是一種典型的夜間遷飛型害蟲，而夜間遷飛的昆蟲最可能利用地磁場(chǎng)作為其黑暗中的定向信號(hào)[24]，暗示其具有磁響應(yīng)的能力。利用超導(dǎo)量子磁強(qiáng)計(jì)結(jié)合普魯士藍(lán)染色觀察發(fā)現(xiàn)，褐飛虱腹部含有鐵磁性物質(zhì)，可能為Fe3O4，且這種鐵磁顆粒的含量與其翅型、性別和發(fā)育歷期等有關(guān)[25]。研究表明，相較于地球磁場(chǎng)，近零磁場(chǎng)可影響褐飛虱與白背飛虱（）的趨光性、飛行能力、卵及若蟲歷期、成蟲壽命以及翅型比率等，且實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）結(jié)果顯示，稻飛虱體內(nèi)與表達(dá)量在兩個(gè)磁場(chǎng)間存在顯著差異[26-27]，但進(jìn)一步的分子驗(yàn)證仍是空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于生物磁響應(yīng)現(xiàn)象與磁感受機(jī)制的研究現(xiàn)狀，以及前人針對(duì)稻飛虱對(duì)磁場(chǎng)的生理響應(yīng)表型實(shí)驗(yàn)，選擇褐飛虱雌雄成蟲體內(nèi)的磁響應(yīng)關(guān)鍵基因，即、以及潛在磁受體蛋白基因（即）作為研究對(duì)象，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)分別敲減以上3種基因，并分別暴露于南京本地磁場(chǎng)（GMF：49 μT）和近零磁場(chǎng)（NZMF：1.8 μT）中，通過比較RNAi的褐飛虱雌雄成蟲壽命的變化規(guī)律，探討3種磁響應(yīng)關(guān)鍵基因?qū)Υ艌?chǎng)變化的響應(yīng)及其對(duì)壽命的調(diào)控情況，為進(jìn)一步明確磁受體及磁響應(yīng)生物學(xué)通路打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.1 磁場(chǎng)發(fā)生裝置的建立

采用自主研發(fā)的直流電亥姆霍茲線圈創(chuàng)造穩(wěn)定的靜態(tài)磁場(chǎng)環(huán)境（專利號(hào)：ZL201320004497.5），以中心點(diǎn)為球心的直徑30 cm的球形范圍為該線圈可控制的有效磁場(chǎng)范圍，本研究中所使用的幾組線圈可控最小值范圍為500—1 800 nT，因此取1.8 μT為本試驗(yàn)中近零磁場(chǎng)磁場(chǎng)強(qiáng)度。共設(shè)置兩個(gè)穩(wěn)定靜態(tài)磁場(chǎng)，即模擬南京本地磁場(chǎng)強(qiáng)度的地磁場(chǎng)（GMF：49 μT），以及抵消絕大部分地磁場(chǎng)以達(dá)到近零水平的近零磁場(chǎng)（NZMF：1.8 μT）。在磁場(chǎng)搭建調(diào)試、試驗(yàn)的開始、過程及結(jié)束階段，使用磁通門計(jì)監(jiān)測(cè)各磁場(chǎng)處理的強(qiáng)度，以保證控制環(huán)境試驗(yàn)中磁場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置的穩(wěn)定性。

1.2 供試?yán)ハx與試驗(yàn)條件

供試褐飛虱采集自位于南京市的江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)稻田，飼養(yǎng)于室內(nèi)種植的感蟲水稻品種TN1上，溫室環(huán)境為溫度（26±1）℃，相對(duì)濕度80%，光周期14 L﹕10 D，磁場(chǎng)環(huán)境為南京本地地磁場(chǎng)。供試種群已于該環(huán)境內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)10代以上，且用于壽命分析的試蟲均為發(fā)育整齊的短翅型雌雄成蟲。

1.3 主要試劑

總RNA提取試劑RNAiso Plus（TaKaRa）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）、凝膠回收試劑盒AxyPrepTMDNA Gel Extraction kit（Axygen）、PCR試劑2×Fast Taq Master Mix（Gentbios）、零背景pTOPO-TA Simple克隆試劑盒（Aidlab）、感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1（TransGen Biotech）、質(zhì)粒抽提與純化試劑盒DNA Clean & ConcentratorTM-5（ZYMO RESEARCH）、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 RiboMAXTMExpress RNAi System（Promega）、RT-qPCR試劑SYBR?TM（TaKaRa）。

引物合成及測(cè)序均由南京金斯瑞科技有限公司完成。

1.4 dsRNA的制備

根據(jù)前期研究[28-29]，獲得褐飛虱（GenBank登錄號(hào)：KM108578）、（GenBank登錄號(hào)：KM108579）、（）（GenBank登錄號(hào)：KY026177）基因序列，經(jīng)NCBI網(wǎng)站進(jìn)行序列比對(duì)鑒定。應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)3種基因的上下游克隆引物，同時(shí)設(shè)計(jì)綠色熒光蛋白基因的克隆引物（表1，下劃線為T7啟動(dòng)子）。其中陰性對(duì)照的模板來自實(shí)驗(yàn)室保存的菌種。

取1.2中飼養(yǎng)的褐飛虱雌雄成蟲各3只，同性別試蟲冰浴中混合研磨勻漿后采用RNAiso Plus提取褐飛虱總RNA，其質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，濃度通過Nanodrop2000（Thermo，USA）進(jìn)行測(cè)定，隨后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit的操作要求，獲得可作為模板的cDNA序列。PCR反應(yīng)體系為2×FastTaq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol·L-1的上下游引物各1.5 μL，cDNA模板4 μL，ddH2O 18 μL，總反應(yīng)體系為50 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性20 s，60℃復(fù)性20 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)無誤后，通過凝膠回收試劑盒AxyPrepTMDNA Gel Extraction kit回收特定片段。

通過零背景pTOPO-TA Simple克隆試劑盒，將含有T7啟動(dòng)子的目的片段插入pTOPO-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，均勻涂布在含有1%青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)9 h，挑取單個(gè)菌落于1%青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37℃搖菌5 h，取1 μL菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并送南京金斯瑞科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過MEGA軟件進(jìn)行比對(duì)。最終，按照DNA Clean & ConcentratorTM-5試劑盒的說明書對(duì)合格的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，隨后按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 RiboMAXTMExpress RNAi System的操作說明合成dsRNA，退火及純化后最終獲得4種dsRNA，即ds、ds、ds及ds，調(diào)整濃度至4 000 ng·μL-1儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 本試驗(yàn)所用引物及序列

1.5 RNAi

隨機(jī)選取于1.2中飼養(yǎng)至初羽化1 d的短翅型雌雄成蟲進(jìn)行顯微注射，以其胸部中足和后足間的外側(cè)表皮處作為注射位點(diǎn)，并根據(jù)雌雄蟲體形差異，確定雌蟲注射量為75 nL，雄蟲注射量為50 nL。共設(shè)3個(gè)處理組，即注射 ds、ds和 ds；以注射ds的試蟲為陰性對(duì)照組。組內(nèi)再分雌雄性別和不同磁場(chǎng)處理。因磁場(chǎng)空間有限，該試驗(yàn)分3批進(jìn)行。注射后的試蟲以單頭單管的形式飼養(yǎng)于試管內(nèi)種植的15日齡TN1水稻苗上，并分別置于南京本地磁場(chǎng)的GMF（49 μT）和近零磁場(chǎng)NZMF（1.8 μT）中，溫濕度和光周期等環(huán)境條件同1.2。每日記錄各處理試蟲死亡情況。

1.6 干擾效率檢查

于RNAi處理后的24、48及72 h，隨機(jī)取各處理位于GMF中的雌蟲各9只，生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3次，進(jìn)行RNA抽提及基因RNAi后表達(dá)量情況測(cè)定。RT-qPCR采用20 μL體系，即SYBR?TM10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.4 μL，ROX Reference Dey 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。RT-qPCR反應(yīng)采用兩步法程序，即95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，循環(huán)40次。擴(kuò)增片段（引物列于表 1）經(jīng)過測(cè)序和原序列比對(duì)，以和基因?yàn)殡p內(nèi)參，以Comparative ΔΔCT法檢測(cè)褐飛虱、及的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Excel 2010軟件進(jìn)行匯總整理，并采用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，dsRNA的干擾效率通過獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行分析，敲減關(guān)鍵磁響應(yīng)基因（、、）、磁場(chǎng)變化（NZMF vs GMF）及其交互作用對(duì)褐飛虱雌雄成蟲壽命的影響分別通過雙因子方差分析（Two-way ANOVA）進(jìn)行比較，并采用群體T檢驗(yàn)進(jìn)行處理間差異顯著性比較（＜0.05為顯著，＜0.01為極顯著）。

2 結(jié)果

2.1 dsRNA干擾效率

RT-qPCR結(jié)果顯示，與注射ds的陰性對(duì)照相比，注射ds、ds和ds的雌成蟲體內(nèi)各對(duì)應(yīng)基因1—3 d的相對(duì)表達(dá)量均顯著或極顯著降低（＜0.05或0.01）。與注射ds的陰性對(duì)照相比，注射ds2 d后試蟲體內(nèi)表達(dá)量顯著降低了71%（＜0.05），注射3 d后該基因表達(dá)量仍維持在較低水平，但差異不顯著（圖1-A）；注射ds1—2 d后試蟲體內(nèi)表達(dá)量分別極顯著降低了49%和54%（＜0.01，圖1-B）；注射ds2—3 d后試蟲體內(nèi)表達(dá)量分別顯著降低了60%和53%（＜0.05，圖1-C）?？梢姡@微注射ds對(duì)3個(gè)磁響應(yīng)關(guān)鍵的靶標(biāo)基因具有相應(yīng)的干擾效果。

2.2 敲減NlCry1后褐飛虱雌雄成蟲在正常磁場(chǎng)和近零磁場(chǎng)環(huán)境下的壽命

RNAi、磁場(chǎng)變化及兩者之間的交互作用均未顯著影響褐飛虱雌雄成蟲的壽命（≤2.87，≥0.092，表2）。與注射ds的對(duì)照相比，GMF下注射ds的雌雄成蟲壽命分別縮短了8.36%（圖2-A）和20.26%（圖2-B），NZMF下注射ds的雌雄成蟲壽命分別延長(zhǎng)了11.97%（圖2-A）和7.23%（圖2-B）；與GMF相比，NZMF下注射ds的雌成蟲壽命縮短了6.70%（圖2-A），而雄成蟲壽命延長(zhǎng)了5.00%（圖2-B）。但以上RNAi處理以及磁場(chǎng)處理間差異均不顯著（＞0.05，圖2）。

試蟲均為初羽化短翅型雌成蟲，置于B=49 μT的GMF中；*和**分別表示經(jīng)T檢驗(yàn)處理間差異達(dá)P＜0.05和P＜0.01的顯著水平

表2 RNAi（dsNlCry1 vs. dsGFP）和磁場(chǎng)處理（GMF vs. NZMF）對(duì)褐飛虱雌雄成蟲壽命影響的雙因素方差分析

2.3 敲減NlCry2后褐飛虱雌雄成蟲在正常磁場(chǎng)和近零磁場(chǎng)環(huán)境下的壽命

磁場(chǎng)變化顯著影響了褐飛虱雄成蟲壽命（=4.14，=0.044＜0.05），且RNAi和磁場(chǎng)變化之間的交互作用還顯著影響了雌成蟲壽命（=4.45，=0.037＜0.05），并極顯著地影響了雄成蟲壽命（=7.08，=0.009＜0.01，表3）。與注射ds的對(duì)照相比，GMF下注射ds的雌成蟲壽命縮短了2.59%，而NZMF下注射ds的雌成蟲壽命延長(zhǎng)了13.07%，但差異均不顯著（＞0.05，圖3-A）；GMF下注射ds的雄成蟲壽命顯著縮短了25.41%（＜0.05），而在NZMF下注射ds的雄成蟲壽命縮短了10.73%，但差異不顯著（＞0.05，圖3-B）。與GMF相比，NZMF下注射ds的褐飛虱雌雄成蟲壽命分別顯著延長(zhǎng)了27.28%和50.04%（＜0.05，圖3）。

相同小寫字母和相同大寫字母分別表示同一磁場(chǎng)同一性別褐飛虱成蟲壽命在dsNlCry1與dsGFP處理之間，以及同一性別同一RNAi干擾處理下GMF和NZMF處理之間經(jīng)T檢驗(yàn)差異不顯著（P＞0.05）

表3 RNAi（dsNlCry2 vs. dsGFP）和磁場(chǎng)處理（GMF vs. NZMF）對(duì)褐飛虱雌雄成蟲壽命影響的雙因素方差分析

*＜0.05，**＜0.01。表4同The same as Table 4

2.4 敲減NlMagR后褐飛虱雌雄成蟲在正常磁場(chǎng)和近零磁場(chǎng)環(huán)境下的壽命

RNAi及其與磁場(chǎng)變化之間的交互作用均未顯著影響褐飛虱雌雄成蟲壽命（≤2.59，≥0.11），敲減僅在NZMF下顯著影響了雌成蟲壽命（=3.97，=0.048＜0.05，表4）。與注射ds的對(duì)照相比，GMF下注射ds的雌成蟲壽命縮短6.69%，NZMF下則顯著縮短16.48%（＜0.05，圖4-A）；GMF下注射ds的雄成蟲壽命延長(zhǎng)9.32%，而NZMF下則縮短12.98%，但二者差異并不顯著（＞0.05，圖4-B）；與GMF相比，NZMF下注射ds的褐飛虱雌雄蟲壽命分別縮短了12.16%和12.68%，但差異并未達(dá)到顯著水平（＞0.05，圖4）。

不同小寫字母和不同大寫字母分別表示同一磁場(chǎng)同一性別褐飛虱成蟲壽命在dsNlCry2與dsGFP處理之間，以及同一性別同一RNAi干擾處理下GMF和NZMF處理之間經(jīng)T檢驗(yàn)差異顯著（P＜0.05）

不同小寫字母和不同大寫字母分別表示同一磁場(chǎng)同一性別褐飛虱成蟲壽命在dsNlMagR與dsGFP處理之間，以及同一性別同一RNAi干擾處理下GMF和NZMF處理之間經(jīng)T檢驗(yàn)差異顯著（P＜0.05）

表4 RNAi（dsNlMagR vs. dsGFP）和磁場(chǎng)處理（GMF vs. NZMF）對(duì)褐飛虱雌雄蟲壽命影響的雙因素方差分析

3 討論

近年來，大量研究表明隱花色素（Cry）可作為潛在磁受體參與生物的磁場(chǎng)響應(yīng)過程。昆蟲中的果蠅只含有一種隱花色素，可作為研究該蛋白響應(yīng)磁場(chǎng)變化的模式生物。有關(guān)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，全光照下野生型果蠅可對(duì)磁場(chǎng)作出顯著反應(yīng)，而隱花色素缺陷的果蠅突變體則對(duì)磁場(chǎng)無響應(yīng)，有趣的是，當(dāng)屏蔽藍(lán)紫光（即隱花色素可接收的光譜）后，即使是野生型果蠅也不再響應(yīng)磁場(chǎng)的變化，證實(shí)了隱花色素的存在是果蠅進(jìn)行磁響應(yīng)活動(dòng)的必要條件，也為基于隱花色素的磁敏系統(tǒng)提供了首個(gè)遺傳學(xué)證據(jù)[30]。隨后，在有關(guān)晝夜節(jié)律的研究中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光光譜下磁場(chǎng)可增強(qiáng)隱花色素對(duì)果蠅生物鐘節(jié)律的“減緩”現(xiàn)象，而隱花色素突變體果蠅中則未觀察到這一現(xiàn)象[31]。此外，另有研究發(fā)現(xiàn)，果蠅的負(fù)趨地性會(huì)受到磁場(chǎng)的干擾，而這種“干擾”又受隱花色素的調(diào)節(jié)，具體而言，破壞隱花色素的羧基端后，磁場(chǎng)對(duì)果蠅負(fù)趨地性的影響消失，證明隱花色素在這一信號(hào)通路中發(fā)揮著重要的作用[32]。近期一項(xiàng)針對(duì)磁場(chǎng)對(duì)稻飛虱生物學(xué)效應(yīng)的研究表明，與GMF相比，NZMF使白背飛虱若蟲歷期延長(zhǎng)，并顯著縮短了長(zhǎng)翅未交配白背飛虱成蟲壽命；且RT-qPCR結(jié)果顯示，NZMF下5齡若蟲體內(nèi)的和均上調(diào)表達(dá)[33]。本研究中，注射ds后，相比GMF，NZMF中褐飛虱雌雄成蟲壽命均顯著延長(zhǎng)，而作為陰性對(duì)照的ds處理組雌雄蟲壽命在磁場(chǎng)間均無顯著差異，且雙因素方差分析顯示，磁場(chǎng)與干擾互作對(duì)褐飛虱成蟲壽命有極顯著影響，表明該基因可對(duì)磁場(chǎng)變化產(chǎn)生敏感響應(yīng)。此外，磁場(chǎng)與敲減的交互作用對(duì)不同性別的褐飛虱成蟲壽命的影響不同，具體表現(xiàn)為注射ds后，NZMF下褐飛虱雌雄成蟲壽命均呈現(xiàn)延長(zhǎng)趨勢(shì)；注射ds后，NZMF下褐飛虱雌雄成蟲壽命均出現(xiàn)縮短的趨勢(shì)；而注射ds后，NZMF下雌成蟲壽命延長(zhǎng)，雄成蟲壽命縮短，即表現(xiàn)“性二型性”。綜上所述，參與了褐飛虱成蟲的壽命調(diào)控，且該過程受到磁場(chǎng)影響，符合隱花色素可響應(yīng)磁場(chǎng)變化的假說。

本研究中，干擾后褐飛虱的成蟲壽命在不同磁場(chǎng)處理間存在顯著差異，而干擾后褐飛虱的成蟲壽命在磁場(chǎng)處理間無顯著差異，可見不同磁場(chǎng)環(huán)境下兩種隱花色素調(diào)控褐飛虱成蟲壽命的功能不同。隱花色素主要在動(dòng)物的生物鐘調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，可分為兩類，即光敏的Ⅰ型隱花色素和非光敏的Ⅱ型隱花色素；其中，Ⅰ型為藍(lán)光受體，在生物鐘系統(tǒng)中起著感光作用，而Ⅱ型為晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)過程中的反饋回路抑制子[34]。褐飛虱的兩種隱花色素基因與分別屬于動(dòng)物Ⅰ型與動(dòng)物Ⅱ型隱花色素。有研究表明，與在褐飛虱的發(fā)育生理中扮演著不同的角色，前者在褐飛虱的遷徙行為中發(fā)揮作用，而后者對(duì)晝夜節(jié)律的適應(yīng)顯示出更明顯的動(dòng)態(tài)變化[29]?？梢姼锌赡茏鳛閯?dòng)物生物鐘的核心組件。而生物鐘又可與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)協(xié)同作用[35-37]，二者可能間接調(diào)控昆蟲體內(nèi)激素穩(wěn)態(tài)，如蛻皮激素、保幼激素的分泌等[38-40]。因此，可能作為關(guān)聯(lián)磁場(chǎng)效應(yīng)與激素信號(hào)傳導(dǎo)的“橋梁”，進(jìn)而在褐飛虱的生物鐘系統(tǒng)中發(fā)揮潛在作用。另一方面，或與稻飛虱的趨光行為有關(guān)。Wan等研究表明，NZMF顯著提高了初羽化2日齡的白背飛虱內(nèi)的正趨光性；且RT-qPCR結(jié)果顯示，該時(shí)段內(nèi)其體內(nèi)上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)NZMF提高白背飛虱正趨光性或與羧基端多效性有關(guān)[27]。因此，作為Ⅰ型隱花色素，可能更多發(fā)揮感光受體作用，或參與調(diào)節(jié)磁場(chǎng)影響下的起飛或趨光等行為，而不參與磁場(chǎng)對(duì)褐飛虱壽命的調(diào)控。

鐵硫簇蛋白IscA屬于鐵硫蛋白亞家族hesB，是一類高度保守的蛋白。近期，Qin等研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在離體條件下具有磁性，推測(cè)可能是一種全新的磁受體蛋白[21-22]。Qin等[21]以離體實(shí)驗(yàn)為主，認(rèn)為鐵硫簇蛋白與隱花色素結(jié)合，前者感磁，后者感光，協(xié)同發(fā)揮“生物指南針”功能；而Long等[22]以線蟲為研究對(duì)象，認(rèn)為鐵硫簇蛋白不需與隱花色素結(jié)合便可發(fā)揮磁受體功能。但該理論提出后受到質(zhì)疑，且缺乏活體驗(yàn)證，至今仍無后續(xù)相關(guān)報(bào)道。本研究中，NZMF下干擾的褐飛虱雌蟲壽命顯著短于對(duì)照處理，而雄蟲中雖有相似趨勢(shì)，卻未達(dá)顯著水平，推測(cè)NlMagR或?qū)Υ艌?chǎng)存在一定的感知，且它的缺失可縮短雌蟲壽命，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)發(fā)育。鐵硫簇蛋白是一類重要的線粒體內(nèi)蛋白，MagR（IscA）對(duì)于維持線粒體穩(wěn)定以及調(diào)控呼吸能量代謝具有重要生物學(xué)意義。有研究表明，缺失該基因會(huì)導(dǎo)致鐵元素在酵母菌線粒體內(nèi)累積，進(jìn)而使其無法正常生長(zhǎng)[41-43]。此外MagR（IscA）也是線粒體鐵硫蛋白成熟所必需的組裝蛋白，敲除斑馬魚體內(nèi)的會(huì)導(dǎo)致其血紅蛋白缺失，從而造成重度貧血[44]。最近有關(guān)該基因在人類疾病方面的研究也表明，IscA的異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生，如腦白質(zhì)病變與神經(jīng)退行性疾病[45]以及槭糖尿病[46]。本試驗(yàn)中，GMF條件下干擾后，相較于dsGFP處理，褐飛虱雌成蟲壽命縮短但不顯著，但NZMF條件下干擾該基因后的試蟲壽命進(jìn)一步縮短達(dá)并到顯著水平，這可能暗示了：（1）NlMagR（即鐵硫簇蛋白）的缺失對(duì)褐飛虱雌成蟲有消極影響，原因可能是上文提到的線粒體或鐵硫蛋白受損等；（2）NZMF“放大”了NlMagR缺失帶來的消極影響。據(jù)此推測(cè)NlMagR可以感受磁場(chǎng)的變化，并在褐飛虱雌成蟲的壽命這一體征中有所體現(xiàn)，符合“生物磁受體”的理論要求。

4 結(jié)論

對(duì)于遷飛型害蟲褐飛虱而言，其體內(nèi)對(duì)磁場(chǎng)變化存在響應(yīng)，表現(xiàn)為敲減該基因與磁場(chǎng)變化的互作可對(duì)褐飛虱雌雄蟲壽命產(chǎn)生顯著影響，且具有“性二型性”；（）也可對(duì)磁場(chǎng)產(chǎn)生一定響應(yīng)，但該響應(yīng)只存在于雌蟲中，雄蟲的影響不明顯；而以壽命為指標(biāo)不能判定對(duì)磁場(chǎng)變化是否存在響應(yīng)，該基因或與褐飛虱壽命調(diào)節(jié)無關(guān)。研究結(jié)果可為進(jìn)一步明確生物磁受體以及磁響應(yīng)生物學(xué)通路提供有力的理論支撐。

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Effects of the interference of key magnetic response genes on the longevity of brown planthopper () under near-zero magnetic field

He JingLan1, Zhang Ming1, Liu RuiYing1, Wan GuiJun1, Pan WeiDong2, Chen FaJun1

(1College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Beijing Key Laboratory of Bioelectromagetics, Institute of Electrical Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190)

【Objective】cryptochrome (Cry) and iron-sulfur cluster protein IscA (iron-sulfur cluster assembly, MagR) are potential magnetic receptor proteins in organisms. In this study, key magnetic response genes of the brown planthopper () were knocked-down by RNA interference (RNAi), including,and. The objective of this study is to investigate the role of these three magnetic response genes in the longevity mediation ofin near-zero magnetic field (NZMF). Thus, the response of these three genes to magnetic field could be studied indirectly.【Method】Newly emerged brachypterous female and male adults offed in the lab magnetic field were chosen as the experimental material, and RNAi technology was used to inhibit the key magnetic response genes’ (,and) expression by injection of double stranded RNA, respectively. Then the RNAi treated adults were immediately transformed into the geomagnetic field (GMF) and NZMF respectively to observe their longevity. the total RNA of the RNAi treated adults under GMF was extracted by using the RNAiso Plus method on the 1st, 2nd and 3rd day after the microinjection, respectively. And then the gene expressions of,andwere measured by using the RT-qPCR (real-time quantitative polymerase chain reaction) after the reverse transcription synthesis of first strand DNA in order to test the efficiency of RNAi. 【Result】There was no significant difference in the longevity of female and male adults after the injection of dsbetween the treatments of NZMF and GMF, while after the injection of ds, the longevity of female (27.78%) and male (50.04%) adults under NZMF was significantly longer than that of the individuals under GMF, respectively. Moreover, the longevity of female adults injected with dswas shorter under GMF while longer under NZMF than that of individuals injected with ds, even if the difference was not significant. The longevity of male adults injected with dswas shorter than that of individuals injected with dsunder NZMF (25.41%) and GMF (10.73%), respectively, and the difference under GMF reached the significant level. Furthermore, the longevity of female adults injected with dswas significantly shorter (16.48%) than that of individuals injected with dsunder the NZMF. 【Conclusion】There is a difference in the regulation of the key genes of magnetic susceptibility (,and) on the female and male longevity forunder the change of magnetific field. Hereinto, thesusceptibly responses to the changes of magnetic fields, which shows that the gene knock-down and its interaction with magnetic field changes can significantly influence the longevity of female and male adults, and characterized as “sexual dimorphism”. Similarly, the()also sensitively responds to magnetic field changes, but just for the female adults ofunder the NZMF in contrast to the GMF. However, there is no response ofto magnetic field changes, and this gene may not be involved in the regulation of female and male longevity for.

magnetic field changes;brown planthopper ();magnetic response gene; RNA interference (RNAi); adult longevity; magnetic bio-effect

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.01.005

2018-08-02；

2018-09-11

國家自然科學(xué)基金（31670855）、國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31701787）、江蘇省自然科學(xué)基金青年基金（BK20160717）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)青年科技創(chuàng)新基金（KJQN201820）

賀靜瀾，E-mail：2016102054@njau.edu.cn。通信作者陳法軍，E-mail：fajunchen@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）