廖小平, 喻溥蛟,許嘉鴻

(1.上海市安亭醫(yī)院心血管內(nèi)科,上海201805;2.同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院心血管內(nèi)科,上海200065)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)已成為目前發(fā)病率及死亡率非常高的疾病之一[1].僅在美國,每年就有約150萬人發(fā)生急性心肌梗死.而隨著生活水平的提高以及生活方式的改變,目前我國的急性心肌梗死發(fā)病率也逐漸升高.而隨著再灌注治療技術(shù)的發(fā)展,急性的心肌梗死已能夠在發(fā)生的短期內(nèi)得到有效治療.盡管極大地提高了急性心肌梗死患者的存活率,但也催生出了新的問題.心臟缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)指的是心肌梗死罪犯血管打開后,快速血流重新流入心肌,在途經(jīng)受損的心肌細胞時由血液中HbO2造成二次打擊的氧化應(yīng)激損傷[1-3].這種損傷往往會造成心肌細胞的進一步壞死和凋亡、存活心肌細胞的線粒體功能障礙、蛋白激酶的激活、大量的炎癥反應(yīng)等,繼而導(dǎo)致患者的遠期預(yù)后不良,甚至死亡[4-5].因此,如何改善心臟缺血再灌注損傷是目前心血管病領(lǐng)域一個亟待解決的重要問題.

Sigma-1受體是一個長度為25 kD的分子伴侶,主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上[6],可以通過調(diào)節(jié)鉀離子通道、電壓敏感性的鈣離子通道來調(diào)節(jié)鈣離子進入細胞膜的濃度,還可以調(diào)節(jié)胞漿內(nèi)儲存的鈣離子流通,促進蛋白的折疊,提高細胞對于氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗性[7-9].Sigma-1受體廣發(fā)地分布在身體的各個組織中,包括心臟、大腦、肺臟、腎臟等[10].已有研究發(fā)現(xiàn),sigma-1受體對于多種器官的缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)有著重要的調(diào)節(jié)作用[11-14].Sigma-1受體的配體之一——BHDP(N-benzyl-N'-(2-hydroxy-3,4-dimethoxybenzyl)-piperazine,N-芐基-N'-(2-羥基-3,4-二氧芐基)-哌嗪),能夠有效改善肝臟受到的氧化應(yīng)激反應(yīng)[11].在大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型中,使用sigma-1受體激動劑氟伏沙明,能夠通過Akt介導(dǎo)的NO信號通路顯著改善腎臟功能,提高大鼠的存活率[12].而在心臟相關(guān)的研究中,研究者也發(fā)現(xiàn),sigma-1受體參與了心臟重構(gòu)的病理生理過程[15-20],sigma-1受體激動劑SA4503以及氟伏沙明都可以改善壓力負荷所致的心臟重構(gòu),保護心臟功能不受損.然而,sigma-1受體在心臟缺血再灌注損傷中的作用尚不清楚.因此,本工作的目的旨在探索sigma-1受體對于心臟缺血再灌注損傷的作用,以期為心臟缺血再灌注的診療提供一個全新的分子靶點.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗動物

雄性C57BL/6小鼠,8～10周齡,質(zhì)量28±1 g,飼養(yǎng)于SPF級動物房,溫度22±2°C,濕度50%～60%.所有操作均依照美國國立衛(wèi)生院(National Institutes of Health,NIH)的相關(guān)規(guī)定.

1.1.2 實驗儀器

多功能酶標(biāo)儀、微量移液器、旋渦混勻器、恒溫水浴鍋、離心機、半干轉(zhuǎn)膜槽、電泳儀、電泳凝膠成像系統(tǒng)、倒置顯微鏡、體視鏡、顯微手術(shù)器械、小動物呼吸機.

1.1.3 實驗試劑

實驗中所涉及的抗體包括一抗Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase-3、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrgenase,GAPDH)抗體,均購于Abclonal公司.Sigma-1受體激動劑SA4503以及抑制劑BD1047購于Sigma公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗方案

采用冠脈結(jié)扎法構(gòu)建小鼠的缺血再灌注模型.8周齡的C57BL/6小鼠經(jīng)過3 d的尾靜脈注射藥物SA4503(1 mg·kg-1·d-1)以及BD1047(1 mg·kg-1·d-1)后進行手術(shù). 手術(shù)步驟如下:①手術(shù)區(qū)域用75%的酒精擦拭消毒;②用1%戊巴比妥鈉按0.01 mL/g濃度腹腔注射麻醉小鼠;③在聲門下兩個氣管軟骨環(huán)之間切一個小孔,插入氣管插管,固定;④打開胸腔,用7-0線將冠狀動脈左前降支弓結(jié)扎;⑤逐層關(guān)胸,用6-0縫線固定肋骨,4-0縫線縫皮;⑥用5 mL注射器通過胸管邊抽氣邊拔出胸管,避免術(shù)后發(fā)生氣胸;⑦30 min后,再次打開胸腔,將結(jié)扎的線剪斷,關(guān)閉胸腔,縫合肋骨和皮膚;⑧24 h后收取心臟樣本.

1.2.2 四氮唑紅染色方法

心臟損傷的評估方式采用TTC/Evans藍雙染色法,其中TTC為四氮唑紅(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride).首先,將2%的Evans藍通過冠脈結(jié)扎的方式,僅灌注于心臟未缺血部分,未著色的部分稱為危險區(qū)(area at risk,AAR).接著從小鼠體內(nèi)快速取出心臟,置于-20°C冰箱中冷凍,冰凍后用刀片將心臟橫切為1～2 mm厚度的切片.將切片浸泡于37°C的1%TTC溶液中孵浴15 min后使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)漂洗.TTC未著色部分心肌組織呈現(xiàn)白色,為壞死的心肌組織,視為梗死區(qū)(infarction area,INF),著色的紅色區(qū)域為缺血但未壞死的組織.染色后使用倒置顯微鏡拍攝心肌切片照片,利用ImageJ軟件對圖形進行量化分析.

1.2.3 蛋白的提取

取適當(dāng)大小的心肌組織樣本,加入適量的細胞裂解液,用勻漿機將組織樣本破碎.隨后置于冰上裂解樣本15 min.接下來,將蛋白樣品置于離心機中以12 000 r/min離心30 min后,將蛋白上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中,加入上樣緩沖液后100°C使蛋白變性,迅速放入冰中冷卻,短時離心.采用標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BCA)定量方法對樣本進行蛋白含量均一化后待用.細胞裂解液配方(以1 mL為例)如下:1 mL細胞裂解液,10μL磷酸酶抑制劑,10μL苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF).

1.2.4 免疫印跡法

根據(jù)目的蛋白的分子量配制不同濃度的分離膠,一般大多采用濃度為8%,10%與12%的分離膠.電泳條件如下:電壓80 V(濃縮膠)～120 V(分離膠),電泳時間約2～3 h,溴酚藍至膠底邊即可停止電泳.選用聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)作為蛋白轉(zhuǎn)膜載體,轉(zhuǎn)膜條件為恒流200 mA轉(zhuǎn)2 h.轉(zhuǎn)在PVDF上的樣品用PBS配制5%的BSA作為封閉液常溫封閉處理1 h后,用PBST(PBS溶液加上Tween-20)清洗干凈.一般按照1∶1 000的比例用5%BSA配置一抗,并將樣品于4°C冰箱內(nèi)孵育一抗過夜.第二天棄去一抗,用PBS清洗干凈后,用5%BSA按照1∶10 000的比例配制二抗,并于常溫孵育二抗2 h.使用化學(xué)發(fā)光顯影試劑對蛋白表達情況進行檢測.

1.2.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析,3組及3組以上單因素樣本運用單因素方差分析(analysis of variance,ANOVA),方差齊性時再運用Bonferroni分析作兩兩比較.統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 Sigma-1受體抑制劑BD1047對小鼠心臟缺血再灌注損傷的影響

為了明確sigma-1受體對于心臟缺血再灌注損傷的作用,首先檢測了使用sigma-1受體抑制劑后小鼠心臟缺血再灌注損傷的面積.經(jīng)過3 d的尾靜脈注射sigma-1受體抑制劑BD1047后發(fā)現(xiàn),接受了BD1047預(yù)處理后的小鼠心肌受損面積即梗死區(qū)與危險區(qū)比值(INF/AAR)要遠大于對照組,如圖1所示,圖中LV為左心室(left ventricle),***代表P＜0.01,n=6.

圖1 BD1047對心臟缺血再灌注損傷面積的影響Fig.1 Effects of BD1047 on myocardial infarction size induced by MIRI

2.2 Sigma-1受體抑制劑BD1047對心肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

同時,在蛋白水平使用了蛋白免疫印跡法檢測心肌組織中的凋亡相關(guān)蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于對照組,BD1047組的抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達明顯下調(diào),而與促凋亡相關(guān)的蛋白Bax以及Capase-3的活化水平明顯升高,如圖2所示,圖中*代表P＜0.05,**代表P＜0.01,***代表P＜0.001,n=3.

2.3 Sigma-1受體激動劑SA4503對小鼠心臟缺血再灌注損傷的影響

在明確了抑制sigma-1受體對心臟缺血再灌注損傷有協(xié)同作用后,檢測了sigma-1受體的激活對小鼠心臟缺血再灌注損傷的作用.經(jīng)過3 d的尾靜脈注射sigma-1受體激動劑SA4503后發(fā)現(xiàn),接受了SA4503預(yù)處理后的小鼠心肌受損面積要遠小于對照組(見圖3,圖中***代表P＜0.001,n=6).

2.4 Sigma-1受體激動劑SA4503對心肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

同樣地,在蛋白水平使用蛋白免疫印跡法檢測心肌組織中的凋亡相關(guān)蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于對照組,SA4503組的抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達明顯上調(diào),而與促凋亡相關(guān)的蛋白Bax以及Capase-3的活化水平明顯降低(見圖4,圖中*代表P＜0.05,**代表P＜0.01,n=3).

圖2 BD1047對Bax,Bcl-2以及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.2 Effects of BD1047 on expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins

圖3 SA4503對心臟缺血再灌注損傷面積的影響Fig.3 Effects of SA4503 on myocardial infarction size induced by MIRI

3 討論

隨著藥物溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠脈旁路移植術(shù)等再灌注治療技術(shù)日益完善且廣泛普及,心臟再灌注損傷的干預(yù)治療備受重視.目前,已有觀點多集中于心肌梗死后缺血再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷及其產(chǎn)生的強烈炎癥反應(yīng).這些損傷反應(yīng)的最終結(jié)果是大片細胞的壞死和進一步的心肌細胞凋亡.

圖4 SA4503對Bax,Bcl-2以及Caspase-3蛋白表達的影響Fig.4 Effects of SA4503 on expression of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 proteins

通常來說,心肌細胞凋亡發(fā)生在心肌梗死缺血后的幾分鐘內(nèi)[21-22]以及冠脈閉塞被打通后血液再灌注時[23].一些基礎(chǔ)研究以及臨床試驗認(rèn)為,凋亡是心臟缺血再灌注損傷最重要的病理生理機制[24].當(dāng)再灌注發(fā)生時,血流快速恢復(fù)的同時帶來了大量的氧分子以及細胞外pH值的變化,這些均導(dǎo)致氧自由基的釋放以及鈣離子的超載,繼而發(fā)生線粒體膜滲透性的增加,線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放,進而導(dǎo)致更多的促凋亡因子從線粒體中被釋放出來[24-29].

Sigma-1受體本身對于線粒體離子通道有著重要的調(diào)控作用.本工作的研究中發(fā)現(xiàn)了抑制sigma-1受體將會加重小鼠心臟缺血再灌注損傷時心肌細胞的凋亡水平,進而加重心臟的損傷程度.相反,激活sigma-1受體則可以改善心肌細胞的凋亡水平,減少心臟的損傷.從已有研究中可知,通過激動劑SA4503激活sigma-1受體后,線粒體鈣離子通道的激活、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的正常生產(chǎn)為心臟的收縮舒張功能提供了穩(wěn)定的鈣穩(wěn)態(tài)環(huán)境以及充足的能量供給,從而改善了心臟的功能[15,30-31].除此之外,sigma-1受體對于Akt信號通路也有一定的激活作用,而這也是一條控制細胞凋亡、自噬、生長的經(jīng)典信號通路[18].