劉 存 ，崔尚金 ?

（1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.農業(yè)部獸用藥物與診斷技術北京科學觀測實驗站，北京 100193）

牛病毒性腹瀉-黏膜?。˙ovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起，主要以口腔、食管、胃、腸等部位黏膜侵蝕性或潰瘍性病變、腹瀉、白細胞減少、持續(xù)性感染及懷孕母牛流產或產畸形胎兒等癥狀為特征[1-2]。BVDV在世界范圍內廣泛流行，給養(yǎng)牛業(yè)國家造成嚴重的經濟損失[3]。犢牛感染BVDV后，潛伏期7～9 d，發(fā)病率為2%～5%，犢牛死亡率可達90%。妊娠母牛在妊娠30～120 d間感染后可產持續(xù)性感染牛，持續(xù)性感染牛可持續(xù)排毒成為BVDV重要的傳染源，是飼養(yǎng)場無法根除BVDV的重要原因之一。通過檢測并淘汰持續(xù)性感染牛，是逐步實現BVDV凈化的重要手段。

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是黃病毒科（Flaviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）成員，該病毒屬還包括豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和羊邊界病病毒（Border disease virus，BDV）[4]。BVDV基因組為單股正鏈RNA，由5’非翻譯區(qū)（5′UTR）、ORF編碼區(qū)、3’非翻譯區(qū)（3′UTR）組成。BVDV基因組編碼4種結構蛋白和8種非結構蛋白，分布依次為5’-Npro-capsid-Erns-E1-E2-P7-NS2/3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-3’[5]。根據是否引起細胞病變，BVDV可分為兩種生物型：致細胞病變型（Cytopathogenic，CP）和非致細胞病變型（Noncytopathogenic，NCP）[6]；根據BVDV基因序列，BVDV又可分為BVDV-1和BVDV-2兩個基因型。由于BVDV易突變且不同毒株間存在同源重組現象，因此BVDV基因亞型眾多，目前BVDV-1分為1a～1u共21個亞型，BVDV-2分為2a～2d共4個亞型[7]。由于BVDV5’UTR高度保守，常作為靶標用于BVDV抗原的檢測。由于NCP型BVDV不致培養(yǎng)細胞產生細胞病變，其病毒滴度測定常采用間接免疫熒光或者間接免疫過氧化物酶試驗進行，耗時且不方便。熒光定量PCR方法是常用于病原檢測以及定量的方法，且該方法特異性強、敏感性高、可重復性好、簡便省時，可應用于BVDV培養(yǎng)過程中BVDV生長曲線的測定。本研究參考BVDV保守的5’UTR序列，設計引物建立BVDV RT-qPCR方法，為BVDV檢測及培養(yǎng)過程一步生長曲線的測定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞牛病毒性腹瀉病毒BVDV-BJ-2016株、牛副流感病毒3型BPIV3 Beijing株、牛傳染性鼻氣管炎病毒BHV-1 Beijing株均為作者所在實驗室分離鑒定和保存，豬瘟病毒來源于市售弱毒活疫苗。經牛腎細胞（MDBK）傳代培養(yǎng)BVDV，收取培養(yǎng)物-80℃保存?zhèn)溆?。MDBK細胞由作者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒為Axygen產品；PrimeScriptTMRT reagent Kit為TaKaRa公司產品；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購于上海生工生物工程有限公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit購于北京全式金生物技術有限公司；KAPA?SYBR?快速定量PCR試劑盒購于北京普凱瑞生物科技有限公司；7900HT Fast Real-time PCR儀為美國ABI公司產品。.4標準品DNA模板制備按照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒操作說明書，從BVDV-BJ-2016株細胞培養(yǎng)上清中提取RNA。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書將提取的RNA反轉錄為cDNA，以獲得的cDNA為模板進行標準品DNA模板的PCR擴增。標準品DNA模板擴增用引物：上游引物：5’-TAgCCATgCCCTTAgTAggAC-3’；下游引物：5’-ACTCCATgTgCCATgTACAgC-3’，片段大小約298 bp。PCR采用50 μL體系：上、下游引物各1 μL；cDNA模板 3 μL；PCR Mix 25 μL；ddH2O 20 μL。反應條件為：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收預期目的條帶與pMD18-T連接、轉化，獲得重組質粒pMD18T-5’UTR。用紫外分光光度計測定重組質粒的質量濃度，按照公式 copies/μL=（6.02×1023copies/mol）×（濃度g/mL）×10-3/（分子質量g/mol）計算拷貝數計算重組質?？截悢怠?/p>

1.3 引物設計根據GenBank上登錄的BVDV 5’UTR序列的保守序列，應用Primer Express 3.0設計特異性熒光定量RT-PCR引物，上游引物序列：5’-GGGNAGTCGTCARTGGTTCG-3’，下游引物序列：5’-TGTGCCATGTACAGCAGAGYTT-3’，目的片段大小為198 bp。上述引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

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1.5 熒光定量PCR反應條件根據KAPA?SYBR?快速定量PCR試劑盒說明書，熒光定量PCR體系采用20 μL體系。以陽性標準品質粒為模板，采用矩陣法，對熒光定量PCR方法的退火溫度（58、60、62、64℃）進行優(yōu)化，并利用矩陣法對引物（10 μmol/L）使用量（0.4、0.6、0.8、1.0 μL）依次進行優(yōu)化。

1.6 標準曲線的建立將重組質粒標準品進行10倍倍比稀釋，選用 107、106、105、104、103、102、101copies/μL的重組質粒作為標準品為模板，以優(yōu)化的反應條件進行熒光定量PCR檢測，每個濃度標準品做3個重復。以log（拷貝數）為縱坐標、CT值為橫坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸分析。

1.7 敏感性試驗將制備的重組質粒標準品進行10倍梯度稀釋，采用濃度為108、107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL 的標準品為模板 ，應用建立的熒光定量PCR方法進行檢測，確定其敏感性。

1.8 重復性試驗采用濃度為108、107、106copies/μL的標準品質粒為模板進行3批重復性試驗。每批次重復3次以檢驗其批內重復效果。在不同時間對該試驗進行3次重復試驗以檢驗該方法批間重復效果。

1.9 特異性試驗應用建立的熒光定量PCR方法對BVDV-BJ-2016株、BPIV3 Beijing株、BHV-1 Beijing株以及CSFV的cDNA或DNA進行檢測以評價所建立方法的特異性。

1.10 BVDV一步生長曲線測定將BVDV病毒液（BVDV-BJ-2016株）稀釋1 000倍后接種MDBK細胞，在接毒后 2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h分別收集細胞培養(yǎng)上清1 mL，用于RNA的提取。RNA提取參照AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量提取試劑盒說明書進行。提取的RNA用Nano Drop 2000測定質量濃度后，取1 μg RNA進行反轉錄，獲得cDNA。取1 μL cDNA用本研究中所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法進行檢測，確定培養(yǎng)上清中BVDV基因組拷貝數的變化。根據所建立的標準曲線以及Ct值計算每毫升病毒液中所含BVDV基因組拷貝數，并以l g（copies/mL）為縱坐標、時間為橫坐標繪制BVDV一步生長曲線。

2 結果與分析

2.1 BVDV 5’UTR RT-PCR擴增結果以提取的BVDV-BJ-2016株cDNA為模板，采用BVDV 5’UTR的特異性引物進行RT-PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段約298 bp，符合預期目的條帶大小。回收目的條帶，連接于pMD18-T載體，以構建陽性模板。將鑒定為陽性的重組載體命名為pMD-5’UTR。

2.2 熒光定量PCR方法條件優(yōu)化根據KAPA?SYBR?快速定量PCR試劑盒說明書確定反應體系為20 μL，經過優(yōu)化最終確定為qPCR Mix 10 μL，上、下游引物（10 μm/L）0.6 μL，Rox 0.4 μL，模板 1 μL，ddH2O補至20 μL。經過對反應條件的優(yōu)化，最終確定該方法最佳的反應條件為：95℃預變性1 min；95℃變性15 s，60℃退火30 s（收集熒光），共計40個循環(huán)。

2.3 標準曲線的建立將重組質粒pMD-5’UTR經10 倍梯度稀釋，分別以 107、106、105、104、103、102、101copies/μL的重組質粒作為標準品模板，進行熒光定量PCR檢測獲得擴增曲線（見圖1B）。以起始模板濃度的對數為橫坐標、Ct值為縱坐標繪制標準曲線。通過熔解曲線分析（見圖1A），可見標準樣品均出現了單一的峰，表明該方法為特異性擴增。標準曲線方程為y=-3.5197+40.4431，相關系數R2=0.9973，各濃度標準品間具有良好的線性關系。

圖1 BVDV RT-qPCR標準曲線Fig.1Standard curve of BVDV RT-qPCR

2.4 敏感性試驗 分別以107、106、105、104、103、102、101、100copies/μL的重組質粒作為標準品模板利用所建立的熒光定量PCR方法進行檢測，檢測結果均呈現典型的S型曲線（圖2）。該建立的方法最低檢測限為10.0 copies/μL。

圖2 BVDV RT-qPCR方法敏感性試驗結果Fig.2Result of sensitivity test of BVDV RT-qPCR

2.5 特異性試驗利用建立的SYBR Green熒光定量PCR方法對BVDV、BPIV3、BHV-1、CSFV的核酸進行檢測，結果顯示BVDV和CSFV樣品為陽性，其他病毒樣品均為陰性。該結果表明，豬瘟病毒對本研究中所建立的RT-qPCR方法存在干擾（圖3），即所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法不能夠區(qū)別鑒定BVDV與豬瘟病毒，這可能由于BVDV與豬瘟病毒同屬瘟病毒屬，而在瘟病毒屬成員中基因組5’非編碼序列相對保守。特異性試驗結果顯示，所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法雖不能特異性地鑒別BVDV與豬瘟病毒，但其與牛副流感病毒3型、牛傳染性鼻氣管炎病毒并不存在交叉反應，可應用于瘟病毒與其他不同病毒的診斷中。

2.6 重復性試驗選取濃度為108、107、106copies/μL的標準品質粒為模板，分別進行3批批內和批間重復試驗以評價所建立SYBR Green熒光定量PCR方法的重復性。結果顯示，所建立的熒光定量PCR方法的批內和批間重復試驗的變異系數均小于5%，說明所建立SYBR Green熒光定量PCR方法具有良好的重復性。

圖3 BVDV RT-qPCR特異性試驗Fig.3Specificity test of BVDV RT-qPCR

2.7 BVDV一步生長曲線的測定在BVDV接種MDBK細胞后，收取接毒后2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h的細胞培養(yǎng)上清。收取上清用所建立的RT-qPCR方法進行檢測，獲得Ct值，將Ct值代入標準方程后計算拷貝數。以拷貝數的對數為縱坐標，以樣品收集時間為橫坐標繪制BVDV一步生長曲線（圖4）。BVDV一步生長曲線顯示，在接毒后12～48 h間為BVDV對數生長期。在接毒48 h以后，BVDV基本處于穩(wěn)定期。從繪制的BVDV一步生長曲線提供的參考，BVDV在接毒后72～84 h間收獲病毒即可。

3 討論

牛病毒性腹瀉病毒感染是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病，開發(fā)檢測和診斷牛病毒性腹瀉的快速診斷技術對牛病毒性腹瀉的防控及凈化、推動養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展具有重要的意義。為了預防與控制牛病毒性腹瀉病毒感染，科研人員建立了諸多分子生物學診斷方法。應用地高辛、生物素等標記物標記核酸探針，建立核酸雜交檢測方法，快速、簡便、經濟地檢測BVDV[8]。白泉陽等[10]、宋爽等[11]針對BVDV保守的5’UTR設計引物和探針，建立Taqman熒光定量PCR方法，方便、快速地檢測BVDV，該方法敏感度高、重復性好。

表1 BVDV RT-qPCR重復試驗結果Table 1Inter-assay and intra-assay reproducibility test of the RT-qPCR

圖 4 BVDV在MDBK細胞上一步生長曲線Fig.4 One-step growth curve of BVDV in MDBK cells

熒光定量PCR方法具有操作簡便、特異性高、敏感性高、重復性好、可實時定量等特點。實時熒光定量PCR包括探針法和染料法，其中染料法相對探針法價格更低。目前熒光定量PCR已經成為實驗室快速檢測和診斷病原的重要手段[12]。對于非致細胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細胞上不產生細胞病變，通過間接免疫熒光試驗或間接免疫過氧化物酶試驗測定接毒后不同時間點收獲病毒的TCID50，進而繪制非致細胞病變型牛病毒性腹瀉病毒在培養(yǎng)細胞上的生長動力學曲線，此種測定方法耗力費時。而應用熒光定量PCR方法可快速定量地對病毒基因組進行檢測，因此本試驗將熒光定量PCR方法應用于BVDV一步生長曲線的繪制中。

為了實現測定BVDV NCP型一步生長曲線，本試驗根據牛病毒性腹瀉病毒5’UTR保守序列設計熒光定量PCR引物，建立了檢測牛病毒性腹瀉病毒的SYBR Green熒光定量PCR方法并將該方法應用于BVDV一步生長曲線的測定中。研究中所建立的SYBR Green熒光定量PCR方法具有良好的重復性和敏感性，但其存在不能特異性鑒別BVDV與豬瘟病毒的缺陷。這一缺陷，可根據瘟病毒屬成員5’UTR序列中的差異序列區(qū)設計特異性的探針，以改善熒光定量PCR方法的特異性。該方法的建立和應用，為研究非致細胞病變型BVDV分離毒株的生長特性的研究提供了一定的參考。