賀玉欽 高文 綜述 陳文明 審校

隨著對多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的認識不斷加深，新型檢測技術，如原位熒光雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）、高通量測序（highthroughput sequencing）、基因芯片（gene microarray）和定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的迅速發(fā)展，對MM的細胞遺傳學異常有了更為深入的了解。MM 危險分層（Mayo stratification of myeloma and risk- adapted therapy，mSMART）分為低危、中危、高危3個等級，對應不同的預后及治療策略［1］。不同的等級對應的基因異常的類型和嚴重程度均不同。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的數(shù)目變化與MM的基因異質(zhì)性密切相關，通過遺傳學檢測技術已發(fā)現(xiàn)部分關鍵的lncRNA并揭示其功能［2］。本文旨在對MM細胞遺傳學異常領域的部分問題進行綜述。

1 lncRNA的概念

在對基因組轉(zhuǎn)錄的過程中發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)錄組并不能作為蛋白翻譯的模板，稱為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNAs），根據(jù)核苷酸的長度，分為短鏈和長鏈，其中長鏈非編碼RNA（lncRNA）指核苷酸數(shù)超過200個，占轉(zhuǎn)錄組長度的一半之多，進化程度高且保守。哺乳動物基因組序列中4%～9%序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本為lncRNA，國際上收錄lncRNA的LNCipedia數(shù)據(jù)庫包含120 353個已標記的人類lncRNA［3］。lncRNA有很大的基因異質(zhì)性，參與細胞生理和基因組活動的多個過程，部分lncRNA被歸因為與腫瘤的形成、進展、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移和侵襲等過程有關，部分有致腫瘤作用，部分有抑制腫瘤的作用，甚至與放化療的敏感性有關。但是，多數(shù)lncRNA相關的疾病事件機制并未明確，除了參與腫瘤發(fā)生和進展，lncRNA還可作為腫瘤診斷和預后評價的生物標記物，甚至可以用于藥物分子作用靶點［4］。

2 lncRNA與腫瘤

有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在相關性主要表現(xiàn)在lncRNA具有組織特異性表達及調(diào)節(jié)的特點，對細胞周期、細胞生存和免疫應答等具有獨特的影響，導致正常細胞分化成不同表型的腫瘤細胞［5］。1）部分lncRNA通過腫瘤抑制物或癌基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，85%非編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）與疾病相關［6］，如神經(jīng)母細胞瘤相關的SNP 位于lncRNA 神經(jīng)母細胞瘤相關轉(zhuǎn)錄物1（neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1），與NBAT1差異性表達有關。NBAT1通過沉默神經(jīng)元特異性轉(zhuǎn)錄因子REST抑制細胞分化和侵襲［7］。2）通過分析lncRNA與不同組織細胞生物學過程的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)lncRNA與癌癥發(fā)生的主要通路相關，通過作用在一些控制癌癥發(fā)生的關鍵部位達到致癌作用。如控制腫瘤抑制因子（p53）、分化和生存因子（NF-κB）、哺乳動物的雷帕霉素靶點（mammalian target of rapamycin，mTOR）、轉(zhuǎn)錄因子E2F、雄激素或雌激素受體等均提示lncRNA和蛋白編碼基因類似，為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，控制著關鍵的腫瘤抑制因子和原癌基因通路。3）lncRNA在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮作用，如mRNA的剪切、翻轉(zhuǎn)、輸出和翻譯，甚至對翻譯后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和修飾也有影響［8］?？傊?，lncRNA在腫瘤中的作用包括作為腫瘤的抑制因子和原癌基因、順式/反式作用元件和參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。

3 lncRNA與MM

諸多研究提示lncRNA與MM關系密切，在漿細胞發(fā)生癌變事件的各個時期，如出現(xiàn)IgH易位、發(fā)生超二倍體和NRAS/BRAF基因激活等事件的過程中，不同的lncRNA會發(fā)生情況各異的表達，部分進行上調(diào)表達，部分進行下調(diào)表達，并參與到基因變化的復雜生物學機制中。當癌變的漿細胞到達最終漿細胞白血病時，多數(shù)關鍵的lncRNA均發(fā)生變化。因此，lncRNA的作用機制與MM的惡性度關系密切［9］。不同的lncRNA生物學來源和作用機制差異較大，本文針對有定論的lncRNA特點，對比和總結(jié)這些lncRNA的不同生物學行為。

3.1 轉(zhuǎn)移相關性肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1

轉(zhuǎn)移相關性肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）為一種假腫瘤源性lncRNA，由染色體11q13轉(zhuǎn)錄，在部分實體腫瘤中過度表達［10］。有研究表明，MALAT1上調(diào)與細胞周期相關分子通路、p53 介導的DNA 損傷修復、mRNA 成熟過程相關，復發(fā)或進展的MM 患者MALAT1 表達增高［9］。MALAT1 的表達趨勢與DNA結(jié)合蛋白高運動組盒1（high mobility group box 1，HMGB1）一致，HMGB1 維持骨髓瘤細胞生存和增殖的關鍵物質(zhì)，為細胞自噬的介導因子［11］。在一項體外實驗的小鼠MM 細胞系中，敲除MALAT1 減少HMGB1 的表達水平并伴隨自噬基因Beclin-1 和LC3B 的下降，顯著降低MM 細胞的活性，增加其凋亡［12］。MALAT1 沉默導致細胞周期素D1（cyclin D1）和細胞周期素E（cyclin E）表達下調(diào)，激活半胱天冬酶-3（caspase-3）和半胱天冬酶-9（caspase-9），增加促凋亡蛋白BAX，降低抗凋亡蛋白BCL-2 表達［13］。上述研究結(jié)果提示，MALAT1 促進MM 的自噬，上調(diào)HMGB1 的表達，促進凋亡的抑制和延長腫瘤細胞生存。有研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1可能與MM的髓外浸潤有關，尤其是發(fā)生在多次化療后，提示與耐藥性相關，降低總生存率（overall survival，OS）和無進展生存率（progression-free survival，PFS），通常提示不良預后［14］。此外，MALAT1 在間充質(zhì)細胞中過表達，導致轉(zhuǎn)錄性激活臨近反義蛋白編碼基因3（latent-transforming growth factor beta-binding protein 3，LTBP3）的表達，該基因可正性調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）的活性，并抑制終末期成骨細胞生成［15］?？梢奙ALAT1 在MM 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，與MM疾病復發(fā)和進展相關。

3.2 結(jié)直腸腫瘤差異性表達物

結(jié)直腸腫瘤差異性表達物（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE）是一個定位于16q12.2的lncRNA，在直腸癌中表達上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，該lncRNA在早期人類發(fā)育、部分實體腫瘤及白血病和MM中均表達升高［16］。Meng等［17］采用qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，在MM細胞系和患者中的CRNDE表達增加，與不良的OS及腫瘤侵襲進展相關。在CRNDE敲除的細胞系（U266和RPMI-8826）中引起凋亡增加和細胞周期停止在G0/G1期，通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染細胞系并敲除CRNDE，miR-451的表達大幅增加。通過生物信息學和雙熒光素酶實驗證實，miR-451和CRNDE的3′-UTR為假性互補作用，MM的CRNDE和miR-451呈負相關，可能為CRNDE通過競爭性內(nèi)源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）的分子海綿作用負性靶向調(diào)節(jié)miR-451實現(xiàn)。提示對miR-451的抑制可以補償CRNDE敲除后的效應，抑制腫瘤的發(fā)生。

3.3 母系表達基因3

母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）為位于14q32.2的lncRNA，是一種通過p53依賴或非依賴的腫瘤調(diào)節(jié)物，控制腫瘤的表觀遺傳學表達，功能實驗證實轉(zhuǎn)染并表達MEG3和其同等亞型，顯著上調(diào)p53的蛋白水平，增加p53增強子的轉(zhuǎn)錄［18］。通過研究MM患者中MEG3的表達，Benetatos等［19］發(fā)現(xiàn)60%患者差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）的高度甲基化與疾病的分期及亞型有關。2/3的IgG型MM和所有IgM型MM表現(xiàn)出表觀遺傳學改變，但是無一例IgA型的MM有高度甲基化DMR。提示MEG3 lncRNA增強子可能與DMR高度甲基化有關，表達降低與MM腫瘤發(fā)生有關。在骨的分化過程中，MM患者的間充質(zhì)細胞（MM-MSC）較正常供者的（ND-MSC）MEG3表達程度略低。過表達MEG3可以促進MM-MSC分化，而敲除MEG3對ND-MSC的骨生成有減弱作用。MEG3通過轉(zhuǎn)錄一種TGF家族的基因-骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）來促進骨生成。MEG3和BMP4均定位于14號染色體，MEG3直接作用于轉(zhuǎn)錄因子SRY 基因相關高運動組盒2（SRY related high mobility group box 2，SOX2），促進其與BMP4增強子分離并決定BMP4的表達增加［20］。

3.4 尿道上皮癌相關因子1

尿道上皮癌相關因子1（urothelial cancer associated 1，UCA1）為位于19p13.12 的lncRNA，通過基因表達分析和基因芯片篩選的方法首先在膀胱移行上皮癌中發(fā)現(xiàn)，診斷膀胱癌的特異性91.8%（78/85）和敏感性80.9%（76/94）均較高［21］。Zhang 等［22］采用qRTPCR 檢測MM 患者骨髓樣本的UCA1 和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），提出UCA1 可能是與MM 預后相關的lncRNA，下調(diào)UCA1顯著抑制細胞系的增殖，促進細胞的凋亡，正性調(diào)節(jié)TGF-β，過表達TGF-β 部分抵消UCA1 的敲除作用。在83 例MM 骨髓樣本中，27 例lncRNA 差異性表達，UCA1 在MM 的患者中顯著低于健康對照，與白蛋白水平呈正相關，與血清單克隆免疫球蛋白水平呈負相關。高水平的UCA1 與不良的OS 和發(fā)生del（13q14）、1q21+或t（4；14）易位相關［23］。在膀胱癌細胞中UCA1 和轉(zhuǎn)錄因子cAMP 反應要素結(jié)合蛋白（cAMP response element binding，CREB）之間的聯(lián)系提示，UCA1 通過PI3K-AKT 途徑激活CREB 影響細胞周期調(diào)控［24］。

3.5 蛋白二硫化物異構(gòu)酶家族A成員3假基因1

蛋白二硫化物異構(gòu)酶家族A成員3假基因1（protein disulfide isomerase 3 peudogene 1，PDIA3P1）為一種符合lncRNA特征的假基因，位于染色體1q21.1，長度為2 099 bp。Sun等［25］研究發(fā)現(xiàn)，PDIA3P1在口腔鱗狀上皮癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中過度表達和該類腫瘤的預后相關，通過siRNA抑制細胞周期素2（cyclin D2，CCND2）蛋白沉默該基因后可以減少Ki-67抗原的增殖表達，抑制腫瘤生長。PDIA3P1通過抑制siRNA負性調(diào)節(jié)miRNA-185-5p，但對信使RNA（messenger RNA，mRNA）水平無影響。Reece等［26］研究提示，部分lncRNA在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因均表達，作用于腫瘤發(fā)展調(diào)節(jié)因子，如CCCTC結(jié)合因子、c-myc和p53等。PDIA3P1在MM中也存在過表達，與MM的生存率呈正相關。PDIA3P1通過葡萄糖6-磷酸脫氫酶（Glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD）和磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）調(diào)節(jié)MM的生長與耐藥，且與c-myc相互作用增強其反式激活并結(jié)合于G6PD增強子，導致G6PD 過表達以及PPP 活化［27］。因此，PDIA3P1可以作為MM診治的潛在新靶點。

3.6 p53調(diào)節(jié)相關lncR NA

約11%MM中的染色體類型為del（17p），相對應的基因?qū)W異常為抑癌基因p53 缺失［26］。p53 調(diào)節(jié)相關lncRNA（p53 regulation associated lncRNA，PRAL）位于17p13.1，與p53的表達密切相關［28］。Avet-Loiseau等［29］研究表明，PRAL與MM的疾病進展和預后相關，發(fā)現(xiàn)PRAL在原發(fā)性MM細胞表達下調(diào)，在del（17p）的情況下更為顯著，并與MM 的國際分期系統(tǒng)（international staging system，ISS）分期和D-S（Durie-Salmon）分期相關。低PRAL患者無病生存期（disease free survival，DFS）和OS均降低，為DFS和OS的獨立預測因素。體外實驗證實，PRAL3增強硼替佐米（bortezomib，BTZ）的抗MM作用。miRNA-210為PRAL的靶點，miRNA-210過表達降低了PRAL對BTZ的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）為miRNA-210的靶點，PRAL通過吸附在miRNA-20上不降低對BMP2的抑制作用。對于MM伴有del（17p）的患者，PRAL可能成為新型的，對MM的診治和預后具有重要價值的lncRNA［30］。

3.7 OPA作用蛋白5反義轉(zhuǎn)錄本1

lncRNA OPA 作用蛋白5 反義轉(zhuǎn)錄本1（OPA-interacting protein 5 antisense transcript 1，OIP5-AS1）位于人染色體15q15.1，主要正性調(diào)節(jié)細胞周期G2/M期，在多種腫瘤中有促細胞增殖的作用［31］。有研究證實［32］，lncRNA OIP5-AS1在MM細胞表達下調(diào)，lncRNA OIP5-AS1與miRNA-410構(gòu)成的信號軸可能在細胞分化過程中發(fā)揮負性作用，缺乏lncRNA OIP5-AS1會介導MM細胞中的miRNA-410積累，導致細胞增殖、細胞周期進展和凋亡抑制。Zhang等［33］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA OIP5-AS1在肝母細胞癌中的作用與在MM中相似，敲除OIP5-AS1后上調(diào)miRNA-186a-5p和下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子鋅指E盒結(jié)合同源盒1（zinc finger E box binding homeobox 1，ZEB1）抑制肝母細胞瘤的繁殖和轉(zhuǎn)移，提示lncRNA OIP5-AS1具有高度致癌特性。

3.8 H19

lncRNA H19的作用首先在乳腺癌中提出，Sun等［34］在篩選與乳腺癌相關的lncRNA時發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19在雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性的MCF-7乳腺癌細胞中高表達。敲低lncRNA H19降低了細胞的生存并且阻礙了雌激素介導的細胞增殖。Pan等［35］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA H19位于MM細胞的細胞質(zhì)中，并通過體外動物實驗證實，多數(shù)lncRNA H19可能通過ceRNA調(diào)節(jié)骨髓瘤細胞對BTZ的耐藥過程。通過生物信息學進行推測，miRNA-29b-3p 可能為lncRNA H19 的靶向miRNA，其靶蛋白為骨髓瘤細胞白血病序列-1（myeloid cell leukemia sequence-1，MCL-1），MCL-1屬于抗凋亡蛋白Bcl-2家族，通過蛋白酶體進行泛素化降解，在多種腫瘤中有表達。lncRNA H19在MM進展過程中可能起到癌基因的作用，過表達lncRNA H19可能顯著增加腫瘤生長，抵消miRNA-29b的抗腫瘤作用。Corrado等［36］研究提出，lncRNA H19為不同的分子介導體，通過缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）的激活促進腫瘤細胞增殖、運動和轉(zhuǎn)移。在缺氧（O2濃度為1%）MM細胞系中可以發(fā)現(xiàn)lncRNA H19過表達，MM發(fā)生擴散，與表達缺氧誘導基因C-X-C模序細胞因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）有關。此外，lncRNA H19減少缺氧條件下間充質(zhì)細胞的黏附，蛋白印記實驗表明lncRNA H19對受損的HIF-1α的核仁易位有沉默作用。由此可見，lncRNA H19在腫瘤增殖方面的多個機制上起到促進作用。

3.9 FEZ家族鋅指蛋白1反義RNA1

FEZ 家族鋅指蛋白1 反義RNA1（FEZ family zinc finger 1 antisense RNA 1，F(xiàn)EZF1-AS1）為一個與腫瘤不良預后相關的lncRNA，在視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤中為一個上調(diào)的原癌基因，高水平的FEZF1-AS1 顯著降低生存率，沉默F(xiàn)EZF1-AS1抑制該腫瘤的細胞增殖、侵襲和遷移［37］。在MM 中，F(xiàn)EZF1-AS1 顯著下調(diào)，Li等［38］通過細胞系驗證FEZF1-AS1 抑制MM 細胞的增殖，使細胞周期靜止在G0/G1期，并在體外介導細胞凋亡。此外，該研究證實FEZF1-AS1 在MM 細胞中作為ceRNA抑制AKT3調(diào)節(jié)miRNA-610的表達。

3.10 漿細胞瘤易位轉(zhuǎn)化物1

漿細胞瘤易位轉(zhuǎn)化物1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）由位于myc基因的下游的PVT1基因編碼，近年來大量研究表明PVT1在人類腫瘤中過表達。Yang等［39］通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，PVT1在MM骨髓樣本和細胞系中表達上調(diào)，miRNA-203a為下調(diào)，兩者的表達具有相關性（P＜0.05）。體外功能實驗發(fā)現(xiàn)，PVT1抑制MM細胞的繁殖并誘導MM細胞凋亡（P＜0.05），生物信息學方法預測PVT1對miRNA-203a起到分子海綿（ceRNA）作用，抑制其表達。PVT1/miRNA-203a軸為探討MM致癌性的機制之一［39］。

3.11 NR_046683

lncRNA NR_046683 為通過高通量lncRNA 篩選確定的1 個lncRNA，除MM 外在其他腫瘤中暫無報道。Dong等［40］采用qRT-PCR對細胞系MM組和對照組進行檢測，相關統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA NR_046683與MM的預后評價密切相關，同時在腫瘤細胞系KM3 和U366 中檢測出來，特別是在耐藥細胞系KM3/BTZ和MM1R中更為顯著。lncRNA NR_046683在不同的MM 亞型和時期的表達存在明顯差異。過度表達的lncRNA NR_046683與β-2微球蛋白的含量密切相關，而且發(fā)現(xiàn)該lncRNA 與染色體變異如del（13q14）、1q21+、t（4；14）易位相關。據(jù)此推斷，lncRNA NR_046683 可以作為潛在的藥物靶向型生物標記物和判斷MM預后的新型分子。

4 展望

綜上所述，lncRNA在MM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用。不同的lncRNA所在的染色體部位不同，所起到的生物學作用差異性較大。本文列舉了已發(fā)現(xiàn)的與MM相關的lncRNA，但仍有較多的lncRNA與MM的關系亟需得到闡釋。此外，即使是功能上已有定論的lncRNA，可能在其他未知機制上也有不同的作用。lncRNA與上游分子mRNA、及下游分子miRNA的關系較為密切，形成了復雜的共表達網(wǎng)絡，其關系和機制亟需進一步研究。lncRNA有望作為MM的特異性腫瘤標志分子和藥物治療靶點，期待未來通過lncRNA對MM的發(fā)病機制能有更新的認識。