楊君瓏，劉小龍，李帆，曹兵，張維江

1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏大學(xué)土木學(xué)院，寧夏 銀川 750021

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對土壤有機質(zhì)的分解和腐殖質(zhì)的形成具有重要作用，是土壤有機碳代謝、土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要驅(qū)動力之一（Deng et al.，2016）。土壤微生物群落組成特征可表征土壤物質(zhì)代謝的旺盛程度，能夠客觀地反映土壤肥力大小。因此，土壤微生物群落特征可作為土壤肥力的重要指標(biāo)之一（楊寧等，2013）。土壤微生物對碳源的利用能力則可以表征土壤微生物自身的生長情況。Biolog-ECO微平板技術(shù)通過土壤微生物不同碳源的利用差異來評價土壤微生物群落代謝多樣性和功能多樣性（Rutgers et al.，2016）。目前該技術(shù)主要被應(yīng)用于比較不同土壤類型、不同植物群落類型下的同類土壤（楊寧等，2016）、不同土地利用方式下的土壤（蔡進軍等，2016）、植物根際和非根際土壤（安韶山等，2011）等的土壤微生物群落的代謝多樣性。

寧夏回族自治區(qū)地處中國西部，是中國的生態(tài)系統(tǒng)脆弱區(qū)之一。其中，寧夏中南部地區(qū)生態(tài)環(huán)境尤其脆弱，過重的環(huán)境承載負(fù)荷使得當(dāng)?shù)刎毨丝诨鶖?shù)巨大（韓文文等，2016）。因此，寧夏回族自治區(qū)政府提出“生態(tài)移民”政策。針對生態(tài)移民遷出后當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)恢復(fù)，寧夏回族自治區(qū)政府在2013年提出《寧夏生態(tài)移民遷出區(qū)生態(tài)修復(fù)工程規(guī)劃(2013—2020年)》（寧夏回族自治區(qū)人民政府，2013）和《關(guān)于加強生態(tài)移民遷出區(qū)生態(tài)修復(fù)與建設(shè)的意見》（寧夏回族自治區(qū)人民政府，2013）。若要實現(xiàn)自治區(qū)提出的建設(shè)目標(biāo)，就需要明確植被恢復(fù)建設(shè)的模式，評價不同植被恢復(fù)方式對土壤環(huán)境的改善效果。

寧夏南部的六盤山山區(qū)是生態(tài)移民遷出的重點區(qū)域。作為黃土高原區(qū)最重要的水源涵養(yǎng)林地之一，六盤山生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定對寧南山區(qū)的氣候調(diào)節(jié)和生態(tài)平衡意義重大（孫浩等，2016）。近年來，許多學(xué)者對寧南山區(qū)植被恢復(fù)建設(shè)及其生態(tài)影響等方面開展了一些研究，如程曼等（2010；2013）、朱秋蓮等（2013）對寧南山區(qū)不同恢復(fù)模式下土壤團聚體與有機碳、土壤理化、土壤腐殖質(zhì)的相關(guān)性進行了比較分析研究，并對土壤養(yǎng)分效應(yīng)和土壤微生物特征進行研究，表明退耕還林和植被恢復(fù)措施改善了土壤環(huán)境。有研究對不同植被恢復(fù)模式的土壤質(zhì)量響應(yīng)進行評估，認(rèn)為在寧南山區(qū)，種植紫花苜蓿（Medicago sativa）、檸條（Caragana korshinskii）是較好的生態(tài)重建和植被恢復(fù)方式（金晶煒等，2014）。對寧南地區(qū)土壤微生物功能多樣性的研究僅見安韶山等（2011）對9種植物根際非根際土壤的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同植物根際與非根際土壤之間的土壤化學(xué)性質(zhì)、土壤微生物活性、土壤微生物多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)存在不同程度的差異，說明植物根系對于土壤微生物功能特征的重要作用。本研究選擇位于六盤山腹地的涇源縣六盤山鎮(zhèn)海子村為研究區(qū)，于 2013年進行不同植被恢復(fù)模式的設(shè)計并施工（表1，表2），在2017年調(diào)查分析不同植被恢復(fù)模式的土壤微生物功能多樣性特征，以揭示6種不同人工植被恢復(fù)模式和自然恢復(fù)模式對土壤微生物功能多樣性的影響，為植被恢復(fù)保育和生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)建設(shè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

寧夏六盤山海子流域處于涇河水系的頡河流域，位于寧夏涇源縣北28 km處的六盤山鎮(zhèn)，處于六盤山段東麓，為六盤山土石山林區(qū)，屬于黃土丘陵溝壑區(qū)的第二副區(qū)。地理位置為東經(jīng)106°14′24″，北緯35°36′31″，流域地勢西北高、東南低，海拔高度為2186~2835 m，相對高差649 m。研究區(qū)多年平均氣溫為5 ℃，多年平均蒸發(fā)量為810 mm，多年平均降水量為602 mm。流域土壤類型為侵蝕黑壚土，土質(zhì)疏松，抗蝕性差。移民遷出區(qū)，主要土地利用方式為耕地，尤其是坡耕地所占比重較大，林草土地面積較小，僅占土地總面積的15.9%。植被類型屬森林草原向干旱草原過渡區(qū)，天然植被主要為低矮稀疏的草地，人工植被為稀疏的喬木及灌木，人工草地主要種植分散和小面積的紫花苜蓿。地貌類型以黃土梁峁侵蝕地貌為主，溝壑縱橫，梁峁相間，地形支離破碎，水土流失嚴(yán)重，多年平均侵蝕模數(shù)為 3500 t·km-2·a-1（胡婉婷等，2015）。

表1 不同植被恢復(fù)模式概況Table 1 Generalinformation of different vegetation restoration models

表2 不同植被恢復(fù)模式土壤養(yǎng)分特征Table 2 The soil nutrient character of different vegetation restoration models

1.2 土壤樣品采集和Biolog-ECO實驗

2017年9月，選取7種不同植被恢復(fù)模式作為研究對象，每種模式設(shè)置3個重復(fù)樣地，樣地大小5 m×20 m。每個樣地按照S形設(shè)置10個點，用土鉆采集0~20 cm土壤樣品，同一樣地土壤樣品充分混勻，去掉石礫、動植物殘體及雜質(zhì)，將土樣裝入自封袋內(nèi)帶回實驗室，保存于4 ℃冰箱內(nèi)用于土壤微生物功能多樣性的測定。Biolog-ECO技術(shù)通過96孔微孔板中不同的碳源底物來分析評價土壤微生物生理代謝特征，在恒溫培養(yǎng)條件下，土壤微生物群落利用不同類型的碳源后，使得平板微孔內(nèi)吸光值發(fā)生不同程度的變化。因而，利用每個微孔板吸光值可以計算土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)，具體實驗方法見文獻（Fang et al.，2009）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

土壤微生物的代謝活性用每孔平均顏色變化率（Average Well Color Development，AWCD）來描述，土壤微生物功能多樣性指數(shù)采用Brillouin指數(shù) Shannon-Weiner指數(shù)和 Pielou均勻度指數(shù)來表征。具體計算方法見參考文獻（董立國等，2011）。

不同植被恢復(fù)模式的土壤微生物 AWCD和功能多樣性差異比較，運用DPS 7.05軟件進行雙因素?zé)o重復(fù)方差分析；運用 Origin 8.5作圖；作圖用Canoco 4.5軟件進行主成分分析（PCA）與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物群落AWCD值的動態(tài)變化

平均顏色變化率（AWCD）反映了微生物的代謝活性，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個重要指標(biāo)，AWCD值的高低反映土壤微生物密度的高低，可代表土壤微生物活性的高低。計算不同植被恢復(fù)模式土壤AWCD平均值，并繪制AWCD值隨培養(yǎng)時間的動態(tài)變化曲線（圖1）。

由圖1可知，每隔24 h測定的AWCD值隨著培養(yǎng)時間的延長均呈增大趨勢，這表明不同植被恢復(fù)模式土壤微生物利用碳源的量隨著培養(yǎng)時間的延長均逐漸增大，但不同植被恢復(fù)模式相對于自然恢復(fù)土壤微生物利用碳源的 AWCD值大小有顯著不同。土壤微生物群落AWCD值均在24~144 h內(nèi)迅速升高，之后緩慢地升高最后趨于穩(wěn)定。AWCD值的快速增加表明土壤碳源被土壤微生物大量利用，土壤微生物進入指數(shù)生長期。

結(jié)合表3不同植被恢復(fù)模式AWCD的方差分析表明，刺槐+山杏+紫花苜蓿(0.94±0.44)和油松+旱柳+紅豆草混交林(0.65±0.38)土壤微生物利用碳源的量顯著高于自然恢復(fù)（P<0.01），而青海云杉+油松+河北楊和刺槐+油松混交模式下土壤微生物利用碳源的量顯著低于自然恢復(fù)（P<0.01），即刺槐+山杏+紫花苜?；旖涣滞寥牢⑸锎x活性最強，而刺槐+油松(0.45±0.32)和青海云杉+油松+河北楊混交林(0.26±0.18)相對于自然恢復(fù)土壤微生物代謝活性相對較弱。

圖1 不同培養(yǎng)時間土壤微生物碳源代謝活性Fig. 1 The metabolism of carbon source by soil microbial communities with incubation time■Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis; ●Robinia pseudoacacia+Pinus tabulaeformis; ▲Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica+Medicago sativa; ▼Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica, □Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia; ○Salix matsudana+ Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica; △Natural recovery.The following is the same as

表3 不同植被恢復(fù)模式土壤微生物群落AWCD值方差分析Table 3 The variance analysis of soil microbial communities AWCD in different vegetation restoration models

2.2 土壤微生物對碳源的利用

圖2 土壤微生物群落不同碳源變化特征Fig. 2 Variation of different carbon source of soil microbial communities■Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis; ●Robinia pseudoacacia +Pinus tabulaeformis; ▲Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica+Medicago sativa; ▼Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica; □Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia; ○Salix matsudana+Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica; △Natural recovery

根據(jù)化學(xué)基團的性質(zhì)，將ECO板上的31種碳源分成6類，即羧酸類、氨基酸類、碳水化合物類、聚合物類、胺類、其他混合物類。由圖 2可知，6類碳源的利用情況均隨時間的延長而增強。具體而言，刺槐+山杏+紫花苜蓿模式下土壤微生物對碳水化合物類的利用最高，高于自然恢復(fù)，而刺槐+油松、旱柳+刺槐+山杏模式較低（圖2A）。6種人工植被恢復(fù)模式土壤微生物對聚合物類的利用均高于自然恢復(fù)（圖 2B）；其中，刺槐+山杏+紫花苜蓿混交林最高。由圖2C可知，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢復(fù)模式土壤微生物對氨基酸類利用最高，油松+旱柳+紅豆草混交林次之，刺槐+油松混交林較低。土壤微生物對羧酸類碳源利用最高的為刺槐+山杏+紫花苜?；旖荒Ｊ剑▓D2D）。同時，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢復(fù)模式土壤微生物對胺類利用程度也是最高，其次是青海云杉+油松+河北楊混交林（圖2E），自然恢復(fù)模式為最低。由圖2F可知，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢復(fù)模式土壤微生物對其他混合物的利用情況也高于其他植被恢復(fù)模式，自然恢復(fù)為最低。

這表明在7種植被恢復(fù)模式中刺槐+山杏+紫花苜蓿混交土壤微生物對主要碳源利用情況均較高，優(yōu)于其他模式。另外，碳水化合物類是所有植被恢復(fù)模式中土壤微生物的主要碳源，其次為氨基酸類、羧酸類和聚合物類，其他混合物和胺類利用較低。

2.3 土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

多樣性指數(shù)是微生物多樣性研究中的重要參數(shù)指標(biāo)，Shannon指數(shù)、Brillouin指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)是表征群落多樣性的常用指數(shù)，均能在一定程度上反映不同利用碳源類型的差異。根據(jù)不同培養(yǎng)時間光密度數(shù)據(jù) C-R，計算 Shannon指數(shù)、Brillouin指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)（圖3），結(jié)果表明，不同培養(yǎng)時間多樣性指數(shù)差異性不同。不同植被恢復(fù)模式中3種土壤微生物多樣性指數(shù)隨培養(yǎng)時間變化趨勢一致，土壤微生物群落多樣性指數(shù)隨培養(yǎng)時間延長呈上升趨勢，直至趨于穩(wěn)定。

結(jié)合圖3和表4可知，刺槐+山杏+紫花苜蓿和油松+山杏植被恢復(fù)模式下Shannon指數(shù)、Brillouin指數(shù)和 Pielou指數(shù)均顯著高于其他混交模式（P<0.05）。這表明刺槐+山杏+紫花苜蓿和油松+山杏混交模式土壤微生物群落多樣性以及種群豐富度較高。除以上兩個植被恢復(fù)模式外，油松+旱柳+紅豆草(4.34±0.33)和旱柳+刺槐+山杏(4.38±0.30)植被恢復(fù)模式Shannon指數(shù)顯著高于自然恢復(fù)模式，自然恢復(fù)模式與青海云杉+油松+河北楊、刺槐+油松模式之間沒有顯著性差異。而Brillouin指數(shù)的平均值方差分析表明，自然恢復(fù)與青海云杉+油松+河北楊、刺槐+油松和旱柳+刺槐+山杏混交模式之間沒有顯著性差異。Pielou指數(shù)平均值方差分析表明，青海云杉+油松+河北楊、刺槐+油松、油松+旱柳+紅豆草、旱柳+刺槐+山杏混交模式與自然恢復(fù)之間均無顯著性差異。

表4 不同植被恢復(fù)模式土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)比較Table 4 The functional diversity of soil microbial communities in different vegetation restoration models

圖3 不同培養(yǎng)時間土壤微生物功能多樣性指數(shù)Fig. 3 The functional diversity indices of soil microbial communities with incubation time■Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis; ●Robinia pseudoacacia+Pinus tabulaeformis; ▲Robinia pseudoacacia +Armeniaca sibirica+Medicago sativa; ▼Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica; □Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia; ○Salix matsudana+Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica; △Natural recovery

2.4 土壤微生物利用碳源的主成分分析

根據(jù)7種不同植被恢復(fù)模式下72 h不同碳源的光密度數(shù)據(jù)對土壤微生物利用的碳源進行主成分分析。如圖4所示，第一主軸解釋度為36.54%，第二主軸解釋度為26.83%，共解釋碳源光密度變化的63.37%。圖4中不同植被恢復(fù)模式（圓圈）在不同碳源投影點的相對位置（箭頭）代表該碳源在該植被恢復(fù)模式中的重要程度，順著箭頭的方向，表示重要程度越高，反之，表示重要程度越低。不同植被恢復(fù)模式土壤微生物利用碳源種類和數(shù)量均有顯著差異。具體而言，油松+山杏、油松+旱柳+紅豆草和旱柳+刺槐+山杏植被恢復(fù)模式及自然恢復(fù)可利用的碳源較多，刺槐+山杏+紫花苜蓿混交次之，青海云杉+油松+河北楊與刺槐+油松植被恢復(fù)模式可利用碳源少，該結(jié)果和不同碳源的方差分析具有一致性。

圖4 土壤微生物碳源利用主成分分析Fig. 4 PCA of the carbon source utilization by soil microbial communities1. β-methyl-D-glucoside; 2. D-galactonic acid-γ-lactone; 3. L-arginine;4. Pyruvatic acid methyl ester; 5. D-xylose; 6. D-galacturonic acid; 7.L-asparagine; 8. Tween 40; 9. i-erythritol; 10. 2-hydroxybenzoic acid; 11.L-phenylalanine; 12. Tween 80; 13. D-mannitol; 14. 4-hydroxybenzoic acid;15. L-serine; 16. α-cyclodextrin; 17. N-acetyl-D-glucosamine; 18.γ-hydroxybutyric acid; 19. L-threonine; 20. Glycogen; 21. D-glucosaminic acid; 22. itaconic acid; 23. glycyl-L-glutamic acid; 24. D-cellobiose; 25.glucose-1-phosphate; 26. α-ketobutyric acid; 27. Phenyl ethylamine; 28.α-D-lactose; 29. D. L-α-glycerol phosphate; 30. D-malic acid; 31. putrescine A. Picea crassifolia+Pinus tabulaeformis+Populus hopeiensis, B. Robinia pseudoacacia+Pinus tabulaeformis, C. Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica+Medicago sativa, D. Pinus tabulaeformis+Armeniaca sibirica, E.Pinus tabulaeformis+Salix matsudana+Onobrychis viciaefolia, F. Salix matsudana+Robinia pseudoacacia+Armeniaca sibirica, G. Natural recovery

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究表明，在一定時間范圍內(nèi)，土壤微生物對不同碳源的利用隨時間的延長而增強，該結(jié)果與前人研究結(jié)果相同（翟輝等，2016）。在植被恢復(fù)過程中，植被覆蓋度提高，地面凋落物積累增加，其凋落物分解使得土壤有機質(zhì)含量不斷提高；另一方面，根系生長和細(xì)根周轉(zhuǎn)使得根系殘體和根系分泌物增加。而根系分泌物和地面凋落物是土壤微生物代謝的重要的能量來源（An et al.，2013）。作為土壤微生物利用單一碳源能力的重要指標(biāo)，平均顏色變化率（AWCD）的高低能夠表征土壤微生物群落代謝活性的高低（向澤宇等，2014）。在本研究中，不同植被恢復(fù)模式以及自然恢復(fù)之間 AWCD存在顯著性差異，刺槐+山杏+紫花苜蓿模式土壤微生物 AWCD值高于其他模式，可能和刺槐、紫花苜蓿等固氮植物顯著增加土壤氮含量進而提高土壤微生物總量有關(guān)；而刺槐+油松和青海云杉+油松+河北楊混交模式低于自然恢復(fù)，結(jié)合樣地調(diào)查發(fā)現(xiàn)可能是這兩個模式土壤較其他模式更加緊實，其土壤容重高于其他類型，而土壤容重過高會導(dǎo)致土壤微生物種類和數(shù)量下降（蒲潔等，2015）。

本研究采用 Shannon指數(shù)、Brillouin指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)可以從不同角度反映土壤微生物群落碳源代謝的功能多樣性特征。一般而言，多樣性指數(shù)越高，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，穩(wěn)定性相對越高（Schlatter et al.，2016）。本研究中，刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢復(fù)模式下土壤微生物的Shannon指數(shù)、Brillouin指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均高于其他植被恢復(fù)模式，表明刺槐+山杏+紫花苜蓿模式的土壤微生物功能多樣性較高，這可能是由于植物群落類型影響了微生物群落的組成。有研究表明，土壤微生物功能多樣性與凋落物分解速率相關(guān)。闊葉樹種較針葉樹種分解更快，養(yǎng)分進入土壤，被土壤微生物更快利用，從而促進土壤微生物功能多樣性（宋蒙亞等，2014）。本研究中，刺槐+山杏+紫花苜蓿土壤微生物群落功能多樣性高于其他模式，其原因可能是更多的闊葉成分導(dǎo)致其土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變。因此，需要進一步驗證不同植被恢復(fù)模式對土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)的影響是否與對土壤微生物功能多樣性的影響具有一致性。

6種不同植被恢復(fù)模式以及自然恢復(fù)土壤微生物對 6種碳源的利用情況均存在顯著差異，刺槐+山杏+紫花苜蓿混交模式土壤微生物對主要碳源利用較高，可能是凋落物為土壤微生物活動提供養(yǎng)分來源，而凋落物的差異導(dǎo)致了土壤微生物可利用的碳源的差異（王珍等，2017）。不同植被恢復(fù)模式土壤微生物對不同碳源的利用情況不同，碳水化合物類是6種混交林土壤微生物的主要碳源，其次為氨基酸類、羧酸類和聚合物類，其他混合物和胺類利用最小，說明不同植被恢復(fù)模式的土壤微生物對6種碳源的利用具有選擇性。董立國等（2011）研究也有相似的結(jié)論，其原因可能與植物凋落物以及根系分泌物差異有關(guān)。利用主成分分析可以比較不同處理間土壤微生物碳源利用的差異。本研究表明，刺槐+油松、旱柳+刺槐+山杏、青海云杉+油松+河北楊和油松+旱柳+紅豆草混交模式對碳源種類的選擇與自然恢復(fù)相比，具有明顯的差異。有研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的差異與不同樹種的凋落量及其凋落物化學(xué)成分有關(guān)（張圣喜等，2011）。土壤微生物功能多樣性的高低可影響土壤微生物有機物的轉(zhuǎn)化速率（杜瀅鑫等，2016）。因此，除了注重研究植被對土壤微生物功能多樣性的影響外，還應(yīng)關(guān)注不同植被恢復(fù)模式對土壤微生物在養(yǎng)分循環(huán)方面的影響。

3.2 結(jié)論

（1）7種不同植被恢復(fù)模式中，刺槐+山杏+紫花苜?；旖荒Ｊ较峦寥牢⑸锢锰荚吹牧孔畲?，而青海云杉+油松+河北楊和刺槐+油松混交林相對較弱。

（2）碳水化合物類和氨基酸是7種植被恢復(fù)模式土壤微生物的主要碳源，其次為羧酸類和聚合物類，胺類和其他混合物的利用最小。

（3）從提高土壤微生物功能多樣性角度，綜合認(rèn)為本研究區(qū)刺槐+山杏+紫花苜蓿植被恢復(fù)模式優(yōu)于其他植被恢復(fù)模式。