鄧 思，王海琪，白曼利，楊遠帆,2,3,4，黃高凌,2,3,4，杜希萍,2,3,4，倪 輝,2,3,4

(1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021； 3.廈門市食品與生物工程技術研究中心，福建 廈門 361021； 4.廈門南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

法夫酵母(Phaffiarhodozyma)是一種能利用多種碳源和氮源進行異養(yǎng)代謝合成各種類胡蘿卜素的紅色酵母，其中的類胡蘿卜素包含蝦青素[1-3]、β-胡蘿卜素[4-5]、海膽酮、玉米黃質、β-隱黃質、番茄紅素[6]及斑蝥黃等[7]。由于法夫酵母代謝合成類胡蘿卜素時不受氣候和地域等因素的影響，因而它具有生長快、高密度培養(yǎng)容易、蝦青素積累迅速且活性強等特點，是一類極具產業(yè)化發(fā)展前景的天然蝦青素資源。

肝損傷是一種急性肝臟功能異常的疾病[8]，它是由肝缺血再灌注、有毒物質、肝毒性藥物以及病毒感染等因素導致的。一般情況下，造成機體肝硬化、肝癌的主要因素是肝纖維化的產生[9]，而肝纖維化一般是由持續(xù)長時間的肝損傷誘發(fā)的[10-11]。一般在臨床上，防止和預防肝損傷是肝病治療不可或缺的防御環(huán)節(jié)，早期及時發(fā)現(xiàn)和對癥治療均對預防肝病意義重大[12]。

肝損傷一般分為化學性肝損傷和病理性肝損傷兩類[13]，其中臨床上最為常見的是化學性肝損傷。而實驗中常用CCl4、酒精等使肝臟中毒，形成化學性肝損傷的模型[14-15]。CCl4對肝臟的毒性存在多種作用機制，其中導致機體產生過量自由基被認為是肝損傷發(fā)生的主導因素[16]。過量的自由基不僅攻擊肝細胞膜上的磷脂分子，損傷細胞膜的完整性，而且可引起肝細胞脂質過氧化，誘發(fā)細胞死亡。同時，自由基也可與肝細胞內大分子發(fā)生共價結合，攻擊膜不飽和脂質，細胞膜的穩(wěn)定性被破壞以及通透程度加大，丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)等從細胞質中大量溢出進入血液中。因此，評價肝損傷的指標可轉化為測定血清中ALT和AST的活性。相關研究表明[17-18]，多種廣泛使用且效果穩(wěn)定的藥物如維生素E、褪黑素、乙酰半胱氨酸等都可以通過清除自由基或者抑制自由基的產生起到減弱肝損傷的功能。

如今，隨著化學性肝損傷病人的增加，研發(fā)對化學性肝損傷具有保護作用的保健食品已成為研究熱點之一。而類胡蘿卜素不僅具有較強的清除自由基和淬滅活性氧的能力[19]，而且能有效防止脂質過氧化[20-21]。因此，本文采用溶劑浸提法提取法夫酵母類胡蘿卜素，通過建立CCl4誘導大鼠化學性肝損傷模型，檢測大鼠血清中ALT、AST活性，并觀察肝臟細胞的病理損傷情況，研究其對化學性肝損傷的作用，為保護化學性肝損傷的天然保健食品的研發(fā)提供技術支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

從廣東省購買60只SPF級的雄性SD大鼠(批準號SCXK(粵)2013-0002)，且這60只大鼠的體質量均在160～180 g。將60只大鼠進行4 d的檢疫，選定健康的大鼠進行實驗。每天定期檢查大鼠1次，除去不健康的大鼠，如此往復，將檢疫后最終健康的大鼠進行正式實驗。進行實驗之前，使用飽和苦味酸對60只大鼠進行編號，其中大鼠的不同部位也同樣需要染色編號處理，這兩種處理就組成了60只大鼠的雙重識別標記。采用一箱5只大鼠的分配方式將60只大鼠進行分組群養(yǎng)，對所有的大鼠均使用晝夜時間比為10 h∶14 h的方式進行間斷照明處理。在實驗過程中，按照要求對60只大鼠均喂以相應的顆粒飼料，允許它們在飼養(yǎng)期間自由進食飲水。為了確保最終實驗結果的可靠性，在飼養(yǎng)過程中，保證了環(huán)境相對穩(wěn)定。

1.1.2 蝦青素標準品

蝦青素標準品 (100%，United States Pharmacopeia Reference Standard (USP))購置于美國Sigma公司。

1.1.3 主要試劑

玉米油購于益海糧油工業(yè)有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸試劑購于廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司；CCl4購于廣州市中南化學試劑有限公司；橄欖油購于上海凌峰化學試劑有限公司；烏拉坦購于國藥集團化學試劑有限公司；ALT和AST試劑盒均購于上?？迫A生物工程股份有限公司，批號分別為20151222和20151122。

1.2 主要儀器與設備

BS-3000A電子天平，上海友聲衡器有限公司；CS-VI型攤片烤片機，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；RM2235型輪轉切片機、ASP300S型全自動脫水機、EG1150型生物組織包埋機、AutoStainer-XL型自動染色機均為德國LEICA?。

1.3 方法

1.3.1 類胡蘿卜素提取物的制備

稱取10 g法夫酵母菌體(廈門匯盛生物有限公司提供)于500 mL離心杯中，向離心杯中加入6 mol/L的乳酸溶液200 mL，用玻璃棒將其攪拌均勻，于30 ℃的水浴條件下進行破壁處理10 min。恒溫水浴結束后，4 500 r/min離心10 min。離心后除掉上層粘稠的乳酸溶液，將200 mL蒸餾水加入離心杯中，用玻璃棒攪拌均勻。將加入蒸餾水的菌體液再次4 500 r/min進行離心10 min。離心后除掉上層液體，用蒸餾水反復進行以上操作3次。將200 mL丙酮加入離心杯底剩余的菌體中，用玻璃棒攪拌均勻，在常溫下浸提5 min。浸提結束后，4 500 r/min離心10 min。收集離心后的上清液，在旋轉蒸發(fā)器上濃縮上清液，對浸提液丙酮進行回收，最終得到的類胡蘿卜素浸膏即為試驗的受試物。

1.3.2 類胡蘿卜素提取物成分的分析

表1 ZORBAX SB-C18色譜柱的梯度洗脫條件Tab.1 The gradient elution conditions of ZORBAX SB-C18 columns時間Time/minφ(超純水Ultra-pure water)/%(A泵)φ(甲醇Methanol)/%(B泵)01585400100580100661585

采用高壓液相色譜法(high perfor- mance liquid chromatography,HPLC)對類胡蘿卜素提取物中的成分進行分析。由超純水(A泵)及甲醇(B泵)組成高效液相色譜的溶劑系統(tǒng)，用ZORBAX SB-C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，3.5 μm)對樣品進行梯度洗脫，洗脫條件如表1所示。檢測波長為474 nm，進樣量為5 μL，柱溫為35 ℃，流速為0.2 mL/min。

1.3.3 大鼠分組和處理

將實驗室檢疫合格后的大鼠按照質量隨機分成6組，每組10只，分別為正常組，模型組，聯(lián)苯雙酯組，低、中、高劑量組。用玉米油將受試物稀釋至75.0,37.50,18.75 g/L 后分別用于高、中、低3個劑量組對大鼠進行灌胃處理，以上實驗的灌胃劑量分別相當于人體臨床用量的10倍、5倍、2.5倍(受試樣品的急性經口毒性為LD50>15 g/kg，人體臨床用量約為0.075 g·kg-1·d-1)。正常組和模型組大鼠每日經口灌胃相同量的玉米油，聯(lián)苯雙酯組則每日經口灌胃劑量質量濃度為15 g/L的聯(lián)苯雙酯滴丸。調節(jié)藥物濃度，采用10 mL/kg給大鼠進行30 d連續(xù)灌胃給藥處理，1次/d。在對大鼠進行灌胃處理的30 d內，每天都需要對大鼠的狀態(tài)進行相應的觀察，并詳細記錄。在30 d灌胃試驗開始以及結束時，均需要對大鼠的質量進行1次測量。在灌胃試驗期間，每周都需要對大鼠的質量進行2次測量，并詳細記錄[22-24]。

1.3.4 大鼠肝損傷的CCl4模型構建

在試驗第30 d將各試驗組大鼠隔夜禁食不禁水約16 h后，正常組給予橄欖油，其余各試驗組的大鼠則從腹腔處注射質量分數(shù)40%CCl4橄欖油溶液(按10 mL/kg)[25]。將相對應劑量的受試樣品于4 h后灌胃給不同劑量組的大鼠，而將同等量的玉米油灌胃給正常組和模型組的大鼠，最后按照10 mL/kg的量對聯(lián)苯雙酯組的大鼠進行聯(lián)苯雙酯滴丸的灌胃。

1.3.5 血清生化指標測定

注射CCl4處理大鼠24 h后，測定大鼠血清中AST和ALT的活力水平。

1.3.6 肝臟組織病理檢查

解剖大鼠取其肝臟，將肝臟固定后進行病理組織學的檢查。在普通光學顯微鏡下對大鼠的肝結構進行觀察并詳細記錄，根據(jù)病變程度對其進行組織學的評分[26]，評分標準如表2所示。

表2 組織學評分標準

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素提取物成分的分析

采用HPLC分析方法，對類胡蘿卜素提取物成分與已有的類胡蘿卜素標準品(海膽酮、β-胡蘿卜素等)進行比較，結果如圖1和圖2所示。將圖1與圖2進行對比分析可知，類胡蘿卜素提取物的主要成分為蝦青素，且蝦青素在類胡蘿卜素提取物中所占的質量分數(shù)高達70.24%。而沒有發(fā)現(xiàn)與保留時間分別為18.570，23.147，39.091 min相近的類胡蘿卜素標準品(海膽酮保留時間45.926 min，β-胡蘿卜素保留時間60.213 min等)。

2.2 類胡蘿卜素提取物對大鼠質量的影響

在30 d試驗期間，每組大鼠的生理狀態(tài)均正常，類胡蘿卜素提取物對每組大鼠質量的影響情況如表3所示。由表3可知：模型組與正常組比較，兩組中的大鼠在測定期間質量均沒有統(tǒng)計學差異，P>0.05；低、中、高3個劑量組的大鼠分別與模型組比較，除了中劑量組的大鼠在第8 d和第15 d時質量有所減輕(P<0.05)之外，其余各組大鼠的質量在測定時期均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表3 類胡蘿卜素提取物對大鼠體質量的影響

說明：*表示與模型組之間的比較，且“*”表示有統(tǒng)計學差異，P<0.05

Notes：* indicated the comparison with the model group,and indicated statistical difference,P<0.05

2.3 類胡蘿卜素提取物對大鼠血清ALT、AST活力的影響

類胡蘿卜素提取物對試驗中各組大鼠血清指標影響結果如表4所示。由表4可以看出：與正常組相比，模型組大鼠血清中的ALT、AST顯著升高，有統(tǒng)計學差異，P<0.05，表明CCl4對肝臟有明顯損傷作用。與模型組比較，低、中兩個劑量組的大鼠血清中ALT、AST的活力均無統(tǒng)計學差異，P>0.05，但聯(lián)苯雙酯組和高劑量組中大鼠血清ALT活力有所降低，有統(tǒng)計學差異，P<0.05，表明聯(lián)苯雙酯滴丸與高劑量法夫酵母類胡蘿卜素提取物均對大鼠的肝臟組織有一定程度的保護作用。

表4 類胡蘿卜素提取物對大鼠血清ALT、AST活力的影響

說明：#表示與正常組之間的比較， 其中“#”表示P<0.05，而“##”表示P<0.01。*表示與模型組之間的比較，其中“*” 表示P<0.05，而“**”表示P<0.01

Notes：# indicated a comparison with the normal group,indicatingP<0.05,while ## indicatingP<0.01.* indicated a comparison with the model group,indicatingP<0.05,while ** indicatingP<0.01

2.4 類胡蘿卜素提取物對大鼠肝臟組織病理學的影響

對大鼠肝臟組織進行病理學檢查，其結果如圖3所示。正常組大鼠的肝臟組織良好，無異常變化(見圖3a)。模型組和低劑量組大鼠的肝臟組織損傷最為嚴重，表現(xiàn)為：在中央靜脈附近出現(xiàn)了脂肪變性的現(xiàn)象，有小空泡，呈圓形，部分肝細胞壞死甚至崩解，產生炎性細胞的聚集；在脂肪變性病灶的外緣，大量肝細胞發(fā)生氣球樣變，細胞腫大，細胞核濃縮甚至消失，胞質空化，如圖3b和圖3d所示。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和高劑量組僅僅出現(xiàn)少數(shù)肝細胞壞死或崩解，氣球樣變(見圖3c和圖3f)。中劑量組則發(fā)生部分肝細胞壞死或崩解，氣球樣變(圖3e)。以上結果表明，聯(lián)苯雙酯滴丸和不同劑量的類胡蘿卜素提取物對大鼠的肝臟具有一定程度的保護作用，其中高劑量的法夫酵母類胡蘿卜素提取物對大鼠的肝臟保護作用最為顯著。

試驗過程中對大鼠肝臟組織進行病理學評分，其結果如表5所示。由表5可知，模型組與正常組比較，模型組大鼠的肝臟細胞損傷嚴重，差異顯著(P<0.05)，主要表現(xiàn)為氣球樣變、脂肪變性、肝細胞壞死等現(xiàn)象。

表5 類胡蘿卜素提取物對大鼠肝臟組織病理學的評分結果

說明：單因素方差分析的指標為脂肪變性和肝細胞壞死，進行變量轉換的單因素方差分析的指標為水樣變性，秩和檢驗的指標為氣球樣變。#表示與正常組之間的比較，其中“#”表示P<0.05，而*則表示與模型組之間的比較，其中“*”表示P<0.05

Notes：The index of single factor ANOVA were steatosis and hepatocyte necrosis.The index of variable conversion of single factor ANOVA was water sample,and the index of rank-sum test was balloon-like.# indicated a comparison with the normal group,indicatingP<0.05,while * indicated a comparison with the model group,indicatingP<0.05

聯(lián)苯雙酯組與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組中只有肝細胞壞死這一個指標差異顯著，其余病變指標均沒有顯著性差異；低劑量組與模型組比較，低劑量組中也只有肝細胞脂肪變性這一個指標差異顯著，其余病變指標均沒有顯著性差異；中、高兩個劑量組分別與模型組比較，這兩組大鼠的肝細胞壞死程度在加入受試樣品后顯著減輕，并且高劑量組大鼠的肝細胞脂肪變性也顯著減輕。綜上所述，與模型組相比，聯(lián)苯雙酯滴丸和不同劑量類胡蘿卜素提取物對減輕肝細胞損傷均有不同程度的作用，表明法夫酵母類胡蘿卜素提取物對大鼠化學性肝損傷有輔助保護作用。

據(jù)報道，CCl4可通過影響細胞色素P450，進而代謝產生活潑的自由基及一系列氧活性物并最終導致肝細胞死亡、肝組織生理生化指標發(fā)生異常變化[27]。蝦青素不僅具有增強免疫力以及抗炎[28]等生物活性，而且具有很強的抗氧化[29]、清除自由基[30]的能力。推測法夫酵母類胡蘿卜素提取物保護大鼠肝臟的原因可能為：通過蝦青素等類胡蘿卜素清除自由基，從而減少自由基對肝細胞膜上的磷脂分子的攻擊，保護了細胞膜的完整性[31-32]。同時通過清除自由基，減少自由基與肝細胞內大分子發(fā)生共價結合，減輕膜不飽和脂質的攻擊，維持細胞膜的穩(wěn)定性和通透性[33]，進而阻止了ALT、AST從細胞質中大量溢出。

3 結論

本試驗結果表明，模型組的ALT、AST均高于正常組，肝細胞脂肪變性、氣球樣變、肝細胞壞死程度高于正常組，說明CCl4肝損傷模型造模成功。3種不同劑量的法夫酵母類胡蘿卜素提取物對肝病變都有不同程度的減輕，同時高劑量組大鼠血清ALT與模型組比較顯著降低(P<0.05)，表明法夫酵母類胡蘿卜素提取物對大鼠肝臟有一定程度的保護作用。對法夫酵母類胡蘿卜素提取物進行成分分析發(fā)現(xiàn)，其主要成分為蝦青素。