劉允熙，羅佳佳，雷 健，劉國道*，劉攀道*

(1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南 ?？? 570228；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口, 571101)

磷(phosphorus，P)是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素之一，不僅是生物大分子(如DNA,RNA、磷脂質(zhì)、ATP等)的重要結(jié)構(gòu)成分，而且參與植物多種細(xì)胞進(jìn)程(如光合作用、能量轉(zhuǎn)移和碳代謝的細(xì)胞信號傳導(dǎo)和調(diào)控等)[1-2]。土壤中能被植物直接吸收利用的無機(jī)可溶性磷酸鹽(orthophosphate，Pi)僅占全磷含量的1%左右[3]，磷有效性較低，這嚴(yán)重限制了作物和牧草的生長和產(chǎn)量[4-6]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，農(nóng)民大量施用磷肥以應(yīng)對低磷脅迫，但作物對磷肥的利用效率較低，只有約15%～20%的磷肥可被作物吸收利用，且過量的磷肥通過地下水和地表水徑流淋失，嚴(yán)重污染環(huán)境[7]。

植物磷效率(P efficiency)可分為磷吸收效率(P uptake efficiency)和磷利用效率(P utilization efficiency)[8]。為應(yīng)對低磷脅迫，植物形成了一系列機(jī)制來促進(jìn)磷的吸收和利用，如：改變根系形態(tài)構(gòu)型、增加根毛的數(shù)量和長度、根系分泌有機(jī)酸和酸性磷酸酶、體內(nèi)含磷代謝物的再活化利用等[9]。在這些適應(yīng)性機(jī)制中，植物的根系形態(tài)對土壤磷的吸收至關(guān)重要。已有的研究表明，磷效率的基因型差異在農(nóng)作物(如水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、小麥(Triticumaestivum)和玉米(Zeamays)等)中普遍存在[10-12]。通過對不同作物的種質(zhì)資源材料開展磷效率評價，篩選出磷高效基因型，對于作物磷效率的遺傳改良具有重要意義。

植物擴(kuò)展蛋白(Expansins,EXP)屬于多基因超家族，可被分為4個亞家族，即α-expansins(EXPA)、β-expansins(EXPB)、expansin-like A(EXLA)和expansin-like B(EXLB)[13]。EXP的主要生物學(xué)功能是調(diào)節(jié)植物細(xì)胞壁松弛和伸展，進(jìn)而影響根系的生長發(fā)育，前期研究報道EXP在植物適應(yīng)多種非生物逆境脅迫(如鹽害、干旱、低氮、低磷等)過程中發(fā)揮著重要作用[14-15]。目前，被報道參與植物適應(yīng)低磷脅迫的EXP主要屬于EXPB和EXLB亞家族成員，它們通過調(diào)控植物根系形態(tài)構(gòu)型來促進(jìn)磷的吸收，如：小麥的TaEXPB23、大豆的GmEXPB2和GmEXLB1[15-16]。

柱花草(Stylosanthesguianensis)是一種優(yōu)良的熱帶的豆科牧草與綠肥作物，其對酸性缺磷土壤的適應(yīng)性強(qiáng)[17-18]。但是，柱花草根系形態(tài)在適應(yīng)低磷脅迫過程中發(fā)揮的作用仍不清楚。本研究通過對31份柱花草種質(zhì)開展磷效率評價和根系性狀分析，篩選到磷高效基因型TF291和磷低效基因型TF343；隨后檢測了這兩個基因型根系中6個擴(kuò)展蛋白編碼基因SgEXPs響應(yīng)低磷的表達(dá)模式。研究結(jié)果將為選育磷高效柱花草品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)條件

本研究所用31份不同基因型圭亞那柱花草種子材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所“國家熱帶牧草中期備份庫”(熱帶牧草庫)提供(表1)。本試驗(yàn)在海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院科研基地的大棚中進(jìn)行，采用1/2 Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行水培。試驗(yàn)簡要流程為：取適量柱花草種子，于80℃的熱水中熱激處理2 min，放于墊濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中催芽1～2 d，在含250 μmol·L-1KH2PO4的營養(yǎng)液中預(yù)培養(yǎng)7 d，選取長勢良好、一致的幼苗，分別進(jìn)行正常供磷(+P，添加250 μmol·L-1KH2PO4)和低磷脅迫(-P，添加5 μmol·L-1KH2PO4)處理，培養(yǎng)液pH為5.8～6.0，每隔3 d更換一次，每個處理設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)。處理培養(yǎng)15 d后，分別收取地上部和根部樣品，檢測其干重、全磷含量、根系參數(shù)，分析SgEXPs基因響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式。

表1 31份供試圭亞那柱花草材料信息

1.2 方法

1.2.1干重、全磷含量和根系指標(biāo)測定 生物量測定：樣品收獲后，在105℃殺青30 min，70℃恒溫烘干后稱其干重。

全磷含量測定：收取的柱花草樣品烘干粉碎后，稱取0.02 g于100 mL消煮管中，加濃硫酸2 mL，于馬弗爐中消解至無色，冷卻后，雙蒸水定容至100 mL，待測。參照Murphy和Riley[19]的方法，采用鉬銻抗比色法，測定OD700的吸光度值，計算全磷濃度。

根系指標(biāo)測定：將柱花草根系展開，使其呈不重疊狀態(tài)，使用EPSON Expression 12000XL根系掃描儀掃描獲取根系圖像，再利用WinRHIZO(2009)軟件統(tǒng)計總根長、根表面積、根體積。

1.2.2柱花草擴(kuò)展蛋白理化性質(zhì)和進(jìn)化樹分析 參考Luo等[20]研究從NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取柱花草6個擴(kuò)展蛋白的CDS序列，同時從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲取6個擬南芥擴(kuò)展蛋白和大豆的GmEXLB1序列，大豆的GmEXPB2序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫。蛋白分子量與等電點(diǎn)預(yù)測采用Editseq軟件。多序列比對與蛋白進(jìn)化樹構(gòu)建分別采用Cluster X和MEGA(v5.50)軟件。

1.2.3實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR) 參照TRIzol(Invitrogen Inc，美國)方法提取柱花草總RNA，并用Vazyme公司的HiScript II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。使用Rotor-Gene Q(Qiagen,Hilden，德國)儀器和SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中國)定量試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μL，包括10 μL 2×SYBR qPCR Master mix，1.6 μL引物(10 μmol(L-1)，2 μL cDNA模板，6.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95℃ 30 s，94℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。參考Luo等[20]方法，定量引物見表2。基因相對表達(dá)量=目的基因表達(dá)量/內(nèi)參基因(SgEF-1α)表達(dá)量。

表2 本研究所用引物列表

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究相關(guān)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2013(Microsoft Company，美國)進(jìn)行整理和可視化作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示，利用SPSS 20.0軟件(IBM-SPSS，美國)對同一基因型柱花草不同磷源處理(+P和-P)下的指標(biāo)進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，分析其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低磷脅迫對柱花草干重和全磷含量的影響

如圖1A所示，與+P處理相比，-P處理顯著抑制了柱花草的干重(P<0.05)，干重降低了20.77%(TPRC2001-1)～70.04%(TF399)。同樣，-P處理下的植株全磷含量比+P處理降低53.275%(TF246)～93.08%(TF394)，差異顯著(P<0.05)(圖1B)。

圖1 低磷脅迫對31個基因型柱花草干重(A)和全磷含量(B)的影響

2.2 柱花草的磷效率分類

依據(jù)植物對養(yǎng)分效率和施肥反應(yīng)程度的不同，參考Gerloff的分類標(biāo)準(zhǔn)[21]，將不同磷效率的植物的分為4種類型(即Ⅰ～I(xiàn)V)，其中I類為磷高效高響應(yīng)型，即植物的產(chǎn)量、生物量或者磷積累量等在低磷和高磷處理下均高于平均值；II類為磷低效高響應(yīng)型，即植物的產(chǎn)量、生物量或者磷積累量等在低磷處理下低于平均值，在高磷處理下高于平均值；III類為磷低效低響應(yīng)型，即植物的產(chǎn)量、生物量或者磷積累量等在低磷和高磷處理下均低于平均值；IV類為磷高效低響應(yīng)型，即植物的產(chǎn)量、生物量或者磷積累量等在低磷處理下高于平均值，在高磷處理下低于平均值。

依據(jù)31個基因型柱花草的干重和全磷含量，將柱花草分為4類(圖2)。首先，以干重指標(biāo)進(jìn)行分類，其中磷高效高響應(yīng)型(Ⅰ)包括7個：TF226，TF234，TF246，TF291，TF244，TF181和TF348；磷低效高響應(yīng)型(Ⅱ)包括10個：TF399，F(xiàn)354，TF394，TF403，TF404，TF344，TF331，TF250，TF245和TF347；磷低效低響應(yīng)型(Ⅲ)包括10個：TF335，TF341，TF243，TF239，TF206，TF242，TF343，TF213，TF240和TF175；磷高效低響應(yīng)型(Ⅳ)包括4個：TF223，TF231，TF238和TPRC2001-1(圖2A)。

其次，以全磷含量指標(biāo)進(jìn)行分類，其中磷高效高響應(yīng)型(Ⅰ)包括9個：TF291，TF231，TF226，TF341，TF234，TF348，TF331，TF335和TPRC2001-1；磷低效高響應(yīng)型(Ⅱ)包括4個：TF354，TF394，TF344和TF399；磷低效低響應(yīng)型(Ⅲ)13個：TF347，TF403，TF404，TF245，TF181，TF250，TF239，TF240，TF343，TF206，TF242，TF175和TF213；磷高效低響應(yīng)型(Ⅳ)包括5個：TF243，TF238，TF244，TF246和TF223(圖2B)。

最后，在干重和全磷含量指標(biāo)分類一致的基因型中，磷高效高響應(yīng)型(Ⅰ)包括4個：TF226，TF234，TF291和TF348；磷低效高響應(yīng)型(Ⅱ)包括4個：TF354，TF394，TF344和TF399；磷低效低響應(yīng)型(Ⅲ)包括7個：TF175，TF213，TF343，TF239，TF240，TF206和TF242；磷高效低響應(yīng)型(Ⅳ)包括3個：TF223，TF238和TF244(圖2)。

圖2 以生物量(A)和全磷含量(B)為指標(biāo)對31個基因型柱花草的磷效率和磷響應(yīng)分類

2.3 低磷脅迫對柱花草根系形態(tài)的影響

為評估低磷脅迫對柱花草根系形態(tài)的影響，本研究分析了低磷脅迫下31個基因型柱花草總根長、根表面積和根體積的變化，發(fā)現(xiàn)柱花草根系形態(tài)響應(yīng)低磷脅迫具有基因型差異(圖3)。其中，與正常供磷相比，低磷處理下，2個基因型(TF291和TF239)柱花草的總根長、根表面積和根體積均顯著增加(P<0.05)；2個基因型(TF246和TPRC2001-1)柱花草的總根長和根體積均顯著升高(P<0.05)，但其根表面積無顯著差異；7個基因型柱花草(TF250,TF343,TF344,TF354,TF394,TF399,TF403)的總根長、根體積和根表面積均顯著降低(P<0.05)(圖3)。

圖3 低磷脅迫對31個基因型柱花草總根長(A)、根表面積(B)和根體積(C)的影響

綜上所述，同時以干重和全磷含量為指標(biāo)進(jìn)行的磷效率分類，結(jié)合根系參數(shù)對低磷脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TF291柱花草為磷高效高響應(yīng)型，同時低磷處理顯著增加其總根長、根表面積和根體積(P<0.05)(圖2，3)。相反，TF343柱花草為磷低效低響應(yīng)型，低磷處理下其總根長、根表面積和根體積均顯著降低(P<0.05)(圖2，3)。

2.4 柱花草擴(kuò)展蛋白理化性質(zhì)和進(jìn)化樹分析

柱花草6個擴(kuò)展蛋白SgEXPB1，SgEXPB2，SgEXPB3，SgEXLB1，SgEXLB2，SgEXLB3預(yù)測的蛋白分子量分別為29.37 kDa，29.38 kDa，28.56 kDa，28.31 kDa和28.18 kDa，28.32 kDa；蛋白等電點(diǎn)分別為4.76，8.70，8.02，7.46，5.51和8.74。隨后的進(jìn)化樹分析表明，柱花草的6個擴(kuò)展蛋白基因分為兩個亞家族，其中SgEXPB1，SgEXPB2和SgEXPB3屬于EXPB亞家族，而SgEXLB1，SgEXLB2和SgEXLB3屬EXLB亞家族(圖4)。柱花草的SgEXPB1與大豆的GmEXPB2同源，SgEXPB2和SgEXPB3與擬南芥的AtEXPB1和AtEXPB3同源性較高。此外，柱花草EXLB亞家族的3個成員SgEXLB1，SgEXLB2和SgEXLB3均與大豆的GmEXLB1同源性較高，而SgEXLB2的同源性最高(圖4)。

圖4 柱花草擴(kuò)展蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.5 擴(kuò)展蛋白基因在不同柱花草根系中響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式分析

本研究以磷高效高響應(yīng)型(TF291)和磷低效低響應(yīng)型(TF343)柱花草為材料，利用qRT-PCR技術(shù)，分析了柱花草6個擴(kuò)展蛋白響應(yīng)低磷脅迫的表達(dá)模式。如圖5所示，-P處理使SgEXPB2基因在TF291和TF343基因型柱花草的根系中相對表達(dá)分別顯著增加3.73倍和1.52倍(P<0.05)(圖5B)。對于SgEXLB1基因，在-P處理的TF291柱花草根系中，相對表達(dá)量比+P處理顯著增加1.61倍(P<0.05)，但在TF343柱花草根系中性對表達(dá)量無顯著差異(圖5D)。以上結(jié)果表明，在磷缺乏條件下，磷高效高響應(yīng)型柱花草(TF291)根系會誘導(dǎo)SgEXPB2上調(diào)表達(dá)，且上調(diào)水平比磷低效低響應(yīng)型柱花草(TF343)更高，同時TF291柱花草還增加SgEXLB1基因的表達(dá)以響應(yīng)低磷脅迫。

圖5 不同磷水平下柱花草擴(kuò)展蛋白基因相對表達(dá)量分析

3 討論

磷在植物生長發(fā)育過程中起著重要的作用，低磷脅迫顯著抑制植物的生長[22]。例如，低磷脅迫下辣椒、水稻等植物的地上部和整株干重均顯著降低[23-24]。類似的，本研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫下不同基因型的柱花草的生物量和全磷含量均不同程度的降低(圖1)。研究表明，在大豆、油菜(Brassicanapus)等作物中植物的磷效率存在顯著的基因型差異，與磷低效基因型材料相比，磷高效基因型材料的生物量和全磷含量均較高[25-26]。此外，Du等發(fā)現(xiàn)12個基因型柱花草的磷效率存在顯著的基因型差異，其中磷高效基因型柱花草TPRC2001-1的地上部生物量和全磷含量明顯較高[27]。同樣，本研究結(jié)果也表明31個基因型柱花草的磷效率也存在顯著差異(圖1)，并篩選到4份磷高效高響應(yīng)型柱花草：TF226，TF234，TF291和TF348(圖2)。

研究表明，植物可通過改變根系形態(tài)和根系構(gòu)型來適應(yīng)低磷脅迫，例如增大根冠比、促進(jìn)側(cè)根伸長、增加根毛密度等，擴(kuò)大根系分布范圍[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，磷高效高響應(yīng)型柱花草TF291的總根長、根表面積和根體積均顯著升高(圖2，3)，而磷低效低響應(yīng)型柱花草TF343的總根長、根表面積和根體積均顯著降低(圖2，3)，故柱花草適應(yīng)低磷的能力可能與根系的發(fā)達(dá)程度相關(guān)。

擴(kuò)展蛋白基因可調(diào)控細(xì)胞壁的松弛和伸展，使根系構(gòu)型發(fā)生改變[15]。已有研究表明，EXPB和EXLB亞家族的基因成員(例如小麥的TaEXPB23[29]和大豆的GmEXLB1)在低磷脅迫下參與調(diào)控植物的根系結(jié)構(gòu)和形態(tài)[16]。本研究中，低磷脅迫顯著上調(diào)SgEXPB2基因在磷高效高響應(yīng)型柱花草TF291和磷低效低響應(yīng)型柱花草TF343根系中的相對表達(dá)量，但在TF291中的上調(diào)倍數(shù)更高(圖5B)。同時，與正常供磷相比，TF291柱花草低磷根系中SgEXLB1也顯著上調(diào)，但SgEXLB1在TF343柱花草中無顯著變化(圖5D)。因此，柱花草可能通過上調(diào)表達(dá)SgEXPB2和SgEXLB1擴(kuò)展蛋白基因，以調(diào)控根系的生長，進(jìn)而適應(yīng)低磷脅迫。

4 結(jié)論

綜上所述，柱花草的磷效率存在顯著的基因型差異，磷高效基因型TF291在低磷脅迫下通過提高SgEXPs表達(dá)來促進(jìn)根系生長，以適應(yīng)低磷脅迫。