楊軍蘭 趙天智 謝云*

(1西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，陜西 西安 710061; 2空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

谷氨酸(glutamate, Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多生理和病理過程扮演了重要角色[1]。然而，谷氨酸的過度釋放可以通過與離子型(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)和代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)的作用，直接引起興奮性神經(jīng)毒性，這一過程也參與了腦外傷、中風(fēng)、帕金森病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程[2-4]。目前，在代謝型谷氨酸受體家族中，研究最廣泛的是亞型1和5。已有研究表明，激活代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)可以導(dǎo)致大鼠癲癇發(fā)作的頻率顯著增加[5-6]，并且抑制mGluR1對(duì)沙鼠腦缺血損傷有保護(hù)作用[7]。此外，mGluR5可以通過與突觸后致密蛋白95(postsynaptic density 95, PSD95)相互作用，從而調(diào)控下游的一系列信號(hào)分子[8]。然而，mGluR1調(diào)控谷氨酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)利用N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid, NMDA)激活突觸后膜的NMDA受體，以獲取興奮性神經(jīng)元損傷模型，用mGluR1特異性阻滯劑LY367385 [(+)-2-甲基-4-羥基苯甘氨酸]抑制mGluR1的作用，進(jìn)而了解其在神經(jīng)元興奮性損傷中的具體作用。

材料與方法

一、試劑

孕16 d清潔級(jí)SD大鼠，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Hyclone公司)，羥乙基哌嗪乙硫磺酸(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES)(Farco公司)，PSD95抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，GluN2B抗體(美國(guó)NeuroMab公司)，NMDA(美國(guó)Sigma公司)，細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物科技研究所)，喹啉酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，二抗(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology)。

二、神經(jīng)元細(xì)胞分離及培養(yǎng)

解剖孕16 d SD大鼠，取出胎鼠，分離腦皮質(zhì)組織，剪碎，0.25%胰酶37 ℃消化30 min后，加入完全培養(yǎng)液終止消化，離心后去上清，培養(yǎng)液洗滌一次后再次離心，去上清，加2 mL完全培養(yǎng)液輕輕吹打形成細(xì)胞懸液，通過200目濾網(wǎng)過濾，以5×105/孔的密度接種于多聚賴氨酸包被的24孔板。完全培養(yǎng)液：DMEM高糖培養(yǎng)基13.4 g/L，碳酸氫鈉2 g/L，青霉素G 100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，HEPES 1.19 g/L，N2添加劑13.4 g/L，胎牛血清10%。神經(jīng)元隨機(jī)分為3組：對(duì)照組：不做任何處理；NMDA組：10 μM NMDA 處理；NMDA+LY367385組：50 μM LY367385預(yù)處理1 h后，再加入10 μM NMDA處理，各組均為5。

三、細(xì)胞活性測(cè)定

將細(xì)胞按2×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，設(shè)置6個(gè)平行孔及空白對(duì)照，分別進(jìn)行相應(yīng)處理后每孔加入20 μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)，震蕩15 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(optical density, OD)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

四、細(xì)胞培養(yǎng)基乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)含量測(cè)定

神經(jīng)元進(jìn)行相應(yīng)處理后，收集上清，依據(jù)試劑盒說明測(cè)定LDH含量。

五、轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labeling, TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution tween, PBST)沖洗后按照檢測(cè)試劑盒說明書操作，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色觀察細(xì)胞核形態(tài)，計(jì)算平均陽性細(xì)胞率，即凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)。

六、免疫共沉淀

神經(jīng)元經(jīng)過相應(yīng)處理后，提取蛋白并與Protein A/G beads和GluN2B抗體或PSD95抗體孵育過夜。樣品經(jīng)Western blot檢測(cè)。

七、蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)

神經(jīng)元經(jīng)過相應(yīng)處理后，RIPA法裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法定量。在12%聚丙烯凝膠中電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，配制適當(dāng)濃度一抗4 ℃孵育過夜。PBST漂洗后，加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫封閉2 h，PBST漂洗后加發(fā)光液顯影。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、mGluR1阻滯劑LY367385對(duì)NMDA所致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用

分別用濃度為1 μM、10 μM、50 μM和100 μM的LY367385處理神經(jīng)元1 h后，向培養(yǎng)基中加入10 μM NMDA造成神經(jīng)元細(xì)胞興奮性損傷，24 h后測(cè)定細(xì)胞活性。同樣方法處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH含量。我們發(fā)現(xiàn)，與NMDA損傷組相比，10 μM、50 μM和100 μM LY367385預(yù)處理后，細(xì)胞活性明顯增加，并且LDH含量明顯降低(P<0.05)。見圖1。為深入探討LY367385的作用，我們選取50 μmol/L的LY367385進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 mGluR1阻滯劑LY367385對(duì)NMDA所致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用

Fig 1 The mGluR1 antagonist LY367385 protects against NMDA-induced neuronal injury

A: Cell viability; B: LDH release.

aP< 0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

二、mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經(jīng)元凋亡

用10 μM NMDA 處理神經(jīng)元細(xì)胞24 h后，AI值(39.08%±8.36%,P<0.05)與對(duì)照組(5.42%±2.59%,P<0.05)相比顯著升高(P<0.05)。50 μM LY367385預(yù)處理1 h后，再加入10 μM NMDA處理細(xì)胞24 h，AI值(19.96%±8.71%,P<0.05)較NMDA處理組顯著降低(P<0.05)。見圖2。表明NMDA可以造成的神經(jīng)元凋亡，而mGluR1阻滯劑LY367385可以減輕神經(jīng)元凋亡，對(duì)NMDA引起的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。

圖2 mGluR1阻滯劑LY367385可以抑制NMDA造成的神經(jīng)元凋亡

Fig 2 The mGulR1 antagonist LY367385 inhibits NMDA-induced neuronal apoptosis

A: TUNEL staining; B: Apoptotic rate.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

圖3 LY367385可以抑制NMDA造成的NR2B-PSD95表達(dá)增加

Fig 3 LY367385 attenuates the formation of NR2B-PSD95 complex

A: Co-IP of NR2B with PSD95; B: CO-IP of PSD95 with NR2B.

aP<0.05,vsControl group;bP<0.05,vsNMDA group.

三、LY367385可以抑制NMDA造成的GluN2B-PSD95表達(dá)增加

應(yīng)用免疫共沉淀分析GluN2B-PSD95相互作用結(jié)果，以進(jìn)一步分析mGluR1與PSD95在體外是否相互作用。以GluN2B的抗體進(jìn)行免疫沉淀，在免疫沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)PSD95，再以PSD95的抗體進(jìn)行免疫沉淀，在沉淀產(chǎn)物中檢測(cè)GluN2B，結(jié)果提示，GluN2B與PSD95存在內(nèi)源性的相互作用。見圖3。

討論

mGluRs廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體家族，目前已知有8種亞型。根據(jù)其結(jié)構(gòu)同源性、藥理學(xué)特性和傳導(dǎo)通路分成3組，目前研究最為廣泛的主要是第一組mGluRs，包括mGluR1和mGluR5[9]。mGluRs被激活后，通過激活磷脂酶C(phospholipase C, PLC)引起磷脂酰肌醇(phosphoinositide, PI)水解，產(chǎn)生二酰基甘油(diacylglcerol, DAG)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate, IP3)，從而引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+增加，產(chǎn)生一系列的生理和病理反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察了mGluR1特異性阻滯劑LY367385對(duì)NMDA引起的神經(jīng)元細(xì)胞興奮性損傷的作用，發(fā)現(xiàn)LY367385對(duì)減輕NMDA引起的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有一定的作用，并且可以影響GluN2B-PSD95復(fù)合體的表達(dá)。

突出后致密物(postsynaptic density, PSD)是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)突出后膜下的高電子密度特化區(qū)，主要由谷氨酸受體及相關(guān)的支架蛋白及信號(hào)通路蛋白組成[10]。PSD95是其中一種主要的蛋白成分，參與了多條信號(hào)通路的表達(dá)和作用。NMDA受體是iGluRs家族中重要的類型，也是PSD的重要組成部分。NMDA受體可以通過NR2亞基的C末端與PSD95的PDZ1結(jié)構(gòu)域直接連接，形成NMDAR-PSD95復(fù)合體。PSD95還可與其他突觸后結(jié)構(gòu)蛋白相連，如GKAP和Shank，后者還可以間接與mGluRs胞內(nèi)末端連接[11-12]。由PSD95連接的這種復(fù)雜的突觸后細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)有可能參與和調(diào)控了多種胞內(nèi)信號(hào)通路的作用。在NMDA損傷的神經(jīng)元中，用LY367385阻斷mGluR1后，GluN2B-PSD95復(fù)合體的表達(dá)顯著減少。因此，mGluR1可能通過與突觸后致密物質(zhì)PSD95的相互作用影響NMDA受體功能，從而減輕細(xì)胞興奮性損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

LY367385對(duì)抗NMDA所致的神經(jīng)元損傷的作用表明，mGluR1在神經(jīng)系統(tǒng)興奮性損傷中起了重要作用，mGluR1的阻滯劑有望成為新的神經(jīng)保護(hù)劑。