張林琳 方 峰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科,武漢 430030)

慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)是一種進(jìn)展性疾病，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染后，如不及時(shí)治療，將可能發(fā)展為肝硬化、肝癌甚至肝功能衰竭。全世界約有20億人感染乙肝病毒，其中近2.5億人為慢性乙肝病毒感染患者[1]。慢性HBV感染患者的免疫特征是T細(xì)胞衰竭，在感染過程中，病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)低下，阻礙了病毒的清除和肝炎的恢復(fù)。T細(xì)胞衰竭已被認(rèn)為是T細(xì)胞功能障礙在慢性病毒感染中的一個(gè)重要機(jī)制[2]。而大量研究表明，程序性死亡受體-1(Programmed death-1，PD-1)作為活化T細(xì)胞表面的一種抑制性受體，通過與其配體PD-L結(jié)合，所傳遞的免疫抑制信號(hào)可負(fù)向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖、細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞毒功能。故而此信號(hào)傳導(dǎo)途徑被認(rèn)為與病毒感染慢性化有關(guān)。阻斷PD-1信號(hào)通路能夠重建T細(xì)胞功能，抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)病毒清除。這為慢性乙型肝炎的治療提供了一個(gè)新的免疫策略。本文綜述了近年來PD-1信號(hào)通路在慢性乙型肝炎中的作用機(jī)制及相關(guān)研究進(jìn)展。

1 PD-1/PD-L生物學(xué)特征

程序性死亡受體-1(Programmed death-1，PD-1)也稱 CD279，屬于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一種分子量為50～55 kD的抑制性受體。廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞包括 CD4+/CD8+T細(xì)胞、自然殺傷 T 細(xì)胞 (NKT細(xì)胞)、B 細(xì)胞以及單核細(xì)胞。PD-1細(xì)胞外區(qū)為免疫球蛋白樣IgV區(qū)，胞質(zhì)區(qū)為兩個(gè)酪氨酸信號(hào)基序，一個(gè)為免疫受體酪氨酸抑制基序(Immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)，另一個(gè)為免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序 (Immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM) 。

PD-1 配體(Ligand of programmed death-1，PD-L)包括兩種亞型 (PD-L1 和PD-L2)，其中 PD-L1(CD274) 持續(xù)表達(dá)于 B 細(xì)胞、T 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞 (DC) 及巨噬細(xì)胞，并在細(xì)胞激活后上調(diào)表達(dá)，通過與PD-1結(jié)合抑制T、B細(xì)胞活性來防止自身免疫疾病的發(fā)生;而 PD-L2(CD273) 僅見于 DC 及巨噬細(xì)胞激活時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)，主要參與調(diào)控自然環(huán)境抗原引起的免疫反應(yīng)[3]。

PD-1與激活T細(xì)胞的PD-L1結(jié)合后，其ITSM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致由CD28介導(dǎo)的磷脂酰肌醇激酶(PI3K)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)發(fā)生去磷酸化，從而削弱TCR/CD28 信號(hào)對(duì)免疫細(xì)胞的活化作用，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞活性的作用[4]。

2 PD-1介導(dǎo)T細(xì)胞功能衰竭的機(jī)制

2.1HBV感染導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭 乙型肝炎病毒(HBV)是導(dǎo)致肝臟損傷和炎癥的最常見的病毒。在感染急性期，初始T細(xì)胞在抗原刺激下分化成效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)HBV病毒進(jìn)行有效清除。然而在慢性HBV感染中，由于病毒載量的增加、抗原的持續(xù)性刺激及炎癥持續(xù)存在，機(jī)體不能對(duì)HBV病毒產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，在免疫清除和免疫耐受之間進(jìn)行長期博弈，導(dǎo)致病毒特異性CD8+T細(xì)胞不能分化成為記憶性T細(xì)胞，而是以一種不同于效應(yīng)T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞的分化類型存在——功能衰竭T細(xì)胞。這種T細(xì)胞效應(yīng)功能逐步喪失最終發(fā)生凋亡即“T細(xì)胞衰竭”[5，6]。衰竭的T細(xì)胞高表達(dá)多種抑制性受體如程序性細(xì)胞死亡受體-1(PD-1)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA4)、淋巴細(xì)胞活化基因-3(LAG-3)、CD244 (2B4)、CD160等，其中PD-1被認(rèn)為是衰竭T細(xì)胞的標(biāo)志分子[7]。Barber等[8]在研究慢性感染淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)小鼠中，首次描述了在衰竭的CD8+T細(xì)胞上共抑制受體PD-1的高表達(dá)，且阻斷PD-1通路后可部分恢復(fù)耗竭的T細(xì)胞功能。之后越來越多研究發(fā)現(xiàn)在慢性乙型肝炎中HBV特異性CD8+T細(xì)胞中多種抑制性受體高度表達(dá)，阻斷PD-1/PD-L信號(hào)通路可恢復(fù)T細(xì)胞功能[9-11]。由此可見，PD-1抑制性調(diào)節(jié)信號(hào)通路在HBV特異性T細(xì)胞衰竭中發(fā)揮重要作用。

2.2功能衰竭T細(xì)胞高度表達(dá)PD-1 在慢性乙型肝炎中，HBV特異性T細(xì)胞功能低下與T細(xì)胞活化共刺激信號(hào)受到抑制有關(guān)。Bengsch等[9]對(duì)98例HLA-A2+慢性感染患者進(jìn)行體外分析HBV特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)、多種抑制受體表達(dá)及T細(xì)胞分化標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)HBV特異性CD8+T細(xì)胞表達(dá)多種抑制性受體( PD-1、2B4、Tim-3、CTLA-4和BTLA)，但以PD-1表達(dá)占主導(dǎo)地位，約為79.3%。體外阻斷這些抑制性受體通路可以不同程度的恢復(fù)T細(xì)胞增殖能力及IFN-γ、TNF-α及IL-2等細(xì)胞因子分泌功能，但以阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路所產(chǎn)生的T細(xì)胞功能恢復(fù)效應(yīng)最為顯著。通過對(duì)其表型分析發(fā)現(xiàn)，HBV特異性CD8+T細(xì)胞 CD27+CCR7-CD45RA-表型占43.4%，CD27+CCR7+CD45RA-表型占30.4%，CD27-CCR7-CD45RA-表型僅占15.8%，且PD-1在CD27+CCR7-CD45RA-表型的T細(xì)胞中表達(dá)量最高。已知CD45RA+的T淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的效應(yīng)功能，可分泌IFN-γ和TNF-α，高表達(dá)穿孔素和顆粒酶等細(xì)胞毒分子。而在慢性乙型肝炎患者中，HBV特異性T細(xì)胞以CD27+CCR7-CD45RA-表型為主，這類T淋巴細(xì)胞分化不完全，不能發(fā)揮效應(yīng)功能，且這類細(xì)胞高度表達(dá)PD-1抑制其增殖、分泌細(xì)胞因子及細(xì)胞毒功能，故而不能徹底清除HBV，使HBV持續(xù)存在。

Tang等[12]通過對(duì)CHB患者T細(xì)胞CD28家族受體表達(dá)譜進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在慢性HBV感染時(shí)，CD4+和CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)量增加，且HBeAg(+)患者CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)水平明顯高于HBeAg(-)患者，CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)與HBV DNA滴度呈正相關(guān)。提示PD-1的高表達(dá)與慢性HBV感染有關(guān)，HBeAg(+)與HBV DNA促進(jìn)PD-1的表達(dá)，導(dǎo)致T細(xì)胞損傷。Liu等[13]在研究彌漫型大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)合并乙型肝炎病毒(HBV)感染PD-1的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，HBsAg(+)組PD-1表達(dá)率明顯高于HBsAg(-)組，且HBsAg(+)組的臨床預(yù)后較HBsAg(-)組差。其結(jié)果表明PD-1的高表達(dá)可能與HBsAg(+)組患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，有針對(duì)性的PD-1治療策略可以改善HBsAg(+) DLBCL患者的預(yù)后。

上述研究表明，PD-1的表達(dá)不僅由HBV特異性CD8+T細(xì)胞特異性表型決定，HBV病毒載量增加和抗原持續(xù)刺激也可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞表達(dá)PD-1。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后,通過招募SHP1和SHP2磷酸酶到酪氨酸磷酸化的ITIM和ITSM基序，終止ZAP70和PI3K磷酸化，直接抑制TCR/CD28信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]；此外，PD-1可促進(jìn)CBL家族E3泛素連接酶的表達(dá)，使TCR鏈泛素化而不能識(shí)別抗原，間接抑制TCR/CD28信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；PD-1還可抑制CK2和CKD表達(dá)水平及活性，抑制PI3K-AKT-PKCθ通路，從而抑制T細(xì)胞生長。PD-1通過抑制上述信號(hào)通路抑制HBV特異性CD8+T細(xì)胞的增殖及功能，造成T細(xì)胞衰竭，從而無法對(duì)HBV病毒發(fā)揮效應(yīng)。

2.3阻斷PD-1信號(hào)通路可改善T細(xì)胞功能 多項(xiàng)體外研究證明，抑制PD-1/PD-L1信號(hào)通路可促進(jìn)HBV特異性CD8+T細(xì)胞功能恢復(fù)，使T細(xì)胞增殖能力增加，IFN-γ及IL-2等細(xì)胞因子分泌增多[15,16]。在Tang等[12]的研究中還發(fā)現(xiàn)阻斷PD-1/PD-L1通路后，CHB患者外周血CD4+T細(xì)胞功能增強(qiáng)。CD4+T細(xì)胞主要通過分泌細(xì)胞因子支持CD8+T細(xì)胞來參與抗病毒反應(yīng)，CD4+T細(xì)胞功能的改善可能促進(jìn)CD8+功能的恢復(fù)或逆轉(zhuǎn)CD8+T細(xì)胞的衰竭。阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路后T-bet/GATA-3升高，CD4+T細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá)明顯增強(qiáng),從而改善T細(xì)胞功能。這些數(shù)據(jù)表明PD-1/PD-L1阻斷的作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)CD28家族的共刺激受體和共抑制受體的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。提示CD28家族受體可作為快速監(jiān)測慢性乙型肝炎治療過程中T細(xì)胞功能變化的潛在臨床指標(biāo)。

2.4PD-1單核苷酸多態(tài)性與HBV易感性相關(guān) PD-1作為一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和外周免疫耐受的免疫抑制分子，越來越多地被證明參與影響乙肝病毒感染的結(jié)局和病程。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PD-1基因3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)rs 10204525的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)與慢性乙肝病毒感染的易感性和病程有關(guān)。

Zhang等[18]通過對(duì)157例中國漢族慢性乙型肝炎病毒感染者的PD-1 rs 10204525基因型進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，rs 10204525 AA基因型PD-1 mRNA水平顯著高于AG 基因型及GG基因型；而正常對(duì)照組PD-1 mRNA水平與PD-1 rs 10204525基因型則無相關(guān)性。該研究結(jié)果提示，PD-1 rs10204525 AA基因型對(duì)HBV感染具有高易感性，可促進(jìn)PD-1的表達(dá)，加快病程進(jìn)展。

在其隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，用microRNA-4717轉(zhuǎn)染慢性乙型肝炎患者PD-1 rs10204525 GG基因型的淋巴細(xì)胞，可使其PD-1表達(dá)水平明顯降低，TNF-α及IFN-γ表達(dá)明顯增多[19]；然而用miR-4717轉(zhuǎn)染AA基因型的淋巴細(xì)胞則無明顯變化，且慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-4717水平明顯下降，該研究表明miR-4717在PD-13′UTR與SNP靶標(biāo)rs10204525等位基因G發(fā)生特異性相互作用，從而調(diào)控PD-1基因表達(dá)，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)的改變，影響慢性HBV感染的易感性和病程。

3 慢性乙型肝炎的治療前景

慢性乙型肝炎是一種進(jìn)展性疾病，如果不及時(shí)治療將可能發(fā)展為肝硬化、肝癌甚至肝功能衰竭。已有研究資料顯示HBV感染者病毒載量越高，疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)越大。因此，將HBV DNA長期控制在不可測的水平，可降低疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)?！堵砸倚透窝追乐沃改?2015更新版)》[20]指出，目前我國治療慢性乙型肝炎主要依賴于抗病毒治療如干擾素類藥物(普通INF-α和聚乙醇干擾素pegIFN-α)及核苷(酸)類似物(NAs)治療。然而，這些抗病毒藥物只能抑制卻無法根除HBV，且由于患者耐藥性、依賴性、免疫力和經(jīng)濟(jì)情況等的差異都可能導(dǎo)致治療失敗。因此，臨床迫切需要確定新的治療乙肝病毒感染的策略。

3.1PD-1/PD-L1信號(hào)通路阻斷治療 目前阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路治療慢性病毒感染和癌癥已呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。2014年美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)已批準(zhǔn)兩種PD-1阻斷抗體(Pembrolizumab和Nivolumab)用于治療晚期黑色素瘤、鱗狀非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌[21]。2017年9月，美國FDA批準(zhǔn)PD-1免疫檢查點(diǎn)阻斷劑(Nivolumab,Opdivo)用于治療肝細(xì)胞性肝癌患者[22]。2018年6月15日，我國國家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批準(zhǔn)納武利尤單抗注射液(Nivolumab injection)用于治療非小細(xì)胞肺癌成人患者。在慢性HBV感染中已有體外研究表明，PD-1信號(hào)通路阻斷治療可在一定程度上恢復(fù)病毒特異性CD8+T細(xì)胞的功能[23,24]。已有相關(guān)研究利用動(dòng)物模型對(duì)使用PD-1阻斷劑治療慢性HBV感染的安全性和有效性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用抗PD-L1單克隆抗體療法(aPD-L1)治療旱獺肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus，WHV)感染的旱獺可恢復(fù)其T細(xì)胞功能，且不引起肝損傷[25,26]。在Liu等[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，aPD-L1、恩替卡韋和治療性疫苗聯(lián)合應(yīng)用與單用恩替卡韋或治療性疫苗相比，能顯著提高治療效果，且不引起肝毒性。目前研究證明PD-1/PD-L1通路阻斷可作為治療慢性乙型病毒肝炎的一種新的治療策略，值得進(jìn)行進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)研究評(píng)估其療效及安全性。

3.2HBV-pSTAT3-SALL4-miR-200c-PD-L1軸調(diào)節(jié)治療 臨床資料顯示，PD-1/PD-L1的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者腫瘤大小、血管浸潤、腫瘤分期呈正相關(guān)[28-30]。因此，肝細(xì)胞誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)，CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)PD-1高表達(dá)被認(rèn)為是CD8+T細(xì)胞衰竭的關(guān)鍵。Sun等[22]通過對(duì)98例HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行臨床隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)SALL4、PD-L1表達(dá)與miR-200c表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，SALL4與PD-L1低表達(dá)、miR-200c高表達(dá)的患者存活時(shí)間更長。其研究發(fā)現(xiàn)miR-200c可直接靶向CD274(編碼PD-L1)的3′-UTR，拮抗HBV介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)CD8+T細(xì)胞衰竭。然而，miR-200c轉(zhuǎn)錄可被SALL4抑制，SALL4是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新，SALL4在人胎肝中表達(dá)，在健康成人肝臟中不表達(dá)，但可通過HBV誘導(dǎo)的STAT3激活而重新表達(dá)，并通過其轉(zhuǎn)錄抑制功能直接抑制miR-200c的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而造成PD-L1高表達(dá)和T細(xì)胞衰竭。由此，Sun等[22]提出HBV-pSTAT3-SALL4-miR-200c-PD-L1軸可調(diào)控PD-L1，并證實(shí)miR-200c過表達(dá)或SALL4沉默在恢復(fù)CD8+T細(xì)胞功能(特別是HBV特異性和記憶CD8+T細(xì)胞反應(yīng))和減少HBV復(fù)制方面具有治療潛力，因此，肝內(nèi)miR-200c治療或中斷SALL4再活化(SALL4沉默或SALL4抑制劑)可能成為治療慢性乙型肝炎的潛在治療策略。

4 結(jié)語

隨著對(duì)HBV慢性感染相關(guān)機(jī)制的深入研究，T細(xì)胞衰竭在HBV感染慢性化過程中的作用越來越被研究者重視。在HBV慢性感染過程中，由于病毒抗原持續(xù)刺激，大量HBV特異性T淋巴細(xì)胞聚積在炎癥局部，無法分化成記憶細(xì)胞，而是以一種衰竭T細(xì)胞(CD27+CCR7-CD45RA-)分化類型存在，這類衰竭的HBV特異性CD8+T細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞毒功能低下，但大量分泌以PD-1為主的抑制性受體，與其配體結(jié)合后可對(duì)T細(xì)胞發(fā)揮抑制性調(diào)節(jié)作用，抑制TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使其分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子及細(xì)胞毒功能減弱甚至喪失從而處于一種“T細(xì)胞衰竭”的狀態(tài)，阻斷PD-1信號(hào)通路又可改善“T細(xì)胞衰竭”的狀態(tài)，恢復(fù)T細(xì)胞效應(yīng)功能，因此，PD-1/PD-L1信號(hào)通路阻斷劑可能是治療慢性乙型肝炎的一種可行性免疫治療策略。然而，HBV慢性感染過程中T細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，多種調(diào)節(jié)信號(hào)通路同時(shí)參與其中形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路的效應(yīng)和安全性還需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。繼續(xù)探索PD-1抑制性信號(hào)通路導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭的機(jī)制有助于深入理解慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)理，制定新的治療方案。