劉衛(wèi)剛，韓坤煌，2，謝芳靖，鄒鵬飛，張子平，王藝磊，2

(1.集美大學水產學院，福建 廈門 361021；2.大黃魚育種國家重點實驗室，寧德市富發(fā)水產有限公司，福建 寧德 352103；3.福建農林大學動物科學學院，福建 福州 350002)

0 引言

脊椎動物通過自身的先天免疫與獲得性免疫系統(tǒng)來抵抗外界多種病原的侵襲，以保證機體的正常生命活動，而免疫球蛋白是在脊椎動物獲得性免疫中發(fā)揮重要作用的組成成分[1]。

當前對哺乳動物免疫球蛋白的相關研究較為深入，而針對魚類免疫球蛋白的研究則明顯不如哺乳動物。很長一段時間內在硬骨魚類中僅發(fā)現(xiàn)有IgM[2]或者僅同時含有IgD[3]，后來又陸續(xù)在虹鱒魚(Oncorhynchusmykiss)中發(fā)現(xiàn)IgT[4]，斑馬魚(Damiorerio)中發(fā)現(xiàn)IgZ[5]，但最后發(fā)現(xiàn)二者為同一類型，甚而發(fā)現(xiàn)IgM-IgZ的嵌合體[6-7]。與此同時，在軟骨魚類中也先后發(fā)現(xiàn)IgNAR、IgNARC[8]與 IgX[9]等免疫球蛋白，顯示硬骨魚類與軟骨魚類間的免疫球蛋白類型存在一定差異。

研究顯示IgM在所有魚類的體液免疫中都具有重要作用[7]。目前已對多種魚類的IgM進行了不同程度的研究，然而作為我國最重要的海水養(yǎng)殖經濟魚類之一的大黃魚(Larimichthyscrocea)，卻較少見到相關研究報道。此外，近年來由于環(huán)境污染與養(yǎng)殖密度過大等原因，人工養(yǎng)殖的大黃魚種質不斷退化，抗病力下降，大黃魚養(yǎng)殖業(yè)遭受較為嚴重的病害侵襲[10]。因此，克隆大黃魚免疫球蛋白重鏈(immunoglobulin mu heavy chain，LcIgMH)基因，將為闡明大黃魚的相關抗病分子機制提供更多信息，并為我國大黃魚養(yǎng)殖業(yè)防治病害提供一定的指導依據(jù)，具有重要的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用魚來自寧德市富發(fā)水產有限公司魚排，魚體體重180～250 g。1)取雌雄大黃魚各5尾，分別取如下組織：性腺、頭腎、肌肉、肝臟、脾臟、腦、鰓、胃、眼、腸和心臟，并將各組織樣品置于RNAlater中4 ℃處理一段時間，后放-80 ℃冰箱長期凍存。2)將100尾健康大黃魚均分為兩組，一組注射含有濃度為6.6×108cfu/mL(為半致死濃度的20%[11])副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的海水；另一組則注射等量的已滅菌海水 ，且于注射后2、4、8、12 d對脾臟進行取樣(實驗組與對照組各時相都取5條魚)，樣品保存方法同1)。

主要試劑有：RDP試劑[12](實驗室自配)，SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司)，逆轉錄試劑盒(Promega公司)，DNA膠回收試劑盒(上海捷瑞公司)，pMD-19T質粒載體(大連 TaKaRa 公司) ，SYBR Green Realtime PCR Master Mix(上海TOYOBO公司)。引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

用RDP試劑對約50 mg大黃魚不同組織樣本提取RNA，詳細方法參考文獻[12]。用ND-1000紫外分光光度計測定總RNA濃度，并用1.0%(體積分數(shù))瓊脂糖進行凝膠電泳以檢測RNA質量。

1.2.2LcIgMHcDNA 克隆

從本實驗已有大黃魚表達標簽數(shù)據(jù)庫(EST)中獲取LcIgMH基因的部分片段，用Primer 5.0等軟件設計相關基因引物(見表1)，并用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit獲取cDNA第一條鏈并最終實現(xiàn)目的基因擴增。相關產物采用1.5%(體積分數(shù))的瓊脂糖進行電泳，并用膠回收試劑盒對目的片段膠進行回收純化。將PMD19-T與純化產物于16 ℃連接過夜，后與DH5α感受態(tài)細胞進行轉化，隨后將感受態(tài)細胞用含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基置于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落利用M13引物進行PCR檢測，最后將呈陽性的菌落用含氨芐青霉素的LB進行擴大培養(yǎng)，取培養(yǎng)物400 μL送至上海生工公司進行DNA測序。

1.2.3LcIgMH序列的生物信息學分析

用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析測序結果，確定LcIgMH基因并拼接全長cDNA序列；用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)預測ORF；用SignalP4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測其信號肽區(qū)域；用ExPASy(http://cn.expasy.org/tools/pi_tool.html)預測LcIgMH等電點與分子量；用NetNGlyc1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)對LcIgMH潛在的糖基化位點進行預測；用TMHMM Server V2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對LcIgMH進行跨膜區(qū)域預測；用NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測磷酸化位點；用IMGT/DomainGapAlign(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)預測LcIgMH的可變區(qū)與恒定區(qū)。

1.2.4 qRT-PCR

取1 μg總RNA進行逆轉錄，最終獲取cDNA，以大黃魚18S rRNA(Lc18S)為內參基因，將cDNA稀釋100倍用于qRT-PCR。反應體系包括：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、cDNA 模板9 μL及正反引物各0.5 μL。反應程序：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min，共進行40個循環(huán)。目標基因的相對表達量數(shù)據(jù)分析，采用2-△△Ct法，數(shù)據(jù)結果表示為平均值±標準差。用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行ANOVA單因素方差分析，以P<0.05表示存在顯著性差異，P<0.01表示存在極顯著性差異。

表1 本研究所用引物

2 結果與分析

2.1 大黃魚各組織總RNA

用RDP試劑所提取出的各組織RNA，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示具18S rRNA與28S rRNA條帶都很完整。圖1為本研究提取的大黃魚性腺總RNA電泳圖，其他各組織電泳結果與之相似。

2.2 LcIgMH基因序列分析

利用本實驗室自建的大黃魚cDNA文庫篩選IgM重鏈的片段，應用5′RACE和3′RACE-PCR技術得到其全長cDNA。使用BLAST 2軟件進行拼接后，最終得到長為1917 bp的LcIgMHcDNA全長序列(GenBank登陸號：FJ589726.1)，其中：3′非編碼區(qū)(3′Untranslated Region，UTR)176 bp，5′UTR 6 bp，以及ORF 1738 bp(見圖2)。同時，在polyA尾前30 bp處存在一個AATAAA加尾信號，可知3′UTR擴增較為完整。對獲得的ORF進行相關預測，發(fā)現(xiàn)其編碼584個氨基酸(見圖2)，所編碼的蛋白分子量約為65.2 ku，等電點為5.84。 SingalP4.1 server預測結果顯示，其N端含有信號肽(1-19 aa)。NetPhos 3.1 Server預測顯示該序列中含有29個絲氨酸潛在磷酸化位點，8個蘇氨酸潛在磷酸化位點，9個酪氨酸潛在磷酸化位點。NetNGlyc 1.0的預測顯示LcIgMH含有3個糖基化位點(N242、N340與N550)(見圖2)。推測LcIgMH蛋白共含13個半胱氨酸殘基，與其他物種IgMH蛋白氨基酸序列進行多重比對之后發(fā)現(xiàn)多個半胱氨酸殘基高度保守(見圖3)。TMHMM 2.0預測結果顯示，LcIgMH不含跨膜區(qū)域，顯示本研究獲得的LcIgMH為分泌型而非膜結合型。BlastP結果顯示LcIgMH與紅笛鯛(Lutjanussanguineus)IgMH(ADX01345.1)序列一致性最高，達到64%，與多種硬骨魚類IgMH也具有較高的一致性；而與人類(Homosapiens)IgMH(P0DOX6.1)的一致性僅有30%，同非洲爪蟾(Xenopuslaevis)IgMH(AAA49774.1)的一致性也只有32%。用IMGT/DomainGapAlign對LcIgMH進行可變區(qū)與恒定區(qū)預測，發(fā)現(xiàn)其含有1個VH及4個CH區(qū)域(見圖2)，同時可變區(qū)含有典型的3個CDR區(qū)域與4個FR區(qū)域(見圖3)，顯示其具有魚類IgMH的典型結構。

2.3 LcIgMH的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用已經報道的其他多種硬骨魚類、人和非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的IgMH蛋白質氨基酸序列進行多重序列比對，結果發(fā)現(xiàn)大黃魚與其他硬骨魚類的IgMH保守性遠高于人和非洲爪蟾。由比對結果可知上述各物種的IgMH可變區(qū)及恒定區(qū)序列都存在一定的保守性，且恒定區(qū)的保守性較可變區(qū)更高。此外，對可變區(qū)的保守性分析顯示其保守性主要集中于4個FR區(qū)域，而3個 CDR區(qū)域的變異性則非常大(見圖3)。

利用上述物種的IgMH蛋白氨基酸序列，使用MEGA7軟件，以N-J法構建系統(tǒng)進化樹(見圖4)。進化樹分析顯示，大黃魚、紅笛鯛、金頭鯛(Sparusaurata)、鱖魚(Sinipercachuatsi)、條紋婢(Latrislineata)、南極鱈(Nototheniacoriiceps)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)、大西洋鮭(Salmosalar)及虹鱒聚為一支，而斑馬魚獨立成一支，人類及非洲爪蟾獨立成另一支。

2.4 LcIgMH基因在各組織中的表達

如圖5所示，大黃魚LcIgMH在脾臟和頭腎中表達量顯著高于其他各組織(P<0.05)，雖然脾臟中LcIgMH重鏈基因的表達量雄魚高于雌魚，頭腎中雌魚高于雄魚，但都未形成顯著性差異。而在性腺、肌肉、肝臟、腦、鰓、胃、眼、腸及心臟中LcIgMH的表達量極低，表明相關組織可能較少參與機體的免疫反應。

2.5 大黃魚脾臟LcIgMH基因在副溶血弧菌感染后的表達

由圖6可知，注射副溶血弧菌進行感染4 d后，脾臟內LcIgMH表達量最高，并且與對照組之間存在顯著性差異(P<0.05)，而從感染后8 d的結果顯示其表達量已回落至對照組水平。在檢測的各時間點中，感染后的第4天，是脾臟參與副溶血弧菌引起的免疫應答的一個重要節(jié)點。此外，本文發(fā)現(xiàn)對照組從始至終都存在一定量的LcIgMH表達。

3 討論

本研究成功克隆到大黃魚LcIgMH基因的cDNA全長。多重序列比對分析發(fā)現(xiàn)，不同物種間IgMH蛋白的CDR區(qū)域差異性非常明顯。CDR區(qū)域主要作用是識別抗原，其序列具有高變性則更易于識別多種抗原，利于機體的免疫反應，增強對環(huán)境的適應性。同一脊椎動物，因為需要面對多種病原，倘若僅僅只產生一種IgMH是不可能滿足機體免疫需求的。脊椎動物可以通過基因重排來改變CDR區(qū)域，并以此為基礎使機體產生的免疫球蛋白可以識別多種抗原。同一脊椎動物，即使面對同一入侵病原也很可能產生多種IgMH，而這些蛋白之間的差異主要是CDR區(qū)域。因為同一入侵病原，也可能具有不同的抗原表位，需要不同的CDR識別。

在生物的進化過程中，魚類處于由低等向高等進化的過渡階段，硬骨魚類和軟骨魚類都已具備高等脊椎動物免疫系統(tǒng)的雛形，但與高等脊椎動物相比仍然不成熟[13]。當前研究認為魚類的腎臟、胸腺及脾臟是主要免疫器官，三者在魚類免疫反應中起重要的作用[14-17]。但是隨著魚類個體的生長，胸腺逐漸退化，其在免疫中發(fā)揮的功能也逐漸減小。如王欣欣[7]發(fā)現(xiàn)草魚中頭腎、中腎與脾臟中IgMH的表達量遠高于其他組織，而胸腺中IgMH的表達量與其他組織并無顯著性差異，暗示成年草魚的胸腺在機體免疫中的作用可能并不如脾臟與頭腎重要。其他研究也顯示，魚類的腎臟與脾臟在魚類的免疫應答中起重要作用[18-20]。本研究利用熒光定量PCR技術初步分析了LcIgMH基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在脾臟和頭腎中的表達量均顯著高于其他各組織，推測頭腎與脾臟在大黃魚的免疫應答中具有重要作用，并通過弧菌感染實驗對脾臟中該基因的表達水平進行分析，發(fā)現(xiàn)其在感染4 d時的表達量顯著高于未感染組，表明LcIgMH參與大黃魚副溶血弧菌感染下的免疫應答。這與謝芳靖[11]早前對大黃魚感染副溶血弧菌后LcIgMH在頭腎中的上調表達時間存在一定差異，提示頭腎與脾臟在免疫應答中的作用可能并非完全一致。同時根據(jù)本實驗結果可知，大黃魚本身就具有一定的LcIgMH本底表達水平，顯示魚體在生長過程中已經發(fā)生過特異性免疫應答或者是為合成BCR服務，同時暗示LcIgMH在大黃魚的整個生命活動中都具有重要意義。王亞鳳等[21]在對胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)早期發(fā)育各時期進行IgM RNA的檢測，發(fā)現(xiàn)其在出膜后一個月就有明顯的表達，表明自然狀態(tài)下脊椎動物很早就可能開始接觸抗原并產生相關免疫應答或者合成BCR。

對雌雄大黃魚各組織中LcIgMH的表達水平進行檢測分析，本研究發(fā)現(xiàn)不同性別的大黃魚并不會差異性地表達LcIgMH。在對大西洋鱈魚的研究[22]中亦發(fā)現(xiàn)體長相近但性別不同的個體，與免疫相關的待檢測指標都不存在明顯差異。上述結果暗示魚類的性別差異并不會對其IgMH的表達產生顯著性影響。

免疫球蛋白在體內發(fā)揮相關生物學作用，是一個十分復雜的過程。國內外已經有諸多文獻指出各組織mRNA的表達量，并不一定能準確反映相關蛋白在生物體內的含量及其發(fā)生相應生物學作用的場所。利用Western Blot檢測胭脂魚各組織中IgM蛋白的表達情況時，發(fā)現(xiàn)在用qRT PCR并未檢測出IgM轉錄本的皮膚與心臟中，卻可以檢測出胭脂魚IgM蛋白，推測可能是機體血液循環(huán)將IgM蛋白運送至上述組織所致[21]。此外，ELISA也是常用的檢測IgM蛋白的手段，但是人們認為前者比后者更靈敏且可信度更高。如Jirapongpairoj等[23]設計2種抗魚IgMH血清，同時利用上述兩種方法對7種魚類血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)Western blot的靈敏度遠高于ELISA。因此，后續(xù)深入探究大黃魚LcIgMH在體內從表達到發(fā)揮相應的生物學作用的過程，需要結合核酸與蛋白質的相關技術研究手段進行系統(tǒng)分析。