劉攀道 吳喜鵲 羅佳佳 許文茸 劉國道

摘? 要? 甲殼質(zhì)是真菌細胞壁、昆蟲外骨骼和甲殼類動物外殼的主要成分。甲殼質(zhì)的降解主要依賴甲殼質(zhì)酶的水解作用。誘導(dǎo)PR-3類甲殼質(zhì)酶蛋白積累是植物增強對真菌性病害抗性的適應(yīng)性機制。柱花草是一種重要的熱帶豆科牧草，由膠孢炭疽菌引起的炭疽病是危及柱花草生產(chǎn)的主要真菌性病害。但柱花草甲殼質(zhì)酶對炭疽菌侵染的響應(yīng)仍不清楚。本研究旨在鑒定柱花草PR-3類甲殼質(zhì)酶基因，并對其表達模式、編碼蛋白的生化酶學(xué)性質(zhì)進行分析。結(jié)果表明：通過同源克隆獲得了1個柱花草PR-3類甲殼質(zhì)酶基因，其編碼區(qū)序列全長984 bp，屬于糖苷水解酶19家族的ClassⅠ亞族，將其命名為SgGH19-1。熒光定量PCR分析表明，接種炭疽菌誘導(dǎo)SgGH19-1在柱花草葉片中顯著增強表達，并伴隨著甲殼質(zhì)酶活性的提高。隨后，在大腸桿菌中表達純化了SgGH19-1重組蛋白，生化酶學(xué)性質(zhì)表明，SgGH19-1蛋白兼具甲殼質(zhì)內(nèi)切酶與外切酶活性，但內(nèi)切酶活性比外切酶活性高9.1倍。SgGH19-1的最適pH為5.0，最適溫度為40 ℃。綜上所述，SgGH19-1基因參與柱花草對炭疽菌侵染的響應(yīng)，其編碼的蛋白具有甲殼質(zhì)酶活性，可作為柱花草抗炭疽病育種的分子標記。

關(guān)鍵詞? 甲殼質(zhì);甲殼質(zhì)酶;柱花草;蛋白純化;酶學(xué)性質(zhì)

中圖分類號? S541? ? ? 文獻標識碼? A

Cloning and Expression of a Chitinase Gene SgGH19-1 from Stylosanthes and Its Enzymatic Properties Analysis

LIU Pandao1， WU Xique2， LUO Jiajia1， XU Wenrong2*， LIU Guodao1*

1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 2. Department of Chemistry， School of Science， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract? Chitin is a major component of the cell wall of fungi， exoskeleton of insects， and crustacean shells. Chitinase is one of the main hydrolase that catalyzes the degradation of chitin. Induction of PR-3 chitinase protein accumulation is an adaptive mechanism for plants to enhance the resistance to fungal diseases. Stylo （Stylosanthes spp.） is an important tropical forage legume. Although anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is one of the most destructive fungal diseases of stylo， little information is available regarding the responses of stylo chitinase during the pathogen infection. In the study， the PR-3 chitinase of stylo was characterized， and its expression pattern and biochemical properties were also analyzed. The results showed that a chitinase gene of PR-3 group in stylo was the cloned by homologous gene sequence method， and its coding region was 984 bp. The gene belongs to the Class I chitinase of the glycoside hydrolase 19 family， and was named SgGH19-1. Quantitative PCR analysis showed that the expression level of SgGH19-1 gene in the leaves of stylo was significantly increased after C. gloeosporioides infection， and with the increase of chitinase activity. Subsequently， the recombinant protein of SgGH19-1 was expressed and purified in Escherichia coli. Biochemical properties of SgGH19-1 showed both exochitinase and endochitinase activities， and the activities of endochitinase was 9.1 fold higher than that of exochitinase. Furthermore， the optimum pH and temperature for SgGH19-1 activity was 5.0 and 40 ℃ respectively. Taken together， SgGH19-1 is a chitinase that involved in the response of stylo to C. gloeosporioides attack. These results herein suggest that SgGH19-1 could potentially be employed as a new marker gene for developing cultivars of stylo with great tolerance to anthracnose.

Keywords? chitin; chitinase; Stylosanthes; protein purification; enzymatic property

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.014

甲殼質(zhì)（chitin），又名甲殼素、幾丁質(zhì)，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc）以β-1，4糖苷鍵連接而成的天然高分子化合物[1]。甲殼質(zhì)普遍存在于真菌的細胞壁、蟹蝦和貝類等甲殼動物的外殼以及昆蟲的外骨骼等[2]。據(jù)估計，在自然界中甲殼質(zhì)的生物合成量每年超過千億噸，是僅次于纖維素的第二大天然生物質(zhì)資源[3]。近年來，由甲殼質(zhì)及其脫乙酰產(chǎn)物殼聚糖（chitosan）降解后產(chǎn)生的衍生物，被用于化工、食品、制藥、材料科學(xué)和農(nóng)業(yè)等眾多領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。但是目前對甲殼質(zhì)的降解主要采用化學(xué)方法，幾乎都要用到強酸、強堿，對環(huán)境污染大，且產(chǎn)物分子量不均勻[6]。利用生物酶學(xué)方法降解甲殼質(zhì)具有專一性強、酶解效率高和環(huán)保等優(yōu)點，因此是替代化學(xué)方法的理想技術(shù)，正受到越來越多的關(guān)注[7]。

甲殼質(zhì)的生物酶解主要通過甲殼質(zhì)酶（chitinase），也被稱為甲殼素酶或幾丁質(zhì)酶。甲殼質(zhì)酶是一種能夠催化甲殼質(zhì)的β-1，4糖苷鍵裂解產(chǎn)生N-乙酰葡萄糖胺寡聚體的水解酶類[8]。目前，甲殼質(zhì)酶已經(jīng)在細菌、真菌、動物和植物中被廣泛鑒定，并根據(jù)其對底物的切割位點不同，被分為甲殼質(zhì)外切酶（exochitinase）和甲殼質(zhì)內(nèi)切酶（endochitinase）[9-10]。在植物中，從擬南芥、煙草和菜豆等中鑒定到一類受病原菌誘導(dǎo)表達的PR-3蛋白，它們具有甲殼質(zhì)酶活性，屬于病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related proteins， PRs），如擬南芥的AtPR-3，這些甲殼質(zhì)酶蛋白的主要作用是當植物受到病原菌侵害時，水解真菌細胞壁中的甲殼質(zhì)，具有抗真菌作用[11]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是一種熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的豆科牧草與綠肥植物，可用作飼草、果園覆蓋、水土保持和間作等[12]。由真菌類病原菌膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病是危及柱花草生產(chǎn)的主要病害[13]。目前，柱花草中PR-3類甲殼質(zhì)酶基因?qū)μ烤揖秩镜捻憫?yīng)仍不清楚。本研究將通過分子生物學(xué)方法，同源克隆柱花草PR-3類甲殼質(zhì)酶基因，并對該基因編碼的蛋白進行表達、純化和生化酶學(xué)性質(zhì)分析，以期解析甲殼質(zhì)酶在柱花草抗炭疽病過程中發(fā)揮的作用。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究所用的熱研2號柱花草（Stylosanthes guianensis cv. Reyan 2）和膠孢炭疽菌由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室提供。

1.2? 方法

1.2.1? 柱花草炭疽菌接種? 柱花草種子經(jīng)80 ℃熱水浸泡2 min后，播種于裝有基質(zhì)（腐殖土∶蛭石=1∶1）育苗盒中，每3 d澆一次1/2 Hoagland營養(yǎng)液。幼苗培養(yǎng)1個月后，參照Wang等[14]的方法，制備炭疽菌孢子懸浮液并接種柱花草幼苗，簡要實驗步驟如下：配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，劃板接種膠孢炭疽菌，28 ℃暗培養(yǎng)10 d，無菌水洗脫孢子，控制孢子濃度在106個/mL，并加入0.2% Tween-20。接種室溫度28 ℃，濕度90%以上，用孢子懸浮液噴灑柱花草幼苗葉片至凝成水珠。分別在接種0、24、48、72、96 h后收取葉片材料用于測定相關(guān)指標。

1.2.2? 柱花草PR-3同源基因的克隆與進化樹分析? 柱花草PR-3同源基因的克隆參照Liu等[15]的方法。首先，對不同植物中的PR-3基因進行多序列比對，包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）的At3G12500（AtPR-3）、大豆（Glycine max）的Glyma02g04820、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的Medtr8g074330和菜豆（Phaseolus vulgaris）的Phvul.003G268500。根據(jù)這些基因的保守序列設(shè)計同源克隆引物SgPR-3-EST-F/R（表1），以熱研2號柱花草的cDNA為模板，通過PCR擴增及測序獲得柱花草PR-3同源基因的EST片段序列。隨后，采用的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒（Clotech，美國）擴增柱花草PR-3基因的5′末端和3′末端。即根據(jù)獲得的EST序列分別設(shè)計正向和反向引物SgPR-3-5′RACE-R和SgPR-3-3′RACE-F，分別與試劑盒中的通用引物RACE-UPM和RACE-NUP（表1）配對，通過RACE擴增得到5′和3′端序列，拼接后獲得柱花草PR-3基因的cDNA全長序列，并用引物SgPR-3-ORF- F/R（表1）擴增全長序列?；蚨嘈蛄斜葘Α被嵝蛄斜葘瓦M化樹構(gòu)建分別采用DNAMAN、Clustal X和MEGA 5軟件。根據(jù)同源比對結(jié)果，將柱花草PR-3基因命名為SgGH19-1。

1.2.3? SgGH19-1基因的表達模式分析? 參照劉攀道等[16]的熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析SgGH19-1基因的表達模式。即：柱花草總RNA提取采用TRIzol試劑盒（Invitrogen，美國）;cDNA第1鏈合成采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Promega，美國）;qRT-PCR分析運用SYBR Green（TaKaRa，日本）試劑盒在Rotor-Gene 3000 qRT-PCR系統(tǒng)（Corbett Research，澳大利亞）進行反應(yīng)。根據(jù)SgGH19-1基因序列設(shè)計qRT-PCR引物SgGH19-1-RT-F/R（表1）。SgEF-1a作為柱花草的內(nèi)參看家基因，qRT-PCR引物為SgEF-1a- RT-F/R（表1）。基因相對表達量=目的基因表達量/內(nèi)參看家基因表達量。

1.2.4? SgGH19-1重組蛋白的表達與純化? 根據(jù)本實驗室Chen等[17]已建立的方法，表達純化GST：SgGH19-1融合重組蛋白。即：設(shè)計SgGH19- 1-GST-F/R引物（表1），通過PCR擴增獲得SgGH19-1基因全長序列并克隆進PGEX-6P-3質(zhì)粒（GE Healthcare，美國）的GST編碼序列下游，構(gòu)建成SgGH19-1-GST原核表達載體。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)GST：SgGH19-1蛋白在大腸桿菌中表達。收集菌體，用8 mL Binding buffer（140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，Ph 7.3）重懸沉淀，并用超聲波碎解菌體，離心后收集上清。上清與2 mL谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠（Glu t a thione Sepharose 4B;GE Healthcare，美國）在4 ℃下反應(yīng)3 h，然后用Binding buffer洗脫3次，最后用Elution buffer（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L還原型谷胱甘肽，pH 8.0）洗脫目的蛋白。對純化后的GST：SgGH19-1融合蛋白通過SDS-PAGE電泳分析蛋白純度。

1.2.5? 甲殼質(zhì)酶活性測定? 采用試劑盒（貨號：CS0980;Sigma-Aldrich，美國）檢測甲殼質(zhì)酶活性。甲殼質(zhì)外切酶和甲殼質(zhì)內(nèi)切酶活性測定底物分別為4-硝基苯基-β-D-N，N′-二乙酰殼二糖苷（4-Nitrophenyl N，N′-diacetyl-β-D-chitobioside）和4-硝基苯基-β-D-N，N′，N′′-三乙酰殼三糖苷（4-Ni tr ophenyl β-D-N，N′，N′′-triacetylchitotriose）。簡要步驟如下：底物用醋酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH 5.0）溶解至0.2 mg/mL;取適量酶蛋白液（約含1 μg蛋白）加入90 μL底物溶液中，并用醋酸鈉緩沖液補足100 μL;樣品混勻后在37 ℃反應(yīng)30 min;加入100 μL碳酸鈉溶液（0.4 mol/L）終止反應(yīng);混勻并靜置2 min后測定OD405的吸光度值，以計算甲殼質(zhì)酶催化底物降解釋放的4-硝基苯酚;酶活力單位1 U表示1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量;酶活性用單位蛋白（mg）的酶活力單位（U）表示。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS18.0軟件（IBM-SPSS，美國）對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)可視化作圖采用Microsoft Excel 2013軟件（Microsoft，美國）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 柱花草PR-3同源基因的克隆及蛋白進化樹分析

根據(jù)擬南芥、大豆、菜豆和蒺藜苜蓿PR-3同源基因的保守序列設(shè)計引物，通過PCR擴增獲得了柱花草PR-3同源基因的414 bp EST序列（圖1）。隨后，以柱花草cDNA RACE文庫為模板，根據(jù)獲得的EST序列分別設(shè)計正、反向特異引物，并與通用引物配對擴增出柱花草PR-3同源基因的5′端與3′端序列（圖1）。序列經(jīng)拼接后，獲得柱花草PR-3同源基因的開放閱讀框（ORF）為984 bp（圖1），共編碼327個氨基酸。該基因序列已上傳NCBI網(wǎng)站（accession number：MN064559），并將其命名為SgGH19-1。對SgGH19-1及擬南芥和水稻甲殼質(zhì)酶蛋白的系統(tǒng)進化樹分析如圖2所示，植物的甲殼質(zhì)酶可分為5個亞族，即ClassⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ，其中ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ屬于糖苷水解酶19家族（Glyco_hydro_19），而ClassⅢ和Ⅴ屬于糖苷水解酶18家族（Glyco_hydro_18）。SgGH19-1與擬南芥PR-3同源性最高，屬于Glyco_hydro_19的ClassⅠ亞族（圖2）。

2.2? 柱花草SgGH19-1基因響應(yīng)炭疽菌侵染的表達模式分析

通過qRT-PCR分析SgGH19-1基因?qū)μ烤揖秩镜捻憫?yīng)，如圖3所示，接種炭疽菌24 h后，SgGH19-1在柱花草葉片中的表達量比對照（0 h）提高2.4倍，差異顯著（P<0.05）。隨著炭疽菌侵染時間延長，SgGH19-1的表達量逐漸增加，并在接種72 h后達到最大值，表達量為0 h的7.1倍（P<0.05）（圖3）。以上結(jié)果說明炭疽菌侵染誘導(dǎo)SgGH19-1基因上調(diào)表達。

2.3? 膠孢炭疽菌侵染對柱花草葉片甲殼質(zhì)酶活性的影響

如圖4A所示，柱花草葉片的甲殼質(zhì)內(nèi)切酶活性在接種炭疽菌48 h后顯著高于對照（0 h）（P<0.05），并隨著接種時間延長酶活性逐漸增加，接種96 h后酶活性達到最大值，為0 h的4.0倍（P<0.05）。甲殼質(zhì)外切酶活性在炭疽菌侵染72和96 h后均為對照（0 h）的2倍以上，差異顯著（P<0.05）（圖4B）。以上結(jié)果說明，炭疽菌侵染顯著提高了柱花草葉片的甲殼質(zhì)酶活性。

2.4? SgGH19-1蛋白的表達純化及酶學(xué)特性分析

通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達SgGH19-1融合GST標簽的重組蛋白，SDS-PAGE電泳分析如圖5A所示，GST：SgGH19-1融合蛋白分子量約為61 kDa（SgGH19-1：35 kDa;GST：26 kDa），IPTG可誘導(dǎo)該蛋白表達（泳道2）。利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B分離純化目標蛋白，經(jīng)蛋白洗脫

不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

液第2次洗脫獲得較高純度的GST：SgGH19-1蛋白，基本無雜蛋白污染（圖5A，泳道4）。酶學(xué)性質(zhì)分析表明，GST：SgGH19-1同時具有甲殼質(zhì)內(nèi)切酶與外切酶活性，但內(nèi)切酶活性較高，為外切酶活性的9.1倍，差異顯著（P<0.05）（圖5B）。隨后，分析了pH和溫度對GST：SgGH19-1甲殼質(zhì)內(nèi)切酶活性的影響，結(jié)果表明GST：SgGH19-1的最適pH為5.0，最適溫度為40 ℃（圖6）。

3? 討論

植物病程相關(guān)蛋白PRs是一類受病原體或其他外界因子刺激誘導(dǎo)表達的蛋白質(zhì)，在植物抗病性調(diào)節(jié)和適應(yīng)逆境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[11]。根據(jù)PRs蛋白的電泳遷移率、血清學(xué)關(guān)系和生物活性等，可將它們分為17類（PR-1～PR-17）[18]。其中，PR-3、PR-4、PR-8和PR-11屬于甲殼質(zhì)酶[19]。PR-3是植物中最早被鑒定具有甲殼質(zhì)酶活性的病程相關(guān)蛋白[18]。目前，在煙草、擬南芥和菜豆等植物中已發(fā)現(xiàn)PR-3基因受病原菌侵染誘導(dǎo)增強表達[11]。本研究中，我們同源克隆了1個柱花草的PR-3基因，即SgGH19-1。接種炭疽菌后，柱花草葉片中SgGH19-1基因的表達水平顯著提高，并且伴隨著葉片甲殼質(zhì)內(nèi)切酶與外切酶活性的顯著增加。這些結(jié)果表明，SgGH19-1對炭疽菌侵染存在響應(yīng)，并參與了甲殼質(zhì)酶活性調(diào)節(jié)，以此來增強柱花草的抗病性。與之類似，Wang等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，接種炭疽菌后，柱花草中另外1個甲殼質(zhì)酶基因Cht也顯著增強表達。目前，植物中一些對病原菌侵染敏感響應(yīng)的甲殼質(zhì)酶基因，已被作為標記基因用于植物疾病的早期診斷，如水稻甲殼質(zhì)酶用于對稻瘟病的快速檢測[20]。

M：蛋白Marker（10～120 kDa）; A：SDS-PAGE分析大腸桿菌表達的GST：SgGH19-1蛋白;1：不加IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白;2：加入IPTG誘導(dǎo)的大腸桿菌總蛋白;3：經(jīng)洗脫1次純化的SgGH19-1重組蛋白;4：經(jīng)洗脫2次純化的SgGH19-1重組蛋白。

B：SgGH19-1蛋白的酶活性分析，不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

M： Protein Marker （10120 kDa）; A： SDS-PAGE analysis of GST：SgGH19-1 protein in E. coli. 1： Total E. coli protein without IPTG induction; 2： Total E. coli protein induced by IPTG; 3： Purified recombinant SgGH19-1 protein after once elution; 4： Purified recombinant SgGH19-1 protein after twiceelution. B： Enzyme activity analysis of SgGH19-1 protein， the different lowercase

SgGH19-1基因在接種炭疽菌24 h后就迅速上調(diào)表達，有潛力作為柱花草炭疽病檢測的標記基因。

甲殼質(zhì)酶在微生物（真菌、細菌和病毒）、動物和植物中已被廣泛鑒定，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)特征，這些不同來源的甲殼質(zhì)酶被分為糖苷水解酶18、19、23和48家族（Glyco_hydro_18/19/23/48）[21]。但目前植物中鑒定的甲殼質(zhì)酶主要屬于糖苷水解酶18家族和19家族，其中18家族包括Class Ⅲ和Ⅴ 2類甲殼質(zhì)酶，而19家族包括ClassⅠ、Ⅱ和Ⅳ共3類甲殼質(zhì)酶[10]。本研究鑒定的柱花草SgGH19-1屬于糖苷水解酶19家族的ClassⅠ類甲殼質(zhì)酶。雖然植物中不含甲殼質(zhì)，但當受到病原真菌侵染時，植物會合成大量的甲殼質(zhì)酶蛋白[22]。這主要是由于甲殼質(zhì)酶能夠水解真菌細胞壁中的甲殼質(zhì)，破壞真菌細胞骨架，從而抑制真菌的致病力和生長發(fā)育，實現(xiàn)抗菌的生物學(xué)功能[11]。本研究中，我們成功在大腸桿菌中表達了SgGH19-1重組蛋白，并對純化的蛋白進行了生化酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明，SgGH19-1具有較強的甲殼質(zhì)內(nèi)切酶活性，即其能夠作用于甲殼質(zhì)內(nèi)部的β-1，4-糖苷鍵，形成二乙酰殼二糖和可溶的低分子殼寡糖。此外，SgGH19-1同時也具有相對較弱的甲殼質(zhì)外切酶活性，即其能夠催化甲殼質(zhì)從非還原性末端釋放二乙酰殼二糖。這些結(jié)果暗示著，當受到炭疽菌侵染時，柱花草通過合成甲殼質(zhì)酶，如SgGH19-1等，來抑制炭疽菌對宿主的侵害。蔣昌順等[23]通過體外實驗已經(jīng)證明，水稻的甲殼質(zhì)酶的粗提物能顯著抑制柱花草膠孢炭疽菌的生長。

通過基因工程方法導(dǎo)入或者超量表達甲殼質(zhì)酶編碼基因，已被證明能夠顯著提高多種植物對真菌性病害的抗性，如：超量表達水稻的1個PR-3類甲殼質(zhì)酶基因（chi11），顯著增強了轉(zhuǎn)基因水稻株系對紋枯病的抗性[24];在馬鈴薯中異源超量表達煙草的PR-3基因顯著提高馬鈴薯對晚疫病的抗性[22];將水稻的2個幾丁質(zhì)酶基因（rcg3和rcc2）導(dǎo)入香蕉，能夠顯著降低黑條葉斑病菌（My c os phaerella fijiensis）對香蕉的侵染等[25]。綜上所述，本研究從柱花草中鑒定了1個對炭疽菌侵染快速響應(yīng)的甲殼質(zhì)酶基因SgGH19-1，其編碼的蛋白具有甲殼質(zhì)內(nèi)切酶與外切酶活性，該基因可作為柱花草抗炭疽病育種的候選基因資源。

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