吳 鵬 趙玉梅 楊玲麟

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，瀘州 646000)

根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International agency for research on cancer，IARC)最新制定的GLOBOCAN 2018標(biāo)準(zhǔn)，肺癌仍然是全球發(fā)病率和死亡率最高的癌癥(分別占11.6%、18.4%)[1]。其中，非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占85%[2]，且絕大多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展為晚期,既往晚期NSCLC的治療手段主要為含鉑雙藥化療和分子靶向治療，但二者目前均進(jìn)入了瓶頸期[3]。隨著免疫治療的異軍突起，特別是以程序性死亡受體-1(Programmed death-1，PD-1)/程序性死亡配體-1(Programmed death-ligand 1，PD-L1)為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑(Immune checkpoint blockers,ICB)給部分NSCLC患者帶來(lái)了明顯的臨床獲益[4]，免疫治療逐漸成為了晚期NSCLC的研究熱點(diǎn)。但是，大約只有不超過(guò)30%的患者對(duì)ICB產(chǎn)生應(yīng)答[5]，甚至部分患者出現(xiàn)免疫超進(jìn)展[6]，因此，探索理想的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，從而篩選出優(yōu)勢(shì)人群是當(dāng)前亟需解決的問題。

PD-L1是近些年研究和運(yùn)用最多的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，美國(guó)藥品及食品管理局(Food and drug administration，F(xiàn)DA)已批準(zhǔn)腫瘤細(xì)胞PD-L1的檢測(cè)作為NSCLC接受PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑使用的伴隨診斷或補(bǔ)充診斷，然而，因腫瘤異質(zhì)性、檢測(cè)手段未統(tǒng)一、PD-L1的動(dòng)態(tài)變化等諸多因素導(dǎo)致PD-L1仍然不能成為理想的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[7]。 腫瘤突變負(fù)荷(Tumor mutational burden,TMB)是近幾年新出現(xiàn)的免疫療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，研究表明，多種實(shí)體瘤接受PD-1抑制劑的有效率與TMB的表達(dá)呈線性關(guān)系[8]，而關(guān)于TMB與NSCLC接受ICB療效的研究則是當(dāng)前研究最受關(guān)注的一個(gè)方面，多個(gè)報(bào)道在近兩年的AACR、ASCO及其WCLC大會(huì)上進(jìn)行了交流。本文就TMB作為NSCLC免疫療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的研究進(jìn)展作一綜述。

1 TMB的定義及其作為ICB療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的理論依據(jù)

TMB通常指每百萬(wàn)堿基中被檢測(cè)出的體細(xì)胞突變的基因數(shù)目，突變包括基因編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失錯(cuò)誤[9]。目前，TMB預(yù)測(cè)腫瘤免疫療效的機(jī)制尚不完全清楚。一般認(rèn)為，TMB越高，產(chǎn)生新抗原的數(shù)量和頻率會(huì)增加，即機(jī)體的免疫原性增強(qiáng)，使得腫瘤特異性T細(xì)胞能夠?qū)π驴乖M(jìn)行識(shí)別并最終產(chǎn)生免疫應(yīng)答[10]。CTLA-4和PD-1是至今為止研究最成熟的兩個(gè)檢查點(diǎn)，CTLA-4通過(guò)與B7分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合共刺激信號(hào)分子CD28從而抑制T細(xì)胞的活化，PD-1則主要通過(guò)與PD-L1結(jié)合導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。而ICB的作用機(jī)制則是阻斷免疫抑制信號(hào)，恢復(fù)T細(xì)胞功能，增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)[11]。根據(jù)Chen等[12]提出的腫瘤-免疫循環(huán)概念，腫瘤免疫反應(yīng)是一個(gè)多環(huán)節(jié)過(guò)程，主要包括7個(gè)步驟。因此，TMB的高表達(dá)聯(lián)合ICB在理論上可以促進(jìn)腫瘤-免疫循環(huán)多步反應(yīng)，最終增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。多項(xiàng)臨床研究已證明TMB能夠預(yù)測(cè)實(shí)體瘤接受免疫治療的療效，如黑色素瘤[13]、膀胱癌[14]、小細(xì)胞肺癌[15](Small cell lung cancer,SCLC)，關(guān)于TMB與NSCLC的研究更是層出不窮。

2 TMB對(duì)NSCLC免疫治療的療效預(yù)測(cè)作用

2.1肺癌突變譜與免疫療效：非同義突變負(fù)荷 Rizvi等[16]用全外顯子測(cè)序(Whole exsome sequenc-ing，WES)技術(shù)測(cè)定了34例接受Pembrolizumab 治療的晚期NSCLC患者的基因組，以探索NSCLC患者突變譜對(duì)免疫療效的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在探索隊(duì)列中(n=16)，獲得持續(xù)臨床獲益(Durable clinical benefit，DCB)的患者中位非同義突變數(shù)明顯高于無(wú)持續(xù)獲益(No durable benefit，NDB)的患者(302 vs 148,P=0.02)；并且73%的高非同義突變負(fù)荷患者達(dá)到了DCB，而低非同義突變負(fù)荷的患者中僅13%的患者達(dá)到 DCB(P=0.04)。不僅如此，高非同義突變負(fù)荷患者的客觀反應(yīng)率(Objective response rate，ORR)和中位無(wú)進(jìn)展生存期(Progression-free survival，PFS)均明顯優(yōu)于低非同義突變負(fù)荷患者(ORR：63% vs 0%，P=0.03；中位 PFS：14.5月 vs 3.7 月，P=0.01；HR：0.19，95%CI：0.05～0.70)，而在驗(yàn)證隊(duì)列(n=18)也得到了同樣的結(jié)果。

2.2初露頭角：PD-L1預(yù)測(cè)失敗到TMB登上舞臺(tái) CheckMate-026是一項(xiàng)旨在比較 Nivolumab與含鉑雙藥化療作為晚期NSCLC一線治療療效的臨床試驗(yàn)[17]，該研究將PD-L1表達(dá)高于5%預(yù)設(shè)為標(biāo)志物，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)該亞組患者并未從免疫治療中獲益，事后的探索性分析新增加了PD-L1≥ 50%以及TMB兩個(gè)指標(biāo)，雖然PD-L1≥ 50%的肺癌患者仍未從免疫治療中獲益，但TMB卻帶來(lái)了不小的驚喜。研究者采用WES技術(shù)，將TMB≥ 243定義為高TMB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高TMB的患者中，Nivolumab組與化療組的ORR為47% vs 28%,且Nivolumab組的PFS也優(yōu)于化療組(中位PFS：9.7月vs 5.8 月;HR：0.62;95%CI：0.38 ～1.00)。同時(shí)，TMB與PD-L1的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P=0.059)，但值得注意的是，在Nivolumab組中，高TMB且PD-L1≥ 50%的患者的ORR達(dá)到了75%，明顯優(yōu)于其他亞組。CheckMate-026研究第一次讓腫瘤學(xué)者認(rèn)為TMB可能是肺癌免疫治療更具潛力的療效標(biāo)志物，并從此開啟了TMB作為肺癌免疫療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的新篇章。

2.3再接再厲：納入前瞻性研究預(yù)設(shè)因素與預(yù)測(cè)雙ICB療效 CheckMate-026研究結(jié)束后，另外兩項(xiàng)前瞻性研究則讓TMB的地位進(jìn)一步提高。CheckMate-568是一項(xiàng)評(píng)價(jià)雙ICB(Nivolumab 聯(lián)合Ipilimumab)作為晚期NSCLC一線治療的單臂Ⅱ期臨床試驗(yàn)[18]，通過(guò)FoundationOne CDx平臺(tái)檢測(cè)患者腫瘤組織TMB的表達(dá)，經(jīng)受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析后發(fā)現(xiàn)，TMB≥ 10是篩選免疫治療優(yōu)勢(shì)人群最合適的截取值，該部分患者的ORR為44%，明顯高于其他亞組及所有納入者的ORR。另一項(xiàng)探索雙ICB治療晚期NSCLC療效的Ⅲ期臨床試驗(yàn)(CheckMate-227)則將CheckMate-568的研究成果(TMB≥ 10)作為預(yù)設(shè)因素[19]。該研究分為三部分，第一部分將對(duì)比雙免疫治療與化療組的PFS作為共同主要終點(diǎn)，結(jié)果首先于2018年美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)年會(huì)上公布,隨后同步發(fā)表在《新英格蘭雜志》上。結(jié)果顯示，在高TMB(TMB≥ 10)患者中，雙免疫治療組的一年P(guān)FS率為42.6%，而化療組的為13.2%，兩組的中位PFS為7.2月vs 5.5月(HR：0.58，95%CI：0.41～0.81，P<0.001)，且雙免疫治療組的ORR也高于化療組(45.3% vs 26.9%)。亞組分析結(jié)果顯示，在高TMB患者中，無(wú)論其PD-L1的表達(dá)是否高于1%以及組織類型是鱗癌或非鱗癌，雙免疫治療組的臨床獲益均優(yōu)于化療組。CheckMate-227是迄今為止第一篇報(bào)道雙免疫聯(lián)合治療用于晚期NSCLC的Ⅲ期臨床研究，不僅再次證明了CheckMate-012 研究中雙ICB對(duì)晚期NSCLC的有效性，同時(shí)也驗(yàn)證了CheckMate-568研究中TMB截取值(TMB≥ 10)的可靠性[20]。

幾乎與此同時(shí)，同樣由Hellmann等[10]完成的一項(xiàng)回顧性研究也得出了類似的結(jié)果。研究團(tuán)隊(duì)分析了CheckMate-012中的75例晚期NSCLC患者，采用WES檢測(cè)其腫瘤組織TMB的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在獲得ORR和DCB中的患者TMB分別高于未獲得緩解和NDB患者(273 vs 114,P=0.000 4;210 vs 113,P=0.007 1)。高TMB(TMB≥ 158)的患者中，ORR、DCB率、PFS均優(yōu)于低TMB的患者(ORR:51% vs 13%,P=0.000 5;DCB:65%vs 34%,P=0.011;PFS:HR=0.41,P=0.0024)。此外，通過(guò)描繪ROC曲線發(fā)現(xiàn)TMB的表達(dá)與ORR及NDB具有明顯的相關(guān)性。

3 TMB檢測(cè)技術(shù)及樣本來(lái)源

3.1腫瘤組織：WES vs NGS 上述研究中的TMB檢測(cè)樣本全部來(lái)自腫瘤組織，對(duì)于腫瘤組織樣本，目前主要有兩種檢測(cè)技術(shù)，即WES和針對(duì)不同基因Panel的靶向第二代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing，NGS)，較早的研究多采用WES技術(shù)[13,16]，但是WES技術(shù)昂貴且耗時(shí)[21]，導(dǎo)致其不能成為常規(guī)檢測(cè)手段。相比WES，NGS檢測(cè)技術(shù)更容易在臨床上開展，CheckMate-227及CheckMate-568均采用了 FoundationOne CDx 平臺(tái)下的NGS技術(shù)檢測(cè)TMB。研究人員通過(guò)紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥研究中心的MSK-IMPACT NGS技術(shù)平臺(tái)對(duì)10 000多例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的癌癥患者進(jìn)行了基因測(cè)序，他們發(fā)現(xiàn)至少有9%的癌癥相關(guān)突變是WES不能檢測(cè)到的。不僅如此，MSK-IMPACT在1 597名患者(15%)中都檢測(cè)到了融合基因，其中最常見的分別是TMPRSS2-ERG、EGFRvⅢ、EML4-ALK和EWSR1-FLI1，而這些也是WES不能檢測(cè)到的[22]。

那么，WES及NGS檢測(cè)出的TMB是否具有相關(guān)性呢？NGS檢測(cè)出的TMB能夠精確地預(yù)測(cè)免疫療效嗎？Rizvi等[23]回顧性地分析了240例經(jīng)ICB治療的晚期NSCLC患者，采用MSK-IMPACT NGS技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)其TMB的表達(dá)，并對(duì)其中49例患者分別采用WES及NGS檢測(cè)TMB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種檢測(cè)技術(shù)測(cè)得的TMB具有高度相關(guān)性(P<0.001)，經(jīng)NGS檢測(cè)出的TMB在獲得DCB及其ORR的患者中明顯高于NDB及未獲得臨床緩解的患者(P=0.006 2、0.015 1)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)TMB進(jìn)行四分位分層時(shí)，DCB比例及PFS也會(huì)隨著TMB分層的增加而增加，TMB高于第50百分位數(shù)的患者DCB率及PFS均優(yōu)于TMB低于第50百分位數(shù)的患者(DCB率,38.6% vs 25.1%;P= 0.009;PFS:HR=1.38，P=0.024)。該研究不僅證實(shí)了NGS可準(zhǔn)確估算TMB，從而預(yù)測(cè)免疫治療的優(yōu)勢(shì)人群，也證明了WES和NGS檢測(cè)出的TMB呈高度相關(guān)性。2017年，美國(guó)FDA先后批準(zhǔn)了Foundation Medicine公司的FoundationOne CDx以及MSK-IMPACT技術(shù)平臺(tái)用于癌癥基因檢測(cè)(包括TMB)，因此NGS技術(shù)將會(huì)是今后檢測(cè)腫瘤基因的主流技術(shù)。

3.2液體組織活檢技術(shù)：基于血漿的TMB(bTMB)檢測(cè) NSCLC的治療最能體現(xiàn)出精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的理念[24]，因此，患者在治療前要檢測(cè)多個(gè)分子標(biāo)志物，如PD-L1、EGFR突變、ALK突變等。然而，約30%的NSCLC患者往往沒有足夠的組織標(biāo)本用來(lái)檢測(cè)所需要的分子標(biāo)志物[25]，此外，腫瘤具有異質(zhì)性，某一部位的腫瘤不能代表患者的整體情況[7]，再加上組織活檢可能增加轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，所以，發(fā)展無(wú)創(chuàng)性的檢測(cè)手段顯得十分必要。液體活檢技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展頗為迅速的一種以循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells，CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)、循環(huán)腫瘤微RNA(microRNA，miRNA) 及腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體為檢測(cè)物質(zhì)的新技術(shù)，它主要的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、非侵入性、可重復(fù)性強(qiáng)[26]。

來(lái)自加州大學(xué)的Gandara等[25]首次證實(shí)了血漿中的TMB(bTMB)可重復(fù)測(cè)定，并且bTMB的表達(dá)與NSCLC患者接受ICB療效相關(guān)。該研究收集了來(lái)自POPLAR[27]及OAK[28]兩項(xiàng)研究的患者血液樣本(POPLAR及OAK均是評(píng)價(jià)PD-L1抑制劑Atezolizumab治療晚期NSCLC的臨床試驗(yàn))，采用FoundationOne CDx NGS平臺(tái)檢測(cè)其ctDNA中TMB的表達(dá)，研究團(tuán)隊(duì)首先將bTMB和組織TMB(tTMB)作了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)=0.64，95%CI：0.56～0.71)。然后經(jīng)過(guò)一系列的運(yùn)算，將bTMB≥16作為POPLAR研究隊(duì)列中的閾值，并通過(guò)OAK研究隊(duì)列進(jìn)行驗(yàn)證，分析后發(fā)現(xiàn)，bTMB≥ 16 的患者能從免疫治療中獲得更好的預(yù)后，Atezolizumab組的PFS和OS均優(yōu)于多西他賽化療組(PFS：HR= 0.65，95%CI:0.47-0.92，P=0.013；中位OS：13.5月 vs 6.8月)。與CheckMate 568及CheckMate 227類似，bTMB預(yù)測(cè)作用與PD-L1的表達(dá)無(wú)關(guān)。

對(duì)于腫瘤組織不可用的NSCLC患者，bTMB的檢測(cè)是一種非常好的替代手段。關(guān)于bTMB的第一個(gè)前瞻性研究BFAST(NCT03178552)也正在開展，最終結(jié)果值得期待。

4 TMB與其他分子之間的聯(lián)系

PD-L1是當(dāng)前研究比較成熟的分子，關(guān)于TMB與PD-L1的關(guān)系也是研究者們比較感興趣的一個(gè)部分，然而，多個(gè)研究表明兩者的表達(dá)無(wú)相關(guān)性[17,19,25]，但對(duì)PD-L1及TMB一起分析時(shí)，高TMB且PD-L1陽(yáng)性的患者免疫應(yīng)答率明顯高于其他組合[23,25]。Rizvi等[16]發(fā)現(xiàn)在獲得DCB的高TMB患者中產(chǎn)生了POLD1、POLE、MSH2基因缺失突變，另外，他們還發(fā)現(xiàn)TMB與新抗原負(fù)荷具有相關(guān)性(P<0.000 1)，而新抗原負(fù)荷的表達(dá)也能預(yù)測(cè)免疫療效。在Hellmann等[10]的研究中，TP53基因突變富集在免疫治療應(yīng)答者中(P=0.048)，且TP53突變與TMB的增加高度相關(guān)，而在無(wú)應(yīng)答的患者中發(fā)現(xiàn)了STK11及PTEN基因突變。針對(duì)EGFR基因突變的靶向治療是NSCLC治療中非常重要的部分，一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)，EGFR驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的NSCLC患者不能從免疫治療中獲益，其中的機(jī)制之一就是EGFR陽(yáng)性患者整體低表達(dá)TMB[29，30]。從上述研究可以看出，TMB的表達(dá)與其他分子之間存在一定的關(guān)聯(lián)，但其中的機(jī)制和可能蘊(yùn)藏的信號(hào)通路尚未闡明，今后需要大樣本量的基因分析進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)與展望

TMB作為近年來(lái)NSCLC免疫療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物的“新秀”，多個(gè)研究表明其能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)免疫療效，檢測(cè)技術(shù)從WES到靶向NGS的出現(xiàn)，檢測(cè)樣本由腫瘤組織到血液的過(guò)渡，TMB的測(cè)定逐漸變得可行和方便，有希望成為今后NSCLC免疫治療的常規(guī)檢測(cè)分子。但它仍然是不完美的，首先，TMB的檢測(cè)手段目前尚未統(tǒng)一，其截取值也沒有一個(gè)較精確的范圍。其次，對(duì)于腫瘤組織來(lái)源的TMB，由于腫瘤存在異質(zhì)性，某個(gè)病灶的TMB不能反映整體的情況；再者，某些治療如化療和放療會(huì)對(duì)腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生變化，導(dǎo)致患者治療前后的TMB表達(dá)情況也不一致。另外，對(duì)于bTMB的檢測(cè)，其計(jì)算方法也有值得商榷和繼續(xù)探討的地方[25]。最后，由于機(jī)體的免疫系統(tǒng)是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，僅僅靠某一個(gè)分子標(biāo)志物進(jìn)行精確地預(yù)測(cè)療效是不大可能的，今后可以結(jié)合其他分子標(biāo)志物(如免疫微環(huán)境中的CD8+T細(xì)胞等)甚至臨床預(yù)后因素，建立一個(gè)綜合預(yù)測(cè)模型，為晚期NSCLC患者帶來(lái)更有效和個(gè)體化的免疫治療。