劉君雯,劉天明,李敬雙,于鳳梅,段權(quán)倩,張 楊,吳 瓊,李 敏
(錦州醫(yī)科大學,遼寧 錦州 121001)
淫羊藿,又稱仙靈脾,為小檗科植物淫羊藿的全草,具有增強機體免疫力、延緩衰老等作用。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分,屬于黃酮類化合物[1],在藥典的記載中,淫羊藿苷不僅具有降血壓、補腎壯陽、祛風除濕等作用,而且對腰部和膝蓋無力以及中年健忘也有一定的治療作用。近年來,淫羊藿苷的免疫調(diào)節(jié)作用在人類醫(yī)學上研究較多,其中調(diào)節(jié)細胞信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用已成為研究熱點之一,在保健品領(lǐng)域也已經(jīng)有了很廣泛的應用[2]。然而,淫羊藿苷在動物醫(yī)學研究中的應用卻很少,淫羊藿在我國分布廣泛,將淫羊藿苷做為飼料添加劑會有很好的應用前景。本研究通過體外分離小鼠腹腔巨噬細胞和脾淋巴細胞,檢測淫羊藿苷對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能和脾淋巴細胞增殖以及對小鼠脾淋巴細胞分泌細胞因子的影響,探討淫羊藿苷對小鼠巨噬細胞和淋巴細胞的免疫功能的調(diào)節(jié)作用,為淫羊藿苷的開發(fā)和利用提供試驗依據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 試驗動物8周齡,體重為20±2 g,SPF級Balb/c小鼠,由錦州醫(yī)科大學提供。
1.1.2 試驗菌株 金黃色葡萄球菌(菌種號:AB91093),購自中國微生物研究院。
1.1.3 藥品和主要試劑 淫羊藿苷標準品成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品,左旋咪唑廣東華南藥業(yè)集團有限公司產(chǎn)品,新生牛血清、臺盼藍、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、RPMI-1640培養(yǎng)基和二甲基亞砜(DMSO)Solarbio公司產(chǎn)品,IL-2、IL-4、IL-10和IL-12試劑盒博士德公司產(chǎn)品,營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 淫羊藿苷試劑的制備 稱取淫羊藿苷標準品10 mg,溶于1.0 mL DMSO中,搖勻至全部溶解,加入10 mL RPMI-1640培養(yǎng)液進行稀釋,將上述液體吸取10 μL與10 mL RPMI-1640培養(yǎng)液混勻,按照此方法得到了淫羊藿苷藥液母液,其終濃度為1.0 μg/mL,0.22 μm濾膜過濾除菌,4℃保存。試驗時所需要的淫羊藿苷濃度用RPMI-1640培養(yǎng)液進行稀釋。
1.2.2 腹腔巨噬細胞懸液制備 小鼠頸椎脫臼法處死,浸泡于75%酒精消毒約3 min,用5 mL注射器抽取3 mL RPMI-1640培養(yǎng)基注入腹腔內(nèi),輕揉拍打腹部3 min后,用注射器抽取腹腔內(nèi)培養(yǎng)基于離心管中,1 500 r/min離心5 min,棄上清,重復上述操作2次。吹勻后靜置5 min,1 000 r/min離心5 min,棄上清,重復1次。將細胞沉淀用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸起,臺盼藍染色,細胞計數(shù)板計數(shù),活細胞數(shù)達到95%以上,調(diào)整細胞密度為5×106個/mL[3-4]。
1.2.3 脾淋巴細胞懸液制備 小鼠頸椎脫臼法處死,浸泡于75%酒精消毒約3 min,在超凈臺內(nèi)剪開小鼠腹壁,取出脾置于盛有磷酸鹽緩沖(PBS)的培養(yǎng)皿中,反復沖洗2次后置于RPMI-1640培養(yǎng)基中,用5 mL注射器抽取培養(yǎng)基吹打,重復上述操作直至脾被膜透明。將細胞懸液收集于離心管中,1 500 r/min離心5 min,棄上清,加入3 mL Tris-NH4Cl,吹勻,靜置5 min,離心,重復上述操作直至紅細胞全部裂解。細胞沉淀用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸起,臺盼藍染色,細胞計數(shù)板計數(shù),活細胞數(shù)達到95%以上。調(diào)整細胞密度為5×106個/mL,制成脾淋巴細胞懸液[5-7]。
1.2.4 淫羊藿苷對巨噬細胞吞噬功能的影響96孔細胞培養(yǎng)板,每孔加入100 μL巨噬細胞懸液,設(shè)空白對照組、陽性對照組及淫羊藿苷組,每組均設(shè)5復孔。空白對照組每孔加100 μL RPMI-1640完全培養(yǎng)基,陽性對照組每孔加100 μL左旋咪唑溶液(終濃度為5 μg/mL),淫羊藿苷不同濃度組每孔分別加入100 μL含不同濃度的淫羊藿苷(使其終濃度分別為1.5、3、6和12 μmol/L)溶液。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入50 μL金黃色葡萄球菌懸液。繼續(xù)培養(yǎng)9 h,每孔加20 μL MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,1 800 r/min離心10 min,棄上清,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min直至形成紫色溶液,酶標儀于570 nm波長處檢測OD值[8]。
1.2.5 淫羊藿苷對淋巴細胞增殖的影響 按照上述方法制備淫羊藿苷誘導的脾淋巴細胞,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35 h,每孔再加入50 μL金黃色葡萄球菌懸液。培養(yǎng)9 h,每孔再加入20 μL MTT,振蕩混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,1 500 r/min 4℃離心10 min,棄上清。每孔分別加入150 μL DMSO液,酶標儀檢測570 nm處OD值。結(jié)果應用公式計算:刺激指數(shù)SI=藥物刺激孔OD值/空白對照孔OD值[9]。
1.2.6 淫羊藿苷對淋巴細胞分泌細胞因子的影響 用24孔培養(yǎng)板制備淫羊藿苷誘導的脾淋巴細胞,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 h后1 500 r/min離心5 min,收集上清于試管中。按ELISA試劑盒說明書操作測定分泌液中IL-2、IL-4、IL-10和IL-12濃度[10-11]。
1.2.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示,用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行一維方差分析,P<0.05表示組間差異顯著,P<0.01表示組間差異極顯著。
2.1 淫羊藿苷對巨噬細胞吞噬功能的影響 如表1所示,淫羊藿苷各劑量組和陽性對照組巨噬細胞的OD值均極顯著高于空白對照組(P<0.01),淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組巨噬細胞的OD值與陽性對照組相比無明顯差異(P>0.05),表明淫羊藿苷能增強巨噬細胞的吞噬能力。淫羊藿苷各劑量組之間進行比較,3 μmol/L劑量組巨噬細胞的OD值顯著高于1.5 μmol/L劑量組(P<0.05),極顯著高于6 μmol/L和12 μmol/L劑量組(P<0.01),表明淫羊藿苷對巨噬細胞的吞噬功能呈雙重調(diào)節(jié)作用,3 μmol/L劑量組效果較佳。
Table 1Effect of icariin on macrophages phagocytic表1淫羊藿苷對巨噬細胞吞噬功能的影響
2.2 淫羊藿苷對淋巴細胞增殖的影響 如表2所示,淫羊藿苷各劑量組和陽性對照組淋巴細胞的刺激指數(shù)均極顯著高于空白對照組(P<0.01),淫羊藿苷為1.5、3和6 μmol/L劑量組淋巴細胞的刺激指數(shù)與陽性對照組相比無明顯差異(P>0.05),表明淫羊藿苷能夠刺激淋巴細胞的增殖。淫羊藿苷各劑量組之間進行比較,3 μmol/L劑量組淋巴細胞的刺激指數(shù)與1.5 μmol/L和6 μmol/L劑量組相比無明顯差異(P>0.05),但顯著高于12 μmol/L劑量組(P<0.05),表明淫羊藿苷對刺激淋巴細胞的增殖呈雙重調(diào)節(jié)作用,淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組效果較佳。
表2 淫羊藿苷對淋巴細胞增殖的影響Table 2Effect of icariin on lymphocyte proliferation
2.3 淫羊藿苷對淋巴細胞分泌細胞因子的影響ELISA法測定淫羊藿苷對淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌的影響,結(jié)果如表3所示。淫羊藿苷各劑量組和陽性對照組各細胞因子的分泌水平均極顯著高于空白對照組(P<0.01),淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組淋巴細胞IL-2、IL-4和IL-12的分泌與陽性對照組相比無明顯差異(P>0.05),淫羊藿苷為1.5 μmol/L和3 μmol/L劑量組淋巴細胞IL-10的分泌與陽性對照組相比無明顯差異(P>0.05),表明淫羊藿苷能夠刺激淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌。淫羊藿苷各劑量組之間進行比較,3 μmol/L劑量組IL-2分泌顯著高于1.5 μmol/L劑量組(P<0.05),極顯著高于6 μmol/L和12 μmol/L劑量組(P<0.01);該組IL-4和IL-12的分泌水平也均極顯著高于其他劑量組(P<0.01);但IL-10的分泌水平雖稍高于其他劑量組,但無明顯差異(P>0.05)。表明淫羊藿苷對刺激淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌呈雙重調(diào)節(jié)作用,淫羊藿苷為3 μmol/L劑量組效果較佳。
淋巴細胞增殖、巨噬細胞的吞噬以及細胞因子的分泌是評價細胞免疫功能的重要指標。李書桐等[12]研究了淫羊藿苷對小鼠腹腔巨噬細胞功能的影響,結(jié)果顯示淫羊藿苷能增強巨噬細胞吞噬中性紅的功能。對巨噬細胞吞噬功能的研究,多數(shù)都利用中性紅,本研究顯示淫羊藿苷能夠提高腹腔巨噬細胞的吞噬金黃色葡萄球菌能力,表明淫羊藿苷增強了機體對于外來病原體的固有免疫反應能力,此類報導甚少。Zhao L M等[13]通過觀察淫羊藿苷對化療后小鼠免疫細胞的影響,結(jié)果淫羊藿苷能夠增強淋巴細胞的增殖能力、增強巨噬細胞的吞噬能力。潘曉明[14]研究了淫羊藿苷對免疫細胞及免疫系統(tǒng)的影響,結(jié)果淫羊藿苷能夠促進IL-12的產(chǎn)生。肖幸豐等[15]的研究表明淫羊藿苷能夠促進Con A誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖以及IL-2的生成。本研究結(jié)果顯示淫羊藿苷能夠提高腹腔巨噬細胞的吞噬功能,促進脾淋巴細胞增殖,刺激淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的分泌。與已報道的試驗結(jié)果一致,提示淫羊藿苷可能通過激活靜止的T細胞和巨噬細胞,使其活化,增強巨噬細胞的吞噬功能,增強淋巴細胞分化增殖產(chǎn)生細胞因子,從而發(fā)揮免疫增強的作用。
Table 3 Effect of icariin on cytokines secreted by lymphocyte表3 淫羊藿苷對淋巴細胞分泌細胞因子的影響