張?jiān)L，范明坤，謝仰杰,2

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021)

0 引言

小球藻(Chlorella)屬于綠藻門綠藻綱綠球藻目小球藻科，是海水魚類工廠化人工育苗中常用的基礎(chǔ)生物餌料，也是池塘水體重要的生物組分[1-2]。小球藻在魚類育苗、養(yǎng)殖生產(chǎn)中，不但可以吸收水體中的氨氮等有害物質(zhì)，同時也是輪蟲等浮游動物的餌料[3-6]。在環(huán)境適宜時，小球藻能快速繁殖，而環(huán)境不適宜時，可能導(dǎo)致小球藻密度大幅度下降。小球藻密度過高或過低，均不利于水質(zhì)和浮游動物數(shù)量的穩(wěn)定，進(jìn)而影響魚苗的存活與生長。因此，采取措施保持育苗水體中小球藻密度的穩(wěn)定，對于提高育苗成活率起著重要作用。

水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上常用一些益生菌來調(diào)節(jié)水質(zhì)，常見的有光合細(xì)菌、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和乳酸菌(Lactobacillussp.)[7-9]。益生菌的使用，一方面可以降解氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽，分解有機(jī)物質(zhì)，同時也是輪蟲等浮游動物的餌料。益生菌的使用必然對水體中單細(xì)胞藻類的繁殖產(chǎn)生影響。益生菌與單細(xì)胞藻類之間的相互影響如何，尚缺乏深入研究。為此，本研究選擇生產(chǎn)上常用的光合細(xì)菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌，分別與小球藻混合進(jìn)行培養(yǎng)，觀察小球藻和益生菌的增長情況，分析益生菌與單細(xì)胞藻類之間的相互影響，為海產(chǎn)魚類育苗水體的水質(zhì)、餌料生物的調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的小球藻為蛋白核小球藻(ChlorellapyrenoidosaChick)，培養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃、光照3000 lx、鹽度25，采用經(jīng)消毒的海水，添加營養(yǎng)鹽(KNO350 mg/L，KH2PO45 mg/L，檸檬酸鐵0.5 mg/L)后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取處于增殖期的藻液，計數(shù)后用消毒海水稀釋到1.0×107cells/mL后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)所用的光合細(xì)菌(photosynthetic bacteria,簡稱PSB)購自諾可信(廈門)生物科技有限公司，采用光合細(xì)菌培養(yǎng)基(廈門普得生物科技有限公司)，在溫度(25±1)℃，光照3000 lx條件下進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，計數(shù)后用消毒海水稀釋到1.6×107cells/mL后用于實(shí)驗(yàn)?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis) 和乳酸菌(Lactobacillussp.)均為廣州市微元生物科技有限公司生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)前先將粉狀菌用消毒過的海水進(jìn)行溶解，密封后放在溫度25℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1天，待菌從休眠期蘇醒后取中間的懸液，計數(shù)后用消毒海水稀釋到1.6×107cells/mL后用于實(shí)驗(yàn)。菌藻密度測定均采用血球計數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)的方法。

1.2 方法

1.2.1 菌藻混合培養(yǎng)試驗(yàn)

菌藻混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置小球藻+光合細(xì)菌(ZG)、小球藻+枯草芽孢桿菌(ZK)、小球藻+乳酸菌(ZR)3個實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置小球藻(Z)、光合細(xì)菌(G)、枯草芽孢桿菌(K)和乳酸菌(R)單獨(dú)培養(yǎng)4個對照組(見表1)。每個實(shí)驗(yàn)組和對照組各設(shè)置3個平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取其平均值。

表1 菌和小球藻的初始密度

說明：Z—小球藻組，G—光合細(xì)菌組，K—枯草芽孢桿菌組，R—乳酸菌組，ZG—小球藻+光合細(xì)菌組，ZK—小球藻+枯草芽孢桿菌組，ZR—小球藻+乳酸菌組

Notes:Z—C.pyrenoidosa，G—PSB，K—Bacillussubtilis，R—Lactobacillussp.，ZG—C.pyrenoidosa+PSB，ZK—C.pyrenoidosa+Bacillussubtilis，ZR—C.pyrenoidosa+Lactobacillussp.

參照養(yǎng)殖生產(chǎn)中的使用情況，設(shè)置各實(shí)驗(yàn)組和對照組的小球藻的初始密度為5.0×106cells/mL,菌的初始密度為8.0×106cells/mL(見表1)。采用小球藻原液、各菌原液和消毒海水進(jìn)行配制，配制后添加營養(yǎng)鹽(KNO350 mg/L，KH2PO45 mg/L，檸檬酸鐵0.5 mg/L)。每組取100 mL溶液裝入100 mL錐形瓶，置于光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃、光照為3000 lx，光暗比為12 h∶12 h。每天定時搖瓶2次，并隨機(jī)調(diào)換位置。實(shí)驗(yàn)為期7 d。自接種起每日定時采樣，用血球計數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)以測定菌、藻的密度。

藻細(xì)胞和菌的日增長率(k)按公式k=(lnN2-lnN1)/(t2-t1)×100%計算，其中：k為增長率；t1、t2為培養(yǎng)時間(d)；N1、N2為培養(yǎng)t1、t2時的生物個數(shù)(cells/mL) 。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 三種菌對小球藻生長的影響

各混合培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組和小球藻單一培養(yǎng)組的小球藻密度變化情況如圖1所示。Z組(小球藻單一培養(yǎng))的生長曲線呈緩慢遞增趨勢，在培養(yǎng)第7天時小球藻密度最高，為1.806×107cells/mL，平均日增長率為18.3%。ZY組(小球藻+枯草芽孢桿菌)和ZR組(小球藻+乳酸菌)分別在第4天和第5天時藻密度達(dá)到最大值，分別為1.703×107cells/mL和1.689×107cells/mL，兩組之間無顯著差異。在實(shí)驗(yàn)第1～5 天，ZY組和ZR組與小球藻單獨(dú)培養(yǎng)的Z組間無顯著差異，但在實(shí)驗(yàn)第6天和第7天，ZR組和ZY組的小球藻密度均呈現(xiàn)下降趨勢，小球藻密度均顯著低于Z組。ZG組(小球藻+光合細(xì)菌)從第1天開始小球藻的增殖速度都顯著高于其他各組(見圖1)，在第7天藻密度達(dá)到最大(4.134×107cells/mL)，平均日增長率為30.2%。

2.2 小球藻對芽孢桿菌增殖的影響

由圖2可知，Y組和ZY組芽孢桿菌的生長曲線呈遞增趨勢，兩組在培養(yǎng)第7天時芽孢桿菌的細(xì)胞密度分別為3.397×107cells/mL和3.667×107cells/mL，日增長率分別為20.7%和21.8%。兩組增長趨勢大致相同，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，兩組之間差異不顯著(見圖2)。

2.3 小球藻對光合細(xì)菌生長的影響

由圖3可知，G組和ZG組光合細(xì)菌的生長曲線呈遞增趨勢，兩組在培養(yǎng)第7天時光合細(xì)菌的細(xì)胞密度分別為2.522×107cells/mL和3.002×107cells/mL，平均日增長率分別為16.4%和18.9%。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，兩組之間差異不顯著(見圖3)。

2.4 小球藻對乳酸菌生長的影響

由圖4可知，R組和ZR組乳酸細(xì)菌的生長曲線呈遞增趨勢，兩組在培養(yǎng)第7天時乳酸菌的細(xì)胞密度分別為4.008×107cells/mL和4.593×107cells/mL，日增長率為23%和25%。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，兩組之間差異不顯著(見圖4)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，小球藻的初始密度為5.0×106cells/mL，菌的初始密度為8.0×106cells/mL，在溫度(25±1)℃，光照3000 lx，光暗比12 h∶12 h的條件下，小球藻與光合細(xì)菌混合培養(yǎng)(ZG組)時小球藻的增殖速度最好，培養(yǎng)到第7天時藻密度達(dá)到4.134×107cells/mL，平均日增長率為30.2%(見圖1)，顯著高于小球藻單獨(dú)培養(yǎng)的Z組，說明光合細(xì)菌能有效促進(jìn)小球藻的生長，而與光合細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)的(G組)相比，光合細(xì)菌的密度變化沒有顯著差異，說明光合細(xì)菌的繁殖受小球藻的影響不顯著。李小霞等[10]認(rèn)為，光合細(xì)菌與小球藻混合形成了菌藻共生系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用兩者的協(xié)同作用達(dá)到兩者自身生長的目的。光合細(xì)菌在分解有機(jī)物的過程中為自身代謝提供能量，也可以為小球藻提供無機(jī)鹽。小球藻不僅吸收培養(yǎng)基的營養(yǎng)鹽，還能將細(xì)菌代謝分解的物質(zhì)吸收同化成自身物質(zhì)，并通過光合作用釋放氧氣，進(jìn)而為光合細(xì)菌提供充足的溶氧，以使其維持正常的生命代謝活動。光合細(xì)菌不僅能分解培養(yǎng)基中的有機(jī)物，還具有脫氮、固氮、產(chǎn)氫和同化一定濃度的硫化氫的作用，能凈化水質(zhì)，為小球藻的生長提供良好的環(huán)境[11]。陳小晨等[12]的研究表明，在營養(yǎng)濃度低時，小球藻與光合細(xì)菌混合會表現(xiàn)出促進(jìn)生長的效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌和乳酸菌在前5天對小球藻的生長不產(chǎn)生顯著影響，但在后期小球藻密度均出現(xiàn)下降趨勢(見圖1)。觀察發(fā)現(xiàn)，Y組和ZY組在后期培養(yǎng)液變得混濁，底部有沉淀。這可能是由于后期溶氧不足，水質(zhì)出現(xiàn)敗壞，導(dǎo)致芽孢桿菌沉淀和藻類死亡。王月霞等[13]的研究表明，隨著芽孢桿菌的大量繁殖，加快了水體的溶氧量的消耗，使小球藻產(chǎn)生的氧氣不足以維持芽孢桿菌的有氧呼吸，大量的芽孢桿菌沉淀和小球藻死亡分解進(jìn)而產(chǎn)生有害物質(zhì)，破壞水質(zhì)。此外，程新等[14]的研究結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的溶藻活性物質(zhì)對小球藻的葉綠素a及藻體蛋白合成具有抑制效果。兩種因素共同作用導(dǎo)致枯草芽孢桿菌與小球藻混合培養(yǎng)時，小球藻的增殖受到抑制。乳酸菌和小球藻混合培養(yǎng)的后期，觀察到培養(yǎng)液變得透明，藻顏色減弱，pH偏酸性，這應(yīng)該是因?yàn)槿樗峋置诘娜樗峤档土巳芤旱膒H值[15],抑制了小球藻的增殖，甚至導(dǎo)致小球藻死亡。

本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組和對照組的有益菌都有增長增殖，但是增殖速度較緩。這可能是因?yàn)楸狙芯恐攸c(diǎn)考察益生菌對小球藻的影響，在實(shí)驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中并未專門添加針對益生菌的營養(yǎng)液。在配制各組培養(yǎng)液時，必然會有益生菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)隨著原液帶入，使得益生菌能夠繼續(xù)增長，但由于營養(yǎng)成分含量的限制導(dǎo)致增殖速度慢。

小球藻是海水池塘育苗期間最重要的單細(xì)胞藻類，小球藻的穩(wěn)定是取得較高育苗成活率的基礎(chǔ)。從以上結(jié)果可知，光合細(xì)菌對于小球藻的繁殖具有促進(jìn)作用，一旦池塘小球藻密度下降，在養(yǎng)殖管理中可以適當(dāng)添加光合細(xì)菌來促進(jìn)小球藻的生長。同時光合細(xì)菌也是輪蟲的優(yōu)質(zhì)餌料。如果小球藻密度偏大，則可以使用芽孢桿菌和乳酸菌，這樣可以適當(dāng)抑制小球藻的繁殖，但在使用時，需要采取增氧措施以確保溶氧充足。