許哲昊，后世翔，陳春燕，秦志強(qiáng)，王 坤，章 成，周蘭蘭

缺血性腦病是世界范圍各個(gè)人群中都存在的一種疾病，也是臨床上最為常見的能夠引起患者死亡的疾病，其發(fā)病后死亡率和致殘率很高，這些均是缺血性腦病的顯著特點(diǎn)，除此之外，缺血性腦病能夠?qū)颊叩纳踩斐蓸O其嚴(yán)重的危害，并給社會(huì)及患者家庭帶來沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，深入了解其發(fā)病機(jī)制，進(jìn)行藥物干預(yù)極為重要[1-2]。

安菲博肽(anfibatide，ANF)是一種多肽，上世紀(jì)90年代初從蛇毒中提取分離，具有顯著的抗血小板黏附、聚集的效果，ANF作為血小板膜糖蛋白(glycoprotein，GP)Ib的受體阻斷劑，是世界上第一種以GPIb為靶點(diǎn)的抗血栓的藥物。前期研究[3]顯示ANF可以顯著降低缺血性腦損傷小鼠的腦梗死體積且具有保護(hù)大腦的功能，該文在前期研究基礎(chǔ)上觀察ANF對(duì)小鼠缺血性腦損傷保護(hù)作用及其抗血小板活化作用機(jī)制，為ANF進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器ANF購自合肥兆科藥業(yè)有限公司，生理鹽水配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，批號(hào)：20150924；鹽酸替羅非班氯化鈉注射液購自武漢遠(yuǎn)大制藥集團(tuán)，5 mg/100 ml，批號(hào)：151008；鼠抗vWF單克隆抗體購自美國SANTA公司，批號(hào)：T7505；兔抗GPIba多克隆抗體購自英國biorbyt公司，批號(hào)：A2319；CY3山羊抗鼠LgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：990796；FITC標(biāo)記山羊抗兔LgG、免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：122319A、13152A06；小鼠P選擇素、β-TG ELISA檢測(cè)試劑盒購自美國R&D公司，批號(hào)：E202012M、E92163M；DMI-6000型激光共聚焦熒光顯微鏡、RM2135 型石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司；BM-Ⅱ型病理組織包埋機(jī)、QP-B1 型切片漂烘溫控儀購自安徽電子科學(xué)研究所。

1.2小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(transientmiddlecerebralarteryocclusion，tMCAO)致局灶性腦缺血模型制備及分組給藥雄性昆明種小鼠50只、SPF級(jí)、6～8周、體質(zhì)量18～22克，隨機(jī)分為5組。使用改良 Zea Longa法[4]制備小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型。腹腔注射濃度為7%的水合氯醛(350 mg/ kg)使小鼠麻醉，待小鼠癱軟翻正反射消失后將小鼠固定于鼠板，之后在頸部正中處做一縱向切口，大約為1 cm左右。然后緩慢將小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈從肌肉組織中鈍性分離，使其暴露在視野下，之后用3-0手術(shù)線結(jié)扎頸總和頸外動(dòng)脈，在頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口，使用的線栓為細(xì)尼龍線(?0.128或0.148 mm)，插入頭端用蠟灼圓并蘸取多聚賴氨酸，尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈長(zhǎng)度距分叉處約9～10 mm，結(jié)扎絲線。在小鼠頸部切口處滴加少量抗生素，然后縫合切口，最后進(jìn)行消毒皮膚。待小鼠缺血90 min后拔出絲線，從而使血流再灌。手術(shù)過程使用保溫毯維持小鼠體溫在37 ℃ 左右，假手術(shù)組小鼠不做血管結(jié)扎和阻塞外，其余均與各組相同，整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間控制在15 min內(nèi)為宜。雄性昆明鼠，分為假手術(shù)組(Sham)、模型組、ANF組(4、2和1 μg/kg)和陽性藥替羅非班(TRF)組(0.5 mg/kg)。各用藥組分別于缺血90 min再灌注1 h后給藥，注射量為10 ml/kg。

1.3ELISA法檢測(cè)小鼠血清血小板球蛋白(β-thromboglobulin，β-TG)和P-選擇素含量在小鼠腦缺血再灌注24 h后，眼眶取血，在4 ℃環(huán)境下靜置1 h，3 000 r/min 離心10 min，取上清液，-80 ℃保存待測(cè)。隨即采用ELISA法測(cè)定，首先向預(yù)先包被P-選擇素和β-TG抗體的包被微孔中，分別加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，溫育并徹底洗滌。

1.4免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠缺血腦組織血管性假血友病因子(vonwillebrandfactor，vWF)表達(dá)待小鼠腦組織缺血再灌注24 h后，取出小鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)使其麻醉，待小鼠翻正反射消失后，固定在鼠板上，剪開小鼠胸腔使其暴露心臟，確保其心臟保持搏動(dòng)，先后用事先預(yù)冷的生理鹽水和濃度為4%的多聚甲醛灌注，待全身發(fā)白身體僵硬后，取腦，依次用4%多聚甲醛和30%蔗糖水溶液固定。然后制備石蠟切片，采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素法染色法染色，具體操作步驟按試劑說明書進(jìn)行。結(jié)果分析：每組5只動(dòng)物，每張切片選取5個(gè)高倍視野，顯微鏡下觀察切片vWF表達(dá)，采用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖片分析軟件測(cè)量免疫陽性產(chǎn)物平均光密度值。

1.5免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)小鼠缺血腦組織vWF和GPIbα表達(dá)組織取材方法同上，待腦組織取出后，取缺血腦半球，進(jìn)行冰凍切片。每只小鼠取10張制備完成的切片，置于冷丙酮中固定15 min。具體免疫熒光雙染操作按說明書進(jìn)行。免疫熒光雙染完成后，將制作完成的切片在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍攝照片，采用Image-Pro Plus 6.0專業(yè)圖片分析軟件分別計(jì)算vWF和GPIbα的平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1ANF對(duì)急性局灶性腦缺血小鼠血清β-TG和可溶性P-選擇素含量的影響與Sham組比較，缺血再灌注24 h后模型組tMCAO小鼠血清中可溶性β-TG和P-選擇素濃度顯著升高(F=10.32、18.79，P<0.01)，同時(shí)，相對(duì)于模型組，ANF 4 μg/kg和2 μg/kg組tMCAO小鼠血清β-TG和可溶性P-選擇素濃度顯著下降(P<0.01)；而與模型組比較，TRF組tMCAO小鼠血清β-TG和可溶性P-選擇素濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1A、1B。

圖1 ANF對(duì)急性局灶性腦缺血小鼠血清β-TG和P-選擇素含量的影響

A：β-TG；B:P-選擇素；與Sham組比較：##P<0.01；與模型組比較：**P<0.01

2.2ANF對(duì)急性局灶性腦缺血小鼠腦組織vWF表達(dá)豐度的影響Sham組小鼠的正常腦組織中vWF表達(dá)豐度較低，而模型組tMCAO中小鼠缺血側(cè)組織vWF表達(dá)豐度較Sham組明顯增高，vWF陽性細(xì)胞主要表達(dá)在腦組織缺血區(qū)域的微血管壁上，切片染色呈棕色顆粒狀。與Sham組比較，模型組tMCAO小鼠缺血側(cè)腦組織vWF陽性細(xì)胞表達(dá)平均光密度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.042，P<0.01)。與模型組比較，ANF 4 μg/kg和2 μg/kg組tMCOA小鼠腦組織中vWF表達(dá)豐度均有下調(diào)，平均光密度值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TRF組tMCAO小鼠腦組織vWF表達(dá)豐度未見降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

A：Sham組；B：模型組；C：ANF 4 μg/kg組；D：ANF 2 μg/kg 組；E：ANF 1 μg/kg組；F：TRF組；G：vWF表達(dá)豐度；紅色箭頭標(biāo)示處為vWF陽性顆粒；與Sham組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3ANF對(duì)急性局灶性腦缺血小鼠腦血管GPIbα和vWF表達(dá)的影響采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)，F(xiàn)ITC(fluorescein isothiocyanate)，即異硫氰酸熒光素，其陽性反應(yīng)在熒光顯微鏡下呈綠色，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗與GPIbα反應(yīng)，顯示GPIbα表達(dá)。CY3陽性反應(yīng)在熒光顯微鏡下呈紅色，CY3標(biāo)記的山羊抗鼠二抗與vWF反應(yīng)，顯示vWF表達(dá)。將兩者組合(Merged)，在熒光顯微鏡下呈黃色，表示兩者在微血管壁上表達(dá)的分布情況。模型組小鼠腦組織GPIba和vWF表清晰達(dá)，切片染色主要位于腦組織缺血半球，分別呈綠色和紅色，GPIba和vWF主要表達(dá)在腦組織缺血區(qū)域的微血管壁上。與Sham組比較，模型組小鼠腦組織vWF和GPIbα的表達(dá)豐度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.930、5.895，P<0.01)。與模型組比較，ANF 4 μg/kg和2 μg/kg可使tMCAO小鼠缺血側(cè)腦組織微血管壁GPIbα和vWF的表達(dá)豐度顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TRF組雖也可使小鼠腦組織vWF和GPIbα的表達(dá)豐度有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的機(jī)制還不是很明確，目前公認(rèn)的引起缺血再灌注損傷的學(xué)說有能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡、氧自由基損傷等[5-6]。腦缺血再灌注損傷是由各種因素共同作用的結(jié)果，前期研究[3]證實(shí)急性tMCAO小鼠體內(nèi)凝血系統(tǒng)被激活，血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，缺血側(cè)腦組織極易發(fā)生二次血栓形成，二次血栓形成后加重腦內(nèi)循環(huán)障礙從而再次損傷腦組織。當(dāng)腦缺血組織恢復(fù)血液灌注時(shí)，會(huì)造成腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損，血小板的活化程度會(huì)明顯提高，活化血小板與血管內(nèi)皮、粒細(xì)胞相互作用形成血栓，從而造成急性腦梗死，這一系列過程在急性腦梗進(jìn)程中非常重要。

腦組織血管內(nèi)皮細(xì)胞及活化血小板顆粒釋放大量?jī)?nèi)容物及膜糖蛋白入血，在組織損傷中是識(shí)別血小板活化的重要指標(biāo)[7]。GPIb是存在于血小板膜上的一種糖蛋白，能夠在血小板活化、血栓形成早期介導(dǎo)血小板黏附、聚集，是vWF和凝血酶受體。胞黏附分子P-選擇素(granular membrane protein 140，GMP140)由血小板α顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞釋放，能夠誘導(dǎo)血小板的活化，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面上粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的滾動(dòng)及其與血小板的黏附，GMP140與血栓形成密切相關(guān)。β- TG是血小板α顆粒分泌的血小板特異性球蛋白，血小板活化時(shí)β- TG被大量釋放進(jìn)入血液中，其參與凝血、免疫應(yīng)答反應(yīng)、炎癥趨化及組織修復(fù)等重要生理病理過程，并可進(jìn)一步加重血管內(nèi)皮的損傷[8]。研究[9]表明，特定的血小板糖蛋白成分及顆粒釋放物的量的改變不僅僅是血小板活化的標(biāo)志性指標(biāo)，而且也是卒中后死亡率的預(yù)測(cè)因子。加強(qiáng)對(duì)血小板活化分子標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)對(duì)血管栓塞的預(yù)防有著極其重要的作用，同時(shí)也為缺血性腦病使用抗血小板藥物進(jìn)行防治提供了基礎(chǔ)。

圖3 ANF對(duì)急性局灶性腦缺血小鼠缺血側(cè)腦血管GPIbα和vWF表達(dá)的影響 免疫熒光×400

A：腦血管GPIbα平均熒光強(qiáng)度；B：腦血管vWF平均熒光強(qiáng)度；與Sham組比較：##P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01

ANF是九十年代初從蛇毒中分離得到的一種多肽，其相對(duì)分子質(zhì)量為29 799.7，其分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，包含α、β兩個(gè)亞基，是全世界范圍內(nèi)第一個(gè)以GPIb為作用靶點(diǎn)的并在臨床研究中的抗血栓藥物。ANF已在世界上好幾個(gè)國家完成臨床試驗(yàn)，擬用于治療心肌梗死，且具有良好的安全性。前期研究[3]顯示，ANF對(duì)缺血再灌注小鼠腦組織具有保護(hù)作用，能夠降低腦損傷，改善損傷腦組織功能。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， ANF(4、 2 μg/ kg)可以顯著下調(diào) tMCAO小鼠缺血區(qū)過度增高的腦血管 GPIbα和 vWF的表達(dá)豐度，降低血循環(huán)中血小板活化特異性標(biāo)志性可溶性 P-選擇素和β-TG的濃度。 進(jìn)一步分析其機(jī)制， ANF作為 GPIb受體拮抗劑，可抑制血小板的過度活化，降低腦血管 GPIbα和 vWF的表達(dá)豐度，減少可溶性 P-選擇素和β-TG的過度釋放，進(jìn)而阻斷 GPIb- vWF途徑，保護(hù)內(nèi)皮血管細(xì)胞，防止血栓形成，保持腦微血管的暢通及血液灌注，從而降低缺血再灌注后小鼠的腦損傷，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。