蔣 明 張志仙 張慧娟 管 銘 陳孝賞 尹龍飛 劉 潔

(1臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江椒江 318000；2臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江臨海 317000)

植物在與病原微生物協(xié)同進(jìn)化(co-evolution)過程中形成了獨(dú)特的防御機(jī)制，當(dāng)受到病原物入侵時(shí)，植物激活一系列防衛(wèi)反應(yīng)，引起基因表達(dá)和生理生化的改變，以抵御病原菌的進(jìn)一步侵染和擴(kuò)張[1]。在植物抗病反應(yīng)中，水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和乙烯(ethylene，ET)等激素在復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中起著十分重要的作用，并能針對(duì)不同的病原菌對(duì)信號(hào)分子進(jìn)行精確調(diào)控，以減少或消除病原物侵染對(duì)植物造成的傷害[2-5]。SA依賴的抗病信號(hào)途徑由活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌(biotrophic pathogens)觸發(fā)，如霜霉菌 (Hyaloperonospora parasitica)、蕓薹根腫菌(Plasmodiophora brassicae)、十字花科白粉菌(Erysiphe cruciferarum)等[6-8]。另一種抗病信號(hào)途徑則由JA/ET介導(dǎo)，主要針對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)病原菌(necrotrophic pathogens)的侵染，這些病原菌包括核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等[9-10]。此外，JA/ET還介導(dǎo)非病原菌引發(fā)的誘導(dǎo)性系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)，如熒光假單胞菌WCS417r菌株可誘導(dǎo)產(chǎn)生ISR，以抵御丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringaepv.tomato)的侵害[11-15]。

乙烯介導(dǎo)的抗病信號(hào)傳遞途徑中，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的乙烯受體起著感受和結(jié)合乙烯的作用[16]。乙烯受體在植物中以小家族形式存在，在擬南芥中共有5個(gè)成員，分別是 ETR1(ethylene resistant/ethylene receptor 1)、ETR2、ERS1(ethylene response sensor 1)、ERS2 和 EIN4(ethylene insensitive 4)[16-19]；番茄(Lycopersicon esculentum)中至少有6個(gè)成員，分別為L(zhǎng)eERT1、LeERT2、NR、LeERT4、LeERT5、LeERT6[20-21]。組成型三重反應(yīng)(constitutive triple response 1，CTR1)是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組分，乙烯受體與乙烯結(jié)合導(dǎo)致下游組分CTR1失活，并誘發(fā)后續(xù)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[22-23]。

青花菜(Brassica oleraceavar.italica)為十字花科蕓薹屬一年或二年生草本植物，是我國(guó)一種重要的蔬菜作物[24-25]。目前有關(guān)ERS的報(bào)道僅見于擬南芥(Arabidopsis thaliana)、石斛屬(Dendrobium)、萬代蘭屬(Vanda)和綠竹(Bambusa oldhamii)等少數(shù)植物[26-29]，ERS在青花菜中的研究尚未見報(bào)道。近年來，隨著青花菜種植面積的不斷擴(kuò)大，菌核病、根腫病等病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重，但由于青花菜種質(zhì)資源的匱乏，限制了抗病種質(zhì)的創(chuàng)制，而尋找優(yōu)質(zhì)的靶標(biāo)基因用于分子育種，是解決這一難題的重要途徑之一[30-31]。本研究以青花菜為材料，在克隆BoERS的基礎(chǔ)上，研究核盤菌和根腫菌侵染下的表達(dá)模式，以期為BoERS基因的功能鑒定和青花菜分子育種奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

將青花菜材料Bo0112種植于人工氣候箱中(16 h光照/8 h黑暗)，培養(yǎng)至兩葉一心期時(shí)接種核盤菌和根腫菌，并采集健康葉片用于DNA的提取。核盤菌的菌核收集于浙江臨海上盤青花菜基地，菌核先用無菌水沖洗，在超凈工作臺(tái)上用0.1%HgCl2浸泡8 min，無菌水沖洗5次，然后用無菌濾紙吸干后，利用潔凈的手術(shù)刀片將菌核切成小塊，接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)上，再置于 22℃條件下恒溫培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)基表面時(shí)，用5 mm打孔器切取菌落邊緣的瓊脂塊，接種至葉片正面，對(duì)照接種 PDA 培養(yǎng)基。 分別采集處理 0、6、12、24、36、72 h時(shí)的葉片，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆?。根腫菌采自浙江溫嶺青花菜栽培基地，根部腫塊用自來水沖洗干凈后，無菌水浸泡30 min。根腫塊用無菌濾紙吸干后在研缽中研碎，再用多層紗布過濾，最后用無菌水稀釋成3×108cfu·mL-1的菌液。接種處理參照張小麗等[31]的方法，對(duì)照用等量的無菌水，分別于接種0、5、10、15、20、25 d 時(shí)采集病根，無菌水快速洗凈后用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA、RNA的提取及cDNA的合成 稱取0.5 g葉片，液氮研磨成粉末后，用DNA快速提取試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)法提取基因組DNA，按照說明書進(jìn)行操作；RNA的提取采用TRIzol法[32]，分別以對(duì)照、病原菌處理的葉片和根為材料，cDNA第一鏈的合成采用TaKaRa(日本)公司提供的PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，反轉(zhuǎn)錄的操作根據(jù)說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 基因的克隆 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)甘藍(lán)型油菜的ERS基因(登錄號(hào):XM_013864976.1)，利用Primer Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR引物。上游引物為5′-ATGTTAA ACACATTGTTAGTTCACGGTCT-3′，下游引物為 5′-TTA CTGACGCCAATGACCGTTAC-3′。 PCR 采用 25 μL 的反應(yīng)體系，分別以葉片DNA和cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。 在 PCR 管中依次加入2.5 μL 10×緩沖液、0.5 μL 2 U·μL-1的Taq聚合酶、0.5 μL 10 mmol·L-1的 dNTP mix(上海生工生物工程股份有限公司)、20 μmol·L-1上/下游引物各 0.4 μL、35 ng模板，最后加無菌ddH2O至終體積25 μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃ 變性 40 s，56.6℃ 退火 65 s，72℃ 延伸 2.5 min；72℃延伸 10 min，4℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，切割含目的條帶的膠塊，利用江蘇碧云天生物技術(shù)研究所提供的DNA凝膠回收試劑盒回收。連接體系為10 μL，包括5 μL快速連接緩沖液(2 ×)、1 μL pGEM-T easy 載體(Promega，USA)、3 μL回收產(chǎn)物和1 μL連接酶。 將反應(yīng)物置于4℃冰箱中連接過夜，42℃水浴熱激90 s，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。經(jīng)平板涂布、37℃培養(yǎng)、藍(lán)白斑篩選、挑單菌落和PCR檢測(cè)，各挑選4份陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 表達(dá)分析 根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，上/下游引物分別為5′-ATGTCCCATTTGCT CTCCGGC-3′和 5′-GTCTTCTTACTCAGCATAAACTCA CG-3′；以肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，上/下游引物分別為5′-TCTCGATGGAAGAGCTGGTT-3′和 5′-GATCCTTAC CGAGGGAGGTT-3′。 PCR 反應(yīng)在 Roche LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche，Switzerland)上進(jìn)行，在 20 μL 反應(yīng)體系中，分別加入10 μL 2 × Master Mix、上/下游引物(20 μmol·L-1)各 0.25 μL、1 μL cDNA 和8.5 μL ddH2O。 PCR 程序:95℃ 預(yù)變性 10 min；95℃變性 15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)量(倍數(shù))采用2-△△Ct法[33]計(jì)算。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 BoERS的同源蛋白序列下載自NCBI，這些序列來自甘藍(lán)型油菜(CDX86641.1)、白菜(Brassica rapa)(XP_009111113.1)、蘿卜(Raphanus sativus)(XP_018447750.1)、鹽芥(Eutrema salsugineum)(ESQ36494.1)、薺菜(Capsella rubella)(EOA39884.1)、玉山筷子芥(Arabis lyratasubsp.lyrata)(EFH68467.1)、擬南芥(ANM61043.1)和亞麻薺(Camelina sativa)(XP_010457474.1)等作物。

在線工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)用于預(yù)測(cè)分子量、等電點(diǎn)、原子組成和總平均親水性系數(shù)(grand averageof hydropathicity，GRAVY)；DNAMAN 5.2.2軟件用于蛋白質(zhì)的翻譯；SMART在線工具(http://smart.embl-heidelberg.de)用于預(yù)測(cè)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域；Clustal X 1.81軟件用于對(duì)齊BoERS及同源蛋白序列分析。采用Mega 3.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，方法為鄰接法(Neighbor-Joining)，自舉檢測(cè)次數(shù)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 BoERS基因的序列分析

測(cè)序結(jié)果表明，BoERS的基因組 DNA全長(zhǎng)為1 928 bp，在1 684～1 750 bp處有一個(gè)長(zhǎng)度為68 bp的內(nèi)含子，內(nèi)含子符合GT-AG規(guī)則；編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 860 bp，編碼619個(gè)氨基酸(圖1)。

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)BoERS與甘藍(lán)型油菜ERS(XM_009112865.2)序列的相似性最高，達(dá)99%，僅在8個(gè)堿基上存在差異；與白菜ERS(XM_009112865.2)的差異相對(duì)較大，相似性為95%；與蘿卜ERS(XM_018592248.1)的相似性較低，僅89%。

經(jīng)在線工具ProtParam預(yù)測(cè)，BoERS的理論等電點(diǎn)為8.12，分子量為 68.2 kDa，分子式為 C3030H4878N824O889S35，GRAVY值為0.135，是一種疏水蛋白。利用SMART在線工具預(yù)測(cè)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，BoERS共有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別位于序列的6～23、53～75、82～104、124～146、189～350和376～443處，其中 4個(gè)為跨膜結(jié)構(gòu)域，另外2個(gè)分別為GAF結(jié)構(gòu)域與HisKA結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖1 青花菜BoERS的編碼區(qū)及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Coding sequence and the deduced amino acid sequence of BoERS from broccoli

2.2 BoERS及同源蛋白的多重比對(duì)

利用Clustal X軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明，BoERS與同源蛋白的相似性為77%～97%，與甘藍(lán)型油菜(CDX86641.1)的相似性最高，與白菜(XP_009111113.1)次之，相似性為95%，與蘿卜(XP_018447750.1)的相似性相對(duì)較低，為91%，與擬南芥(ANM61043.1)同源蛋白的相似性最低，僅為77%。TM2和TM4序列完全一致，TM3中僅3個(gè)位點(diǎn)存在差異，分別處于＋2、＋18和＋22位，但TM1之間的差異相對(duì)較大，除觀察到氨基酸的變異外，還存在插入/缺失現(xiàn)象(圖3)。GAF結(jié)構(gòu)域中，中部序列的變異相對(duì)較大，出現(xiàn)大量的氨基酸變異和插入/缺失現(xiàn)象，而兩側(cè)的序列比較保守。與BoERS相比，白菜GAF上有4個(gè)氨基酸(SGGP)的插入，而在蘿卜GAF中，有5個(gè)氨基酸殘基(PGGGP)的缺失和5個(gè)氨基酸(PSSSR)的插入現(xiàn)象(圖4)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

圖2 BoERS的結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domains of BoERS

利用MEGA軟件構(gòu)建BoERS及其同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)9種植物ERS序列的平均遺傳距離為0.137，其中蘿卜與薺菜 ERS之間的遺傳距離最大，為0.197，甘藍(lán)型油菜和青花菜的ERS之間最小，為0.009。BoERS與其他8種十字花科植物ERS之間的遺傳距離為0.009～0.1900；其中與擬南芥ERS的遺傳距離最大，為 0.190，其次為玉山筷子芥，為0.186；與甘藍(lán)型油菜 ERS的遺傳距離最小，僅為0.009。9種植物的ERS在系統(tǒng)發(fā)育樹上可分為5組，薺菜和亞麻薺ERS聚為一組(Ⅰ)，支持率為99%，玉山筷子芥與擬南芥 ERS聚為一組(Ⅱ)，支持率達(dá)100%，而鹽芥 ERS與它們的關(guān)系稍遠(yuǎn)，單獨(dú)成組(Ⅲ)，青花菜BoERS與白菜、甘藍(lán)型油菜ERS聚為一組(Ⅴ)，支持率為100%；蘿卜ERS則單獨(dú)成組(Ⅳ)。

圖3 BoERS及同源序列的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.3 Transmembrane domains of BoERS and its homologous sequences

圖4 BoERS及同源序列的GAF結(jié)構(gòu)域Fig.4 The GAF domains of BoERS and its homologous sequences

圖5 BoERS及同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of BoERS and its homologous sequences

2.4 基因表達(dá)分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，以肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閰⒄?。由圖6可知，BoERS的表達(dá)受核盤菌的誘導(dǎo)，與0 h相比，接菌6 h和12 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量無顯著差異；但在接種24～72 h時(shí)，相對(duì)表達(dá)量顯著增加，為CK的2.17～3.54倍，36 h時(shí)的相對(duì)表達(dá)量最大，24 h次之，為對(duì)照的2.25倍。BoERS的表達(dá)不受根腫菌的誘導(dǎo)，接種5～25 d時(shí)的表達(dá)量與CK相比均無顯著差異。

圖6 BoERS在2種病原菌侵染下的表達(dá)Fig.6 Expression of BoERS gene after inoculated by two pathogens

3 討論

在模式植物擬南芥中，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為C2H4→乙烯受體(ERS1、ETR1、ETR2、EIN4 和 ERS2)→CTR1→EIN2→EIN3→ERF→乙烯反應(yīng)，其中的EIN2(ethylene insensitive 2)是乙烯反應(yīng)的正調(diào)控因子，它可被位于其上游的CTR1磷酸化，導(dǎo)致EIN2駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，乙烯信號(hào)傳遞終止；在乙烯濃度較高的情況下，乙烯與乙烯受體結(jié)合，造成CTR1無法被受體激活，后續(xù)的信號(hào)傳遞得以順利進(jìn)行，從而引發(fā)乙烯反應(yīng)[34-35]。近年來，已從多種植物中分離或鑒定到乙烯受體基因，但有關(guān)ERS的研究并不常見。研究表明，擬南芥ERS基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 938 bp，編碼645個(gè)氨基酸；石斛品種‘Pompadour’的ERS編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 869 bp，編碼622個(gè)氨基酸[27]；綠竹ERS基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 899 bp，編碼632個(gè)氨基酸[29]。綠豆(Vigna radiata)ERS基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 911 bp，編碼636個(gè)氨基酸[36]。本研究中，BoERS的編碼區(qū)全長(zhǎng)1 860 bp，編碼619個(gè)氨基酸，編碼區(qū)全長(zhǎng)短于上述植物的ERS基因。BoERS具有1個(gè)內(nèi)含子，數(shù)量與擬南芥ERS基因相同，但與水稻ERS不同，水稻ERS基因具有4個(gè)內(nèi)含子[37]；BoERS的內(nèi)含子較短，長(zhǎng)度僅68 bp，與擬南芥ERS基因的內(nèi)含子長(zhǎng)度接近(72 bp)。ERS序列在十字花科植物中十分保守，暗示它們具有相似的功能。

研究表明，擬南芥的ERS有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、1個(gè)GAF結(jié)構(gòu)域和1個(gè)HisKA[38]，與乙烯受體 ETR2和EIN4相比，ERS受體缺失接收結(jié)構(gòu)域(receiver domain)，該區(qū)域可能參與乙烯的修飾[39]。本研究中，BoERS的跨膜結(jié)構(gòu)域、GAF結(jié)構(gòu)域和HisKA結(jié)構(gòu)域的數(shù)量與擬南芥ERS一致。此外，BoERS的羧基端沒有接收結(jié)構(gòu)域，符合ERS蛋白的特征。Lokkamlue等[28]對(duì)蘭科植物石斛屬(Dendrobium)、文心蘭屬(Oncidium)、小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)和萬代蘭屬(Vanda)植物ERS的序列結(jié)果表明，位于N端的跨膜結(jié)構(gòu)域十分保守，僅個(gè)別氨基酸殘基存在差別，而GAF結(jié)構(gòu)域中部的變異較大，兩端則十分保守。本研究中，9種十字花科植物GAF結(jié)構(gòu)域的保守性與4種蘭科植物相似，即中間多變兩端保守，但第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)并不像蘭科植物那樣保守，序列中存在大量的變異、插入/缺失現(xiàn)象。

乙烯是一種氣態(tài)的植物激素，在響應(yīng)生物或非生物脅迫中起著重要作用，如干旱、冷害、高溫和某些病原菌等，乙烯傳感蛋白ERS在這些生物和非生物脅迫起著重要作用，其編碼基因的表達(dá)受諸多因素(如鹽、低溫、干旱)的誘導(dǎo)[40]。擬南芥ERS在葉片中的表達(dá)量較小，但經(jīng)5 μL·L-1乙烯處理12 h后，ERS基因的表達(dá)量急劇上升，而ERS突變體對(duì)乙烯不敏感[41]。番茄乙烯受體基因LeETR4的表達(dá)受番茄瘡痂病菌(Xanthomonas campestrispv.vesicatoria)的誘導(dǎo)，而反義植株對(duì)該菌的敏感性增加[20]。直根酸模(Rumex thyrsiflorus)ERS的表達(dá)受低氧環(huán)境的誘導(dǎo)，在O2濃度為3%時(shí)，RtERS的表達(dá)量顯著增加[42]。水稻(Oryza sativa)ERS基因OsERS的表達(dá)受乙烯誘導(dǎo)，但表達(dá)量較低[37]。低溫處理鱷梨(Persea americana)和西洋梨(Pyrus communis)果實(shí)的ERS基因表達(dá)量均顯著增加[43-44]。本研究中，BoERS的表達(dá)受核盤菌的誘導(dǎo)，表達(dá)量在接種36 h時(shí)達(dá)最大值，但該基因的表達(dá)不受根腫菌的影響，與比照相比，表達(dá)量無顯著差異。核盤菌為死體營(yíng)養(yǎng)病原菌，其抗病信號(hào)途徑受JA/ET介導(dǎo)，植物與核盤菌相互作用，細(xì)胞內(nèi)乙烯合成增加，導(dǎo)致ERS基因的表達(dá)量增加，而根腫病菌為活體營(yíng)養(yǎng)菌，其抗病反應(yīng)采用SA途徑，在此過程中沒有乙烯的合成，因此青花菜在根腫菌侵染下，不影響乙烯反應(yīng)[45-46]。

4 結(jié)論

本研究以青花菜為材料，克隆到一個(gè)乙烯反應(yīng)傳感蛋白基因，命名為BoERS。BoERS具1個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 860 bp，編碼619個(gè)氨基酸，該編碼蛋白具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、1個(gè)GAF結(jié)構(gòu)域和1個(gè)HisKA結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)結(jié)果表明，BoERS與蕓薹屬ERS序列的差異最小，與蘿卜屬、鹽芥屬等植物的ERS差異較大。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，BoERS的表達(dá)受核盤菌的誘導(dǎo)，但不受根腫菌誘導(dǎo)。本研究為進(jìn)一步開展BoERS基因的功能鑒定和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。下一步將分別構(gòu)建RNAi和過量表達(dá)載體，研究該基因在抗病反應(yīng)中的功能。