張燕梅 王瑞芳 楊子平 李俊峰 鹿志偉 趙艷龍 陸軍迎 周文釗

摘? 要? 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase inhibitor proteins， PGIPs）是一類與植物自身免疫相關的多功能蛋白， 在植物防衛(wèi)反應中扮演著重要角色。為了探討劍麻PGIP基因的功能，本研究利用PCR的方法從劍麻H.11648中克隆2個劍麻PGIP基因——AhPGIP1和AhPGIP2。利用熒光定量PCR（qRT-PCR）分析AhPGIP1和AhPGIP2基因在煙草疫霉侵染、傷害、低溫、鹽脅迫、水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理后的表達模式。結果表明：AhPGIP1基因 cDNA全長為1008 bp，編碼335個氨基酸，蛋白分子量約為36.7 kDa，等電點為8.65。AhPGIP2基因全長為981 bp，編碼326個氨基酸，蛋白分子量約為35.8 kDa，等電點為8.98。AhPGIP1基因在煙草疫霉侵染過程中表達水平先下降后明顯上升，侵染48 h達到最大值，在鹽、傷、SA和MeJA處理后表達水平明顯上升，分別在3、12、3、12 h達到最大值，低溫處理6 h表達水平不變，3、12、24 h表達水平明顯下降。AhPGIP2基因在煙草疫霉侵染24 、36、48 h表達水平明顯下降，侵染72 h明顯上升并達到最大值，在鹽脅迫、低溫、SA和MeJA處理后表達水平明顯上升，分別在3、24、3、12 h達到最大值，在傷處理12 h后顯著上升并達到最高水平，在3、6、24 h明顯下降。本研究為深入探討劍麻PGIP基因在不同逆境脅迫反應中的功能奠定了基礎。

關鍵詞? 劍麻;qRT-PCR;基因表達;PGIP

中圖分類號? S563.8? ? ? 文獻標識碼? A

Cloning and Expression Analysis of Polygalacturonase-inhibiting Protein in Sisal

ZHANG Yanmei， WANG Ruifang， YANG Ziping， LI Junfeng， LU Zhiwei， ZHAO Yanlong， LU Junying， ZHOU Wenzhao*

South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Zhanjiang City Key Laboratory for Tropical Crops Genetic Improvement， Zhanjiang， Guangdong 524091， China

Abstract? Polygalacturonase-inhibiting proteins （PGIPs）， a group of plant defense proteins， play a crucial role in plant defense reaction. In order to excavate the important function of AhPGIPs， the study cloned AhPGIP1 and AhPGIP2 from H.11648 by PCR. The expression levels of AhPGIP1 and AhPGIP2 were analyzed in sisal H.11648 under several treatments， including Phytophthora nicotianae Breda， methyl jasmonate （MeJA）， salicylic acid （SA）， salt， low temperature and wounding by fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） technique. The results showed that the full-length cDNA of AhPGIP1 contained 1008 bp and was predicted to encode a protein of 335 amino acids with a theoretical molecular mass of 36.7 kDa and pI of 8.65. The full-length cDNA of AhPGIP2 contained 981 bp， and was predicted to encode a protein of 326 amino acids with a theoretical molecular mass of 35.8 kDa and pI of 8.98. The expression level of AhPGIP1 was not changed at 24 h and then significantly up-regulated by Phytophthora nicotianae Breda， and reached the max value after inoculating 48 h， and was up-regulated by MeJA， SA， salt， and wounding， and reached the max value after stresses 3， 12， 3 and 12 h， respectively. The expression level of AhPGIP1 was not changed by low temperature at 6 h and significantly down-regulated at 3， 12 and 24 h. The expression level of AhPGIP2 was significantly down-regulated at 24， 36 and 48 h and up-regulated at 72 h by Phytophthora nicotianae Breda， was significantly up-regulated by salt， low temperature， SA and MeJA， and reached the max value after stresses 3， 24， 3 and 12 h respectively. The expression level of AhPGIP2 was significantly up-regulated and reached the max value after stress 12 h by wounding， and significantly down-regulated after stress 3， 6， and 24 h. The study laid a solid foundation for further exploration of the function of AhPGIPs.

Keywords? sisal; qRT-PCR; gene expression; PGIP

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.012

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPs）屬于LRR蛋白，如大多數R蛋白和PAMP受體一樣，含有典型的LRR結構域（通常為10個），每一個LRR 由20～30個氨基酸組成，且氨基酸序列通常為 LxxLxxLxxLxLxxNxLt/sgxIPxx [1-3]。研究表明PGIPs在植物防御反應中發(fā)揮著重要的作用。其作用機制是通過與病原分泌的多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase， PG）特異性結合抑制PGs活性，減少PGs對植物細胞壁的傷害。同時通過PGs和PGIPs的相互作用促進寡聚半乳糖醛酸苷（OGs）的形成，激發(fā)一系列的防御反應，從而提高植物對病原真菌[4-5]、卵菌[6]、細菌[7]和昆蟲[8]等的抗性。截至2018年，在NCBI數據庫已經公布了329個植物PGIP基因的全部或部分序列，研究表明氨基酸的突變[9]、超表達本體或外源PGIP基因，可提高植物對病原物的抗性，并且在擬南芥[9]、煙草[6]、小麥[12]、油菜[4]、馬鈴薯[7]、棉花[10-11]、水稻[13]、菜豆[5]以及蘋果[14]等多種植物中均有報道。同時超表達PGIP基因可使細胞壁結構和組成成分發(fā)生改變[4， 9]，PRs、EDS1以及PAD4等抗病相關基因表達上調[4， 11]，而沉默PGIP基因則增加植物對病原菌的敏感性[11， 15]。因此，該基因在植物抗病相關遺傳改良中有十分重要的作用。此外，病原菌[9， 11， 16]、SA[9， 11， 16]、MeJA[11， 17]、ABA[16]、鹽脅迫[16]、低溫[16]、傷[9， 11]、H2O2[11]等逆境脅迫均可誘導PGIP基因表達上調。

劍麻是我國熱區(qū)特有的經濟作物之一。劍麻不僅是主要的熱帶纖維原料;劍麻莖心是釀造龍舌蘭酒的主要原料[18];劍麻麻渣含有較高皂素[19]，可用來制藥[20];劍麻也是一種重要的生物質能源[21]。近年來，劍麻作為景天庚代謝的模式植物[22]，有非常重要的理論和經濟價值。斑馬紋病是劍麻主要病害之一，主要由煙草疫霉引起。盡管生產上形成了一套完整的斑馬紋病防治方法，但劍麻與煙草疫霉之間的互作關系如何、煙草疫霉是如何致病的、劍麻如何抵御煙草疫霉的浸染等方面仍是空白。

本研究室前期工作中，通過對主栽品種H.11648接種煙草疫霉，然后取不同接種時間的葉片進行轉錄組測序和表達譜分析，從主栽品種H.11648中篩選2個受煙草疫霉誘導表達顯著上調的PGIP基因。 這暗示PGIP基因可能在劍麻抗斑馬紋病中發(fā)揮重要作用。因此，本研究利用PCR的方法，克隆PGIP基因。通過qRT-PCR分析該基因受煙草疫霉、低溫、鹽、傷、SA以及MeJA等脅迫處理后的表達變化情況，為進一步揭示該基因的功能提供依據，同時也為劍麻遺傳改良提供基因資源。

1? 材料與方法

1.1? 材料

用于煙草疫霉接種和傷處理的為2年生的劍麻H.11648盆栽苗，用于MeJA、SA、鹽和低溫處理的為8～10 cm的H.11648組培苗。菌株為本實驗室前期分離保存的煙草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda）。

1.2? 方法

1.2.1? 材料處理? （1）病原接種：將保存于PDA斜面的煙草疫霉轉接到V8培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)1周后接種。接種前先用酒精棉反復擦拭葉片，然后用滅菌大頭針刺傷葉片表面。取直徑0.5 cm大小的菌餅將帶菌絲面貼于傷口處，用棉花保濕，每隔2 h加一次水。每3個生物學重復當作1個處理，每個處理重復3次。分別在接種0、24、36、48、72 h取H.11648葉片，經液氮速凍后80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）激素處理：取8～10 cm的劍麻組培苗，分別在培養(yǎng)基中加入1 mL SA （10 mmol/L）和MeJA（1 mmol/L）溶液。每瓶苗當做1個處理，每個處理重復3次。分別在處理前（0 h）、處理3、6、12、24 h取組培苗葉片，液氮速凍后80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）鹽脅迫（NaCl）處理：取8～10 cm的劍麻組培苗，在培養(yǎng)基中加入1 mL NaCl（100 mmol/L）溶液。每瓶苗當做1個處理，每個處理重復3次。分別在處理前（0 h）、處理3、6、12、24 h取組培苗葉片，液氮速凍后80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）傷處理：取2年生的劍麻盆栽苗，選取健康的葉片擦凈消毒后，用消毒的大頭針將葉片表面劃傷但不能穿破背面。每株當做1個處理，每個處理重復3次。分別在處理前（0 h）、處理3、6、12、24 h取傷處理葉片，液氮速凍后80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（5）低溫處理：取8～10 cm的劍麻組培苗，置于4 ℃培養(yǎng)箱中。每瓶苗當做1個處理，每個處理重復3次。分別在處理前（0 h）、處理3、6、12、24 h取組培苗葉片，液氮速凍后80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? RNA提取和cDNA合成? 采用超快型植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）提取葉片總RNA。經檢測后取0.5 ?g總RNA反轉成第一鏈cDNA，反轉錄試劑盒為TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（Transgen）。所得cDNA稀釋5倍后用于qRT-PCR分析。所有操作均按試劑盒說明書進行。

1.2.3? PGIP基因克隆與序列分析? 根據轉錄組序列，采用Primer 3.0[23]在線引物設計軟件設計PGIP基因特異性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如表1所示。20 ?L PCR反應體系中各組份的濃度及使用量：2×NOVA Taq-Plus PCR Forest Mix（江蘇愚公生命科技有限公司）：10 ?L;引物（10 μmol/L）F：0.2 ?L，R：0.2 ?L;cDNA：1 ?L;滅菌ddH2O：8.6 ?L。

PCR擴增程序：先95 ℃（5 min）， 然后進入35個循環(huán)（95 ℃（30 s），58 ℃（1 min），72 ℃（30 s），最后72 ℃（10 min），擴增產物4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR產物切膠回收后與pMD19-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，選取陽性克隆PCR檢測合格后送華大基因測序。測序結果經NCBI比對分析，確定PGIP基因全長序列。

運用ExPASy（http：//web.expasy.org）和SignalP 4.1 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）[24]軟件對AhPGIP1和AhPGIP2基因編碼蛋白的理化性質進行分析，主要包括蛋白氨基酸組成、蛋白分子量和等電點、信號肽等。分別利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）、DNAMAN和MEGA 5軟件進行蛋白結構域預測、蛋白序列同源性分析并構建進化樹。

1.2.4? PGIP基因表達分析? 根據基因序列設計熒光定量PCR引物，引物序列如表1所示。qRT-PCR在LightCycler 480Ⅱ（Roche）熒光定量PCR儀上進行。20 ?L反應體系：2×TransStart Tip Green qPCRSuperMix（Transgen），10 ?L;正反向引物（10 ?mol/L），各0.4 ?L;cDNA模板，1 ?L;無RNase水，8.2 ?L。反應程序為：95 ℃（1 min），然后進入45個循環(huán)（95 ℃（10 s），62 ℃（30 s），72 ℃（10 s）），重復3次。

1.3? 數據處理

熒光定量PCR后，儀器會自動得出Ct值。以GAPDH為內參基因，相對表達量參照Livak等[25]的2CT方法進行分析。

2? 結果與分析

2.1? PGIP基因克隆與序列分析

RT-PCR產物經克隆得到（圖1）。測序表明，AhPGIP1基因全長為1008 bp，編碼335個氨基酸，前25個氨基酸殘基是信號肽序列。含10個高度保守的半胱氨酸殘基，6個在N端，4個在C末端，有2個糖基化位點。AhPGIP2基因全長為981 bp，編碼326個氨基酸。其中前24個氨基酸殘基是信號肽序列，含11個高度保守的半胱氨酸殘基，6個在N端，5個在C末端，有3個糖基化位點。AhPGIP1 和AhPGIP2基因編碼蛋白均含有典型的LRR胞外序列LxxLxxLxxLx Lxx Nx Lx GxIPxx（圖2和圖4）。運用ExPASy軟件對AhPGIP1和AhPGIP2基因編碼蛋白氨基酸序列進行分析，推測AhPGIP1蛋白的理論分子量約為36.7 kDa，等電點為8.65。AhPGIP2蛋白的理論分子量約為35.8 kDa，等電點為8.98。

2.2? 劍麻AhPGIP基因編碼蛋白信號肽分析

利用SignalP 4.1 server對AhPGIP1和AhPG IP2基因編碼蛋白進行信號肽分析。結果表明AhPGIP1和AhPGIP2基因編碼蛋白含有信號肽的可能性均大于0.9，且Signal-HMM分析結果與Signal-NN預測結果一致。其中，AhPGIP1基因編碼蛋白的剪切位點在第25和26號氨基酸殘基之間，信號肽長度為25個氨基酸殘基。AhPGIP2基因編碼蛋白的剪切位點在第24號和第25號氨基酸殘基之間，該蛋白的N端有24個氨基酸殘基，可形成一個疏水性的信號肽（圖3）。

2.3? PGIP同源序列比對與系統(tǒng)進化樹分析

利用DNAMAN軟件將AhPGIP蛋白與NCBI去冗余蛋白組數據庫（http：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/））BLAST比對結果中與AhPGIP相似的蛋白序列（如蘆筍、海棗、甜橙、玉米等）一起進行同源性分析。結果顯示AhPGIP1和AhPGIP2基因編碼蛋白與其他物種的PGIP蛋白同源性達到59.98%，且都含有典型的LRR結構域（圖4）。

利用MEGA5軟件將NCBI去冗余蛋白組數據庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）BLAST比對結果中與AhPGIP相似的蛋白序列（如蘆筍、海棗、甜橙、玉米等），連同AhPGIP蛋白序列一起，構建PGIP蛋白進化樹。結果表明，AhPGIP1基因編碼蛋白與AoPGIP1的同源性較高，AhPGIP2基因編碼蛋白與AoPGIP2的同源性較高。由此推斷，劍麻AhPGIP蛋白與蘆筍的PGIP蛋白親緣關系較近，與玉米、海棗、甜橙等其他物種關系較遠，暗示AhPGIP和AoPGIP可能有相似的特征和功能（圖5）。

標下劃線的為信號肽，加粗的為保守的半胱氨酸殘基，斜體加粗的為糖基化位點，方框加粗的為LRR基序。

方框標注的為10個保守的LRR序列，AoPGIP1：蘆筍，XP_020250460;PdPGIP：海棗，XP_008795755.1;CsPGIP：甜橙，XP_006485019;NnPGIP：蓮花，XP_010257389.1;CcPGIP：克萊門柚，XP_006437051.1;ZmPGIP：玉米，NP_001147231.2;CiPGIP：宮內伊予柑，BAA31843.1;ChPGIP：黃燈籠椒，Phu27708.1;SbPGIP：兩色蜀黍，XP_002439098.1;CtPGIP：枸橘，BAA34813.1;AoPGIP2：蘆筍，XP_020250461.1;NtPGIP：煙草，NP_001312608.1;EgPGIP：巨桉，XP_012857227.1;AhPGIP1：劍麻，Unigene0026190;AhPGIP2：劍麻，Unigene0013878。

Ten conserved LRR sequences are highlighted in boxes. AoPGIP1： Asparagus officinalis， XP_020250460; PdPGIP： Phoenix dactylifera， XP_008795755.1; CsPGIP： Citrus sinensis， XP_006485019; NnPGIP： Nelumbo nucifera， XP_010257389.1; CcPGIP： Citrus clementina， XP_006437051.1; ZmPGIP： Zea mays， NP_001147231.2; CiPGIP： Citrus iyo， BAA31843.1; ChPGIP： Capsicum chinense， Phu27708.1;SbPGIP： Sorghum bicolor， XP_002439098.1; CtPGIP： Citrus trifoliata， BAA34813.1; AoPGIP2： Asparagus officinalis， XP_020250461.1; NtPGIP： Nicotiana tabacum， NP_001312608.1; EgPGIP： Erythranthe guttata， XP_012857227.1; AhPGIP1： Agave hybrid No.11648，Unigene0026190;AhPGIP2： Agave hybrid No.11648， Unigene0013878.

2.4? 劍麻AhPGIP基因不同逆境脅迫下表達模式分析

劍麻AhPGIP基因在不同逆境脅迫下表達模式如圖6所示。與對照相比（0 h），AhPGIP1在煙草疫霉侵染24 h時，表達水平略有下降但不顯著，在侵染36、48、72 h表達水平明顯上升，且48 h達到最高。在低溫處理3、12、24 h，AhPGIP1表達水平顯著下降，在6 h表達水平明顯上升。NaCl處理3 h， 表達水平急劇上升且達到最高水平，6、12 h明顯下降并恢復到對照水平，在處理24 h表達水平又顯著上升。在傷處理過程中，AhPGIP1表達水平明顯上升，在12 h 表達水平達到最高。在MeJA 處理過程中，AhPGIP1表達水平明顯上升，在12 h達到最高。在SA處理過程中，AhPGIP1表達水平先明顯上升，在3 h達到最高，在6、12 h略有下降，在24 h恢復到正常表達水平（0 h）。與對照相比（0 h），AhPGIP2在煙草疫霉侵染24、36、48 h時表達水平明顯下降，在36 h達到最低，在72 h表達水平明顯上升，達到最高水平。在低溫處理過程中，AhPGIP2表達水平明顯上升，24 h達到最高。在NaCl處理過程中，AhPGIP2表達水平先明顯上升，在3 h達到最高，在12 h達到正常表達水平，在24 h又明顯上升。在傷處理過程中，AhPGIP2表達水平在3、6 h明顯下降，在12 h表達水平明顯上升并達到最高水平，在24 h又顯著下降。在MeJA處理過程中，AhPGIP2表達水平在12 h明顯上升且達到最高水平，在3、6、24 h表達水平相對于對照沒明顯變化。在SA處理過程中，AhPGIP2表達水平先明顯上升，在3 h達到最高，在6、12、24 h略有下降，但均高于對照（0 h）。

3? 討論

植物細胞壁富含多糖，是植物抵御病原入侵的第一道天然屏障。病原微生物為了成功的侵入植物，常常需分泌一些降解細胞壁的酶，如多聚半乳糖醛酸酶（PGs），果膠甲酯酶（PME）和果膠裂解酶等，其中PGs是侵染早期的一種重要的酶。其主要是通過水解半乳糖酸殘基之間的α-（1-4）糖苷鍵來降解果膠，破壞細胞壁的完成性，從中獲得自身需要的營養(yǎng)[26]。同時植物為了躲避病原菌的入侵，也形成了一系列的防御機制，PGIP便是其中之一。它可以特異性與PG結合，抑制PG活性，同時激發(fā)寄主自身的防御反應[27]。

本研究從劍麻H.11648中克隆了2個PGIP基因（AhPGIP1和AhPGIP2）。在煙草疫霉侵染過程中AhPGIP1和AhPGIP2的表達水平呈現不同的表達模式，且AhPGIP1在侵染早起表達水平不變然后顯著上升，AhPGIP2在侵染早期明顯下降（24、36、48 h）后顯著上升的趨勢，這與Liu等[10-11]報道的相反。Liu等研究表明，棉花在接種黃萎病菌的過程中，隨著時間延長，GhPGIP1表達水平不斷顯著上升，而且沉默GhPGIP1，棉花對黃萎病菌的抗性顯著下降，從而證實GhPGIP1參與了棉花抗黃萎病。張燕梅等[28]對表型的研究發(fā)現，在劍麻接種煙草疫霉36 h，H.11648葉片表面可見明顯病斑，附著胞已經出現，從而表明煙草疫霉在36 h已經成功侵入到H.11648細胞中。而本研究表明AhPGIP1和AhPGIP2的表達水平分別在36 h和48 h才開始上升。按照PGIP與PGs互作原理，AhPGIP表達水平降低， AhPGIP與PG結合活性降低。即使在后期表達水平升高了，也不能抑制病原菌的侵染，同時也無法快速誘導植物自身的防御反應，這可能是導致H.11648發(fā)病的原因。

AhPGIP1和AhPGIP2在低溫和傷脅迫過程中呈現不同的表達模式，這在擬南芥等作物中也有報道。Ferrari等[29]研究發(fā)現，擬南芥AtPGIP1和AtPGIP2表達受不同的信號通路調控。其中AtPGIP1受OGs誘導顯著上調，但不受SA、MeJA和乙烯誘導。AtPGIP2則受MeJA誘導，因此推測，劍麻AhPGIP1和AhPGIP2基因也可能參與不同信號通路。另外AhPGIP1和AhPGIP2在鹽脅迫、MeJA和SA脅迫過程中表達上調且表達模式一致，這與Liu等[11]、Wang等[30]研究結果一致。以上研究結果同時表明，不同AhPGIP家族成員間的表達調控是十分復雜的。此外，PGIP除了受傷、鹽、低溫、SA、MeJA和病原菌誘導表達上調外，也可被OG、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA），脫落酸（ABA）、鋁、Low-pH等誘導表達上調[29， 31-32]。

AhPGIP1和AhPGIP2基因受煙草疫霉、信號分子SA、MeJA、傷以及低溫、鹽等多種逆境脅迫誘導表達，但是否可抑制PG活性、如何參與劍麻的防御應答反應及信號調控通路，還需要更深入的探討。

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