張宇君 王普昶 趙麗麗 曾慶飛 張 雄 陳 超 董 瑞

(1貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，貴州貴陽(yáng) 550025；2貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴州貴陽(yáng) 550006；3貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽(yáng) 550005)

巴哈雀稗(Paspalum notatum)為禾本科雀稗屬多年生草本植物，又稱百喜草，具有抗干旱、耐貧瘠、覆蓋性好等優(yōu)點(diǎn)[1]。巴哈雀稗被廣泛運(yùn)用于水土流失治理、荒山荒坡綠化、果園覆蓋、飼草料等[2]，同時(shí)因其適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)可作為研究牧草抗逆機(jī)理的理想材料，但目前關(guān)于巴哈雀稗抗逆機(jī)制的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

植物主要通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子對(duì)一系列抗逆相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控以抵御逆境脅迫。轉(zhuǎn)錄因子是指能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)中的順式作用元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)[3]，其能通過(guò)與順式作用元件及其他有關(guān)蛋白的互相協(xié)調(diào)作用調(diào)控下游一系列基因的轉(zhuǎn)錄[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子種類較多，其中脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(dehydration responsive element binding proteins，DREB)是一類植物特有的與非生物脅迫密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，主要分為DREB1和DREB2兩類，隸屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族[5]。DREB類轉(zhuǎn)錄因子能夠與抗性相關(guān)基因啟動(dòng)子中的DRE/CRT(C-repeat)干旱應(yīng)答元件特異性結(jié)合，并激活下游逆境誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的耐受性[6]。Liu等[7]首次在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆鑒定獲得DREB類轉(zhuǎn)錄因子之后，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)DREB植物轉(zhuǎn)錄因子相繼開(kāi)展了廣泛的研究[8-10]?，F(xiàn)已從玉米(Zea mays)[11]、小麥(Triticum aestivum)[12]、水稻(Oryza sativa)[13]等多種作物中鑒定分離出DREB/CBF基因，證實(shí)了DREB/CBF基因受干旱、鹽堿、溫度、激素等非生物脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。楊鳳萍[14]將CBF1基因轉(zhuǎn)入高羊茅(Festuca elata)，DREB1B轉(zhuǎn)入黑麥草(Lolium perenneL.)中，成功獲得了抗旱性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因高羊茅和黑麥草。Li等[15]將擬南芥CBF1/DREB1b基因以35S為啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入到中華結(jié)縷草(Zoysia sinicaHance)中，明顯提高了其轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性。上述研究表明，通過(guò)基因工程技術(shù)培育抗逆性較高的草坪草或牧草在生產(chǎn)上具有重要的意義。

本試驗(yàn)采用RNA-Seq、RT-PCR結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，以巴哈雀稗為材料克隆獲取DREB2基因序列，并對(duì)其在高鹽、干旱、高溫、低溫、脫落酸、赤霉素等逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為闡明雀稗屬植物DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因家族的作用機(jī)理，為進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良巴哈雀稗栽培種的抗逆性提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生巴哈雀稗，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 將大小均勻一致、籽粒飽滿的巴哈雀稗種子滅菌消毒后，置于墊有兩層濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中發(fā)芽，待胚根全部長(zhǎng)出且達(dá)到種子的二分之一長(zhǎng)度后，選取發(fā)芽一致的種子播于帶孔的發(fā)芽床上恒溫培養(yǎng)(光照14 h/黑暗10 h，溫度25±2℃)至三葉一心時(shí)進(jìn)行處理。利用 E-36L植物培養(yǎng)箱(美國(guó)PERCIVAL公司)分別進(jìn)行高溫(40℃)和低溫(4℃)處理 2、4、6、8、10、12、24、48、72 h；在常溫(25℃)下，分別用含有 300 mmol·L-1NaCl、20%PEG-6000、100 μmol·L-1脫落酸(abscisic acid，ABA)和100 μmol·L-1赤霉素(gibberellin，GA)的1/2 Hoagland培養(yǎng)液分別處理 2、4、6、8、10、12、24、48、72 h。 以未進(jìn)行任何脅迫，僅用1/2 Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗為對(duì)照(CK)。每處理均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。待巴哈雀稗培養(yǎng)至孕穗期后，剪取生長(zhǎng)良好的根、莖、葉和幼穗組織，結(jié)穗期獲取籽粒飽滿的種子，以上組織均在剪取時(shí)用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總RNA提取及 cDNA第一鏈合成 采用TRIzol法[16]提取經(jīng) NaCl、PEG-6000、高溫、低溫、ABA、GA脅迫處理下10個(gè)不同處理時(shí)間段的巴哈雀稗幼苗組織樣品的總RNA，RNA完整性采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，260/280 nm吸光值測(cè)定RNA濃度和純度。采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司)對(duì)檢測(cè)合格的RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 為獲取巴哈雀稗基因全序列，將未經(jīng)脅迫、正常生長(zhǎng)至三葉一心時(shí)期的巴哈雀稗幼苗葉片組織RNA樣品送至上海生工生物工程有限公司，采用Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組雙末端測(cè)序。

1.2.4 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因CDS區(qū)克隆 將巴哈雀稗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲取的Unigene結(jié)果與GenBank中已上傳的高粱(Sorghumbicolor)、小麥、割手密(Saccharum spontaneum)等物種的DREB2基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，初步篩選出巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因全序列，并以此為依據(jù)設(shè)計(jì)巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因CDS區(qū)擴(kuò)增引物。利用RT-PCR技術(shù)，以巴哈雀稗cDNA為模板擴(kuò)增DREB2基因CDS區(qū)，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。

克隆擴(kuò)增體系共 20 μL，包括 2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各 1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。 PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性2 min。 94℃變性 30 s，退火溫度(詳見(jiàn)表1)30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸2 min。將切膠純化回收產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，采用熱激法將載體轉(zhuǎn)入至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，恒溫(37℃)培養(yǎng)12～16 h后在Amp＋平板挑取陽(yáng)性菌落到含氨芐液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 15 h(260 r·min-1，36.5℃)后進(jìn)行菌體PCR鑒定。合格擴(kuò)增產(chǎn)物樣送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)PnDREB2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用(http://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)目的蛋白質(zhì)疏水性；采用 SWISS-MODLE(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)目的蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；采用NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線軟件預(yù)測(cè)目的蛋白的磷酸化位點(diǎn)；采用Tmpred(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)分析目的蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；采用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)分析目的基因的亞細(xì)胞定位。不同物種DREB2基因氨基酸序列的同源關(guān)系采用DNAMAN 6.0軟件分析；應(yīng)用MEGA 5.1軟件構(gòu)建不同物種間的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析

采用RT-qPCR檢測(cè)巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因在不同組織以及不同脅迫處理下葉片組織樣品的表達(dá)差異水平。反應(yīng)條件:2×UltraSYBR Mixture(With ROX)10 μL，上、下游引物(10 μmol·L)各 0.4 μL，cDNA 1 μL，用滅菌水補(bǔ)充至總體積為20 μL。反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，退火溫度(詳見(jiàn)表1)30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；退火與熒光采集同時(shí)進(jìn)行，時(shí)間為 5 s，溫度范圍為 60～95℃，臺(tái)階溫度為0.5℃。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品cDNA和待測(cè)樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法[16]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 試驗(yàn)引物序列Table1 Primers sequence used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 巴哈雀稗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝分析

采用Illumina HiSeqTM高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)未經(jīng)脅迫處理的巴哈雀稗幼苗葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得42 844 132個(gè)reads片段和6.42 GB的序列信息。采用Trimmomatic進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得40 006 430 Clean reads。進(jìn)一步對(duì)序列進(jìn)行組裝，獲得 99 235個(gè)Unigene，平均長(zhǎng)度為641.96 bp。

2.2 巴哈雀稗PnDREB2基因克隆鑒定

基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2基因CDS區(qū)擴(kuò)增引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，獲得單一特異性良好的克隆片段，測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符。

2.3 生物信息學(xué)分析

圖1 PnDREB2的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of PnDREB2

2.3.1PnDREB2基因及蛋白序列分析PnDREB2基因含有一個(gè)連續(xù)完整的開(kāi)放閱讀框，全長(zhǎng)774 bp，編碼257個(gè)氨基酸，命名為PnDREB2(登錄號(hào):MH150946)。蛋白分子式為C1210H1916N354O401S8，分子量為28.09 kD，等電點(diǎn)為5.25，谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)在氨基酸序列組成中出現(xiàn)頻率較高，分別占 11.3%、10.1%和 9.7%。巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白含有DREB基因家族典型的AP2結(jié)構(gòu)域(圖2)。蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白共含有26個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別是13個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和5個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(圖3)。疏水性分析結(jié)果表明，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白的穩(wěn)定性系數(shù)為46.64，是不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性為-0.694，說(shuō)明蛋白質(zhì)親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，為親水性蛋白(圖4)。由Signal P 4.1 server軟件預(yù)測(cè)可知，該蛋白信號(hào)肽平均值較小，無(wú)切割位點(diǎn)和信號(hào)肽，屬非分泌蛋白，說(shuō)明該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成后不能被轉(zhuǎn)運(yùn)。巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，不具有入核功能，推測(cè)其可能主要參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)各種蛋白的運(yùn)輸與組裝。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白含有α螺旋結(jié)構(gòu)和β折疊結(jié)構(gòu)，相互螺旋，分別位于氨基和羧基末端，折疊為“溝狀”結(jié)構(gòu)，與目的蛋白結(jié)合良好(圖5)。

圖2 PnDREB2基因保守域Fig.2 Conservative domain of PnDREB2

圖3 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白氨基酸序列翻譯后磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of Paspalm notatum DREB2 protein

圖4 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白的親水性/疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of Paspalm notatum DREB2 protein

圖5 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure analysis of Paspalm notatum DREB2 protein

圖6 巴哈雀稗與其他物種DREB2氨基酸序列比對(duì)Fig.6 Comparison of amino acid sequences of DREB2 between Paspalum notatum and other species

2.3.2 巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2氨基酸序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 將巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白與高粱、割手密、谷子(Setaria italica)、牛鞭草(Hemarthria compressa)、玉米5個(gè)具有DREB2同源保守區(qū)的物種基因進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明不同物種的DREB2氨基酸序列存在高度的保守區(qū)(圖6)。利用MEGA5.1構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2與高粱、割手密、谷子、牛鞭草及玉米位于同一進(jìn)化分枝上，說(shuō)明其親緣關(guān)系較近，氨基酸序列相似度分別為 91.10%、89.50%、87.6%、87.6%和 88.2%(圖 7)，與梭梭(Haloxylon ammodendron)、擬南芥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖7 巴哈雀稗PnDREB2氨基酸與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis of PnDREB2 of Paspalum notatum and other plants

2.4 PnDREB2基因在不同組織中的表達(dá)特性分析

以穗期的巴哈雀稗為材料，利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)PnDREB2基因在巴哈雀稗中的根、莖、葉、幼穗和種子5種組織的基因表達(dá)進(jìn)行分析，由圖8可知，PnDREB2基因在巴哈雀稗的根、莖、葉、幼穗和種子5種組織中均有表達(dá)，但各組織的表達(dá)量差異顯著，其中在莖中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織中的表達(dá)量，在幼穗和種子中的表達(dá)量均顯著高于根和葉中的表達(dá)量，且在葉中的表達(dá)量最低，顯著低于其他組織。

2.5 不同脅迫處理下PnDREB2基因時(shí)序表達(dá)分析

由圖9可知，在不同脅迫處理?xiàng)l件下PnDREB2基因均能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，且均隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈先升高后降低趨勢(shì)，其中，在NaCl脅迫處理8 h時(shí)PnDREB2基因表達(dá)量達(dá)到峰值，較CK顯著增加了315.00%，24 h與48 h時(shí) 表達(dá)量較CK分別顯著降低了73.66%和73.89%；在PEG-6000脅迫處理12 h時(shí)PnDRER2表達(dá)量最高，較CK顯著增加了295.00%，且其他處理時(shí)間的表達(dá)量均顯著高于CK；40℃高溫脅迫處理10 h時(shí)PnDREB2表達(dá)量最高，較CK顯著增加了390.83%，且其他處理時(shí)間的表達(dá)量時(shí)間的表達(dá)量均顯著高于CK；4℃低溫處理6 h時(shí)PnDREB2表達(dá)量最高，與CK相比顯著增加了298.33%，除72 h表達(dá)量與CK差異不顯著外，其他處理時(shí)間的表達(dá)量均顯著高于CK；ABA誘導(dǎo)處理10 h時(shí)PnDREB2表達(dá)量最高，較 CK顯著增加了190.83%，除脅迫8 h時(shí)表達(dá)量與CK差異不顯著外，其他處理時(shí)間的表達(dá)量均顯著高于CK；GA誘導(dǎo)處理24 h時(shí)PnDREB2表達(dá)量最高，較CK顯著增加了181.11%，除72 h時(shí)表達(dá)量與CK差異不顯著外，其他處理時(shí)間的表達(dá)量均顯著高于CK。

圖8 PnDREB2基因在巴哈雀稗不同組織中的特性表達(dá)Fig.8 Relative expression analysis of PnDREB2 gene in different tissues of Paspalum notatum

圖9 PnDREB2的非生物脅迫及激素誘導(dǎo)差異表達(dá)Fig.9 Abiotic stresses and hormone induction of PnDREB2 differential expression profiles

3 討論

Liu等[7]于1998年在擬南芥中首次采用酵母單雜交的方法克隆得到5個(gè)DREB類轉(zhuǎn)錄因子(DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A和DREB2B)，并表明DREB2A在擬南芥中被干旱和高鹽脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。近年來(lái)，大量研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆性密切相關(guān)，尤其在調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫的防御過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[17-19]。本研究采用RNASeq結(jié)合RT-PCR的方法，從巴哈雀稗中成功克隆得到一個(gè)DREB家族成員，命名為PnDREB2，同源性和進(jìn)化樹(shù)結(jié)果分析表明，PnDREB2基因的氨基酸序列與高粱、割手密、谷子、牛鞭草以及玉米中DREB2蛋白的氨基酸序列同源性較高，均在87%以上，但與梭梭、擬南芥的同源性較低，進(jìn)一步證明了不同科屬植物的DREB2基因存在著結(jié)構(gòu)多樣性。

蛋白序列結(jié)構(gòu)分析表明，PnDREB2轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)典型的AP2結(jié)構(gòu)域，而且具有結(jié)構(gòu)域中第14個(gè)位點(diǎn)是纈氨酸、第19個(gè)位點(diǎn)為谷氨酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。第14、第19位氨基酸是AP2結(jié)構(gòu)域中非常保守的兩個(gè)位點(diǎn)，對(duì)于DREB類轉(zhuǎn)錄因子與DRE順式作用元件的特異性結(jié)合具有十分重要的作用。另一方面，生物信息學(xué)分析顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白含有多個(gè)α螺旋和β折疊相互結(jié)構(gòu)，而且亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中，不具有入核功能。這與肖雄[20]報(bào)道的同屬禾本科的紫大麥草中DREB轉(zhuǎn)錄因子定位于細(xì)胞核中的研究結(jié)果并不一致。結(jié)構(gòu)不同，亞細(xì)胞定位不同，預(yù)示著其生理代謝功能也存在差異[21]。根據(jù)張志飛等[22]對(duì)僅含一個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子的分類標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合推導(dǎo)的氨基酸序列，PnDREB2轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)屬于DREB2-A2亞類中的亞型1(DREB2A-subtype 1)，因此，該蛋白是一種可調(diào)控逆境應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)。

Liu等[7]研究認(rèn)為，在響應(yīng)逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，AtDREB2A是一類參與不依賴ABA誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠響應(yīng)干旱、高鹽、低溫等逆境的脅迫誘導(dǎo)。而本研究中的基因誘導(dǎo)表達(dá)測(cè)定結(jié)果顯示，PnDREB2AmRNA表達(dá)水平除受干旱、高溫、高鹽和低溫的顯著誘導(dǎo)外，同時(shí)也受到ABA不同程度的誘導(dǎo)。因而可以推測(cè)，在PnDREB2A轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控過(guò)程中，存在著不依賴于ABA誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和ABA依賴型表達(dá)調(diào)控2種途徑。已有研究證實(shí)，ABA信號(hào)途徑對(duì)DREB2A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要表現(xiàn)在脅迫條件下對(duì)DREB2A啟動(dòng)子的調(diào)控，說(shuō)明ABA依賴信號(hào)途徑和非ABA依賴信號(hào)途徑在植物受到脅迫時(shí)不是單獨(dú)發(fā)揮作用的，在條件需要時(shí)可以協(xié)同參與調(diào)控過(guò)程[23]。此外，蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，巴哈雀稗D(zhuǎn)REB2蛋白的磷酸化位點(diǎn)為26個(gè)，推測(cè)磷酸化也可能是PnDREB2轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控途徑之一。蛋白磷酸化是動(dòng)植物在逆境脅迫下，提高自我免疫和信號(hào)響應(yīng)的一種重要的自我保護(hù)機(jī)制。磷酸化作用可以負(fù)調(diào)控蛋白質(zhì)對(duì) DNA的結(jié)合活性，磷酸化的DREB2不能結(jié)合DRE元件，而去磷酸化能夠激活下游靶基因的表達(dá)[24]，因此，PnDREB2轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)內(nèi)部的磷酸化與去磷酸化作用參與巴哈雀稗在逆境脅迫下生長(zhǎng)應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

植物在逆境脅迫條件下，其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的高效表達(dá)能激活多個(gè)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而起到調(diào)節(jié)多個(gè)功能基因的作用[25]。魏曉玲等[26]研究表明，在干旱、高溫等逆境脅迫下，DREB類轉(zhuǎn)錄因子能通過(guò)與逆境信號(hào)途徑中下游基因啟動(dòng)子區(qū)域的DRE或CRT順式作用元件結(jié)合，激活脫水基因(responsive to dehydration，RD)/冷調(diào)節(jié)基因(cold regulated，COR)類基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗逆性。本研究中，PnDREB2基因的表達(dá)量在非生物脅迫和激素誘導(dǎo)處理中隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)均表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢(shì)，與謝登雷等[27]對(duì)高粱的研究結(jié)果一致，說(shuō)明該基因在植物生長(zhǎng)過(guò)程中參與了逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，這與將PnDREB2基因歸于DREB轉(zhuǎn)錄因子A2亞族的結(jié)論相符[28]。組織表達(dá)結(jié)果顯示，PnDREB2基因在巴哈雀稗的莖中表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因在植物生長(zhǎng)過(guò)程中可能與物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)。吳國(guó)棟等[29]研究大豆DREB基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，GmDREBc僅在根中受誘導(dǎo)表達(dá)；李章磊等[30]對(duì)蒙古沙冬青AmDREB2.1基因研究發(fā)現(xiàn)，該基因主要參與干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)，且僅在根中積極響應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)；而本研究中PnDREB2基因主要在莖中強(qiáng)烈表達(dá)，與前人研究不一致，其原因可能是不同植物對(duì)逆境的感知及在緩解脅迫過(guò)程中的響應(yīng)機(jī)制存在差異[31]。目前已有研究報(bào)道，在植物DREB的啟動(dòng)子區(qū)域中還分布有與光、溫度、ABA、GA、茉莉酸、乙烯等相關(guān)的順式作用元件，這些元件與對(duì)應(yīng)的反式作用元件發(fā)生作用，共同調(diào)控DREB基因表達(dá)水平[32]。綜上，在DREB轉(zhuǎn)錄因子中，不同成員間對(duì)不同逆境脅迫的應(yīng)答存在差異，同時(shí)還具有組織特異性表達(dá)特征。

4 結(jié)論

本研究從巴哈雀稗中克隆獲得一個(gè)的PnDREB2基因，其開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)774 bp，可編碼257個(gè)氨基酸，含 DREB基因家族典型的 AP2結(jié)構(gòu)域，屬于DREB2類轉(zhuǎn)錄因子基因A類中 A2亞類的亞型1。PnDREB2基因在根、莖、葉、幼穗和種子中均有表達(dá)，以莖中的表達(dá)量最高，表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)中，并具有26個(gè)磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)生物信息學(xué)和RT-qPCR分析結(jié)果推測(cè)，PnDREB2基因參與ABA依賴信號(hào)途徑和非ABA依賴信號(hào)途徑的協(xié)同調(diào)控，并受到磷酸化蛋白加工水平的調(diào)控，參與高鹽、干旱、高溫、低溫等逆境因子的非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程。本試驗(yàn)結(jié)果為闡明巴哈雀稗不同組織DREB類轉(zhuǎn)錄因子在逆境脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)理與功能提供了一定的理論依據(jù)。