郝以杰 牛哲禹 綜述 盧俊 審校

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)第七大常見(jiàn)惡性腫瘤和第二大癌癥相關(guān)死亡原因［1］，在我國(guó)每年約42萬(wàn)患者死于HCC［2］。隨著診療水平的不斷提高，目前針對(duì)HCC治療的預(yù)后較以前已明顯改善，但總體效果仍不理想。究其原因主要是與HCC早期診斷困難及易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。近年來(lái)由原發(fā)瘤灶釋放入血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）引起的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移成為研究熱點(diǎn)。CTC檢測(cè)與組織活檢等傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，具有實(shí)時(shí)、高效、可重復(fù)性高等特點(diǎn)［3］，在HCC早期診斷、預(yù)后評(píng)估監(jiān)測(cè)以及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究中成為一種很有前景的檢測(cè)形式及藥物靶點(diǎn)。但由于HCC CTC在外周血中含量極低，并且種類各異，給富集與檢測(cè)帶來(lái)了困難，在一定程度上限制了臨床對(duì)CTC的深入研究及應(yīng)用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷革新以及研究的不斷深入，CTC在HCC臨床研究及應(yīng)用中的重要價(jià)值已逐漸得到證實(shí)。現(xiàn)將有關(guān)HCC CTC的檢測(cè)方法、臨床研究及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行論述。

1 CTC概述

CTC是指自發(fā)或者因診療操作自腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移性病灶脫落進(jìn)入外周血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞［4］，由Ashworth［5］于1869年首次提出。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明CTC參與了腫瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且能夠較好的反映腫瘤在患者體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。此外，不同腫瘤患者之間、同一患者不同腫瘤部位，甚至不同腫瘤細(xì)胞之間均存在明顯的異質(zhì)性［6］，為此，對(duì)CTC進(jìn)行分子分型和功能分析，有助于對(duì)患者進(jìn)行實(shí)時(shí)的生物學(xué)變化監(jiān)測(cè)并制定精準(zhǔn)的個(gè)體化治療策略。隨著各種檢測(cè)技術(shù)的發(fā)明、發(fā)展及廣泛應(yīng)用，CTC的相關(guān)檢測(cè)及研究已取得初步成果，并且展示出巨大的臨床應(yīng)用前景。

2 HCC CTC的檢測(cè)方法

CTC發(fā)現(xiàn)后一百多年來(lái)，各種檢測(cè)手段得到不斷提高，為進(jìn)一步研究CTC在HCC發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制提供了可能。目前的檢測(cè)技術(shù)主要基于其大小、密度、細(xì)胞剛性及表面電荷等物理特性和細(xì)胞功能及細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)特異性抗原的生物學(xué)特性。隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)及臨床應(yīng)用，CTC檢測(cè)方法也越來(lái)越豐富、高效，大致分為三代：第一代主要包括以梯度離心法、特殊濾過(guò)器以及免疫磁珠法為代表的批量處理CTC 的方法；第二代主要指流式細(xì)胞術(shù)、微流體芯片技術(shù)及CanPatrolTMCTC 檢測(cè)技術(shù)等；第三代則是在第二代的基礎(chǔ)上研發(fā)的能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離的液滴微流體技術(shù)，該技術(shù)中通過(guò)微流體裝置在單個(gè)細(xì)胞單元中形成液滴來(lái)分離細(xì)胞，含有單個(gè)細(xì)胞的液滴可用于研究每個(gè)細(xì)胞的特性、評(píng)估細(xì)胞的生存能力等，其僅在肺癌等研究中有相關(guān)應(yīng)用報(bào)道［7］。目前在HCC CTC 研究中常用的檢測(cè)方法有CellSearchTM系統(tǒng)、流式細(xì)胞術(shù)、微流體芯片以及CanPatrolTMCTC 檢測(cè)技術(shù)等。各種檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)效率有所差異，各種檢測(cè)方法的綜合應(yīng)用可能會(huì)提高檢測(cè)效能。

Sun等［8］應(yīng)用CellSearchTM系統(tǒng)從HCC患者外周血中檢測(cè)出了HCC CTC，陽(yáng)性率為68%；而Von Felden等［9］在HCC術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的研究中使用CellSearchTM系統(tǒng)檢測(cè)CTC，檢出率僅為15%，總體來(lái)說(shuō)陽(yáng)性率并不理想。分析原因可能是由于多數(shù)HCC細(xì)胞并不表達(dá)EpCAM，并且部分腫瘤細(xì)胞在HCC進(jìn)展的過(guò)程中發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變，失去包括EpCAM等細(xì)胞表型［10］。Ogle等［11］建立了聯(lián)合細(xì)胞角蛋白、EpCAM、AFP、glypican-3、DNApk多種標(biāo)志物免疫熒光成像及細(xì)胞大小、形態(tài)和DNA含量的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HCC CTC的方法，在65%的HCC患者外周血中檢測(cè)到CTC的存在，而在對(duì)照組內(nèi)均未檢測(cè)到CTC。Zhang等［12］將基于HCC細(xì)胞膜上表達(dá)的亞洲糖蛋白受體（ASGPR）與其配體特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于微流體裝置的CTC芯片，用來(lái)檢測(cè)外周血中的CTC。結(jié)果顯示所有HCC患者均檢測(cè)到CTC，而健康、良性肝病及非HCC患者均未檢測(cè)到CTC。該研究表明，微流體芯片技術(shù)用于檢測(cè)HCC患者外周血中的CTC具有較高的敏感性及特異性。Ou等［6］使用CanPatrolTMCTC技術(shù)檢測(cè)HCC患者外周血中的CTC，在165份血液樣本中有117份（70.9%）檢測(cè)到CTC≥2/5 mL。Chen等［13］報(bào)道的應(yīng)用CanPatrol platform對(duì)195例HCC患者的外周血樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢出率可達(dá)95%?？梢?jiàn)隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展及CTC的研究深入，HCC CTC的檢測(cè)手段不斷發(fā)展，目前已能夠達(dá)到較高的敏感性及特異性，但多種檢測(cè)手段均存在一定的弊端，還需要不斷地探索理想的CTC檢測(cè)手段。

3 HCC CTC的臨床研究及臨床應(yīng)用

目前多種檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用使得HCC CTC的檢測(cè)獲得了較好的敏感性和特異性，在臨床分期、預(yù)后評(píng)價(jià)和療效評(píng)估等方面已經(jīng)逐步開(kāi)展相應(yīng)的研究并取得了一定成果。隨著對(duì)CTC 的深入研究，越來(lái)越多的研究表明，不同形態(tài)及不同型別的CTC 在HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用，因此僅從CTC在HCC患者外周血中存在與否以及含量的高低來(lái)進(jìn)行預(yù)后評(píng)價(jià)以及確定復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性等已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。對(duì)CTC分類后再行進(jìn)一步的精細(xì)化研究可使不同種類的CTC 在HCC 發(fā)生、發(fā)展中的作用特性更加清晰明了，并且為CTC的相關(guān)研究提供了新的方向。

3.1 CTC與HCC早期診斷

早期發(fā)現(xiàn)HCC 對(duì)改善患者預(yù)后至關(guān)重要，但目前的檢測(cè)手段尚不理想。有研究表明，CTC與AFP聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高HCC 診斷的特異性及敏感性；傳統(tǒng)HCC 診斷指標(biāo)AFP 使用20 ng/mL 的截止值時(shí)，其靈敏度估計(jì)為53%，特異性為87%；而將AFP 閾值提高到100 ng/mL后，其特異性可達(dá)99%，但靈敏度僅為31%。而CTC 在HCC 診斷中具有很高的特異性，但靈敏度較低。Kalinich等［14］提出，在早期HCC篩查時(shí)，以AFP 20 ng/mL 為截?cái)嘀奠`敏度較高，外周血CTC檢測(cè)特異性良好，兩者聯(lián)合可明顯提高HCC 診斷的效能。Cheng 等［15］的研究結(jié)果也表明，CTC 計(jì)數(shù)是診斷HCC 有效的方法，聯(lián)合使用CTC 計(jì)數(shù)和AFP 可明顯提高HCC診斷的效力。盡管缺少大規(guī)模研究數(shù)據(jù)的支撐，但該診斷策略具有巨大的臨床應(yīng)用前景。

3.2 CTC與HCC臨床病理特征

研究表明HCC患者外周血中CTC的陽(yáng)性率與較差的臨床病理特征（包括臨床分期、血清AFP 水平、腫瘤數(shù)目及有無(wú)轉(zhuǎn)移等）呈正相關(guān)。Chen 等［13］研究結(jié)果表明，HCC 患者外周血中CTC 計(jì)數(shù)與BCLC 分期、轉(zhuǎn)移及血清AFP 水平密切相關(guān)；分期較晚、存在肝外轉(zhuǎn)移及血清AFP＞20 ng/mL 的HCC 患者外周血中CTC陽(yáng)性率明顯增加。Ou等［6］的研究也得到了相似結(jié)果：在AFP水平較高、多發(fā)腫瘤、TNM和BCLC分期較晚、存在栓子或微栓子的患者中，CTC 增多更為常見(jiàn)。由此推測(cè)，CTC可聯(lián)合傳統(tǒng)病理特征共同反映腫瘤特性，但鑒于CTC檢測(cè)手段的限制，目前尚未能在臨床診療過(guò)程中廣泛應(yīng)用。

3.3 CTC與HCC預(yù)后

研究表明外周血CTC計(jì)數(shù)較高的HCC患者術(shù)后預(yù)后較差，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高，無(wú)病生存期（disease free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）較低。此外，治療后的外周血中的CTC 計(jì)數(shù)的變化能夠反映治療效果［16］，患者在治療后（包括手術(shù)、介入、及靶向藥物等）外周血中CTC 計(jì)數(shù)減少或消失提示治療效果較好；而對(duì)于CTC 計(jì)數(shù)無(wú)變化及下降后又升高的患者往往提示治療效果欠佳及腫瘤復(fù)發(fā)或產(chǎn)生耐藥。Ye等［17］研究了CTC計(jì)數(shù)與乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌根治切除術(shù)后患者臨床結(jié)局的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)術(shù)后CTC計(jì)數(shù)較低（≤2/5 mL）的患者與計(jì)數(shù)較高（＞2/5 mL）的患者相比，DFS和OS均明顯延長(zhǎng)，表明更高的CTC計(jì)數(shù)可能是HCC不良預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立的標(biāo)志。Yu等［18］研究了肝手術(shù)切除后HCC 患者CTC 的變化，結(jié)果表明術(shù)后CTC計(jì)數(shù)增加（術(shù)前CTC＜2，術(shù)后CTC≥2）的患者與CTC計(jì)數(shù)未增加（術(shù)前CTC＜2，術(shù)后CTC＜2）的患者相比DFS 和OS 明顯縮短；術(shù)前和術(shù)后持續(xù)≥2 CTC的患者預(yù)后最差，而持續(xù)＜2 CTC的患者DFS和OS最長(zhǎng)。以上研究結(jié)果表明術(shù)后CTC計(jì)數(shù)與HCC患者的預(yù)后明顯相關(guān)。Hao等［19］為此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，結(jié)果顯示前入路肝切除術(shù)后的患者與傳統(tǒng)入路肝切除的患者相比外周血中的CTC計(jì)數(shù)明顯減少，且2年復(fù)發(fā)率及2年生存率也明顯降低，提示前入路肝切除與傳統(tǒng)肝切除相比顯著降低了術(shù)后CTC 的計(jì)數(shù)，并且明顯改善了患者的預(yù)后。CTC在HCC預(yù)后的相關(guān)研究中已展現(xiàn)出了巨大優(yōu)勢(shì)，并且已使部分患者獲益。相信隨著更大樣本的研究，其應(yīng)用價(jià)值將得到進(jìn)一步印證，并且能夠使更大的人群從中獲益。

3.4 不同表型CTC的特性

外周血中的CTC具有不同的表型，不同表型CTC的生物特性存在明顯差異。研究表明與其它表型CTC 相比，間充質(zhì)細(xì)胞型CTC 具有更高的轉(zhuǎn)移潛能。Ou 等［6］利用上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)記物將從165 例HCC患者的外周血中富集到的CTC 分為上皮細(xì)胞型、間充質(zhì)細(xì)胞型和混合表型三型，并分別分析了三種CTC表型與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明間充質(zhì)細(xì)胞型CTC 多見(jiàn)于AFP 水平高、多發(fā)腫瘤、TNM 和BCLC分期較晚以及存在栓子或微栓子的HCC 患者。此外，腫瘤早期復(fù)發(fā)患者間充質(zhì)細(xì)胞型CTC 陽(yáng)性率較高并且生存分析顯示間充質(zhì)細(xì)胞型CTC 患者RFS 較短。因此認(rèn)為，間充質(zhì)細(xì)胞型CTC 往往發(fā)生在晚期患者，并與早期復(fù)發(fā)有關(guān)。該研究表明CTC 具有異質(zhì)性，HCC 患者的CTC 表型可用于提示疾病進(jìn)展和預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)。Chen 等［13］指出，間充質(zhì)CTC 可作為HCC患者腫瘤分期的生物標(biāo)志物。隨著CTC 研究的不斷精細(xì)化，各種不同表型CTC 的特性已逐漸明了，CTC分型在臨床研究中已取得初步成果并且具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

3.5 不同形態(tài)CTC的特性

HCC患者外周血中不同形態(tài)的CTC也具有不同的效能。CTC 在外周血中的存在形態(tài)可分為單細(xì)胞CTC 及細(xì)胞團(tuán)CTM 等，CTM 一般由2～50 個(gè)細(xì)胞組成［20］，其中除了腫瘤細(xì)胞還包括血小板、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及白細(xì)胞等［21-23］。最近的研究表明，CTM 可能不僅僅是腫瘤細(xì)胞的聚集體，與單個(gè)CTC相比CTM在多數(shù)情況下具有更高的轉(zhuǎn)移潛能和抗凋亡能力［24-27］。因此，對(duì)CTM的評(píng)估和計(jì)數(shù)可能為理解癌癥生物學(xué)和癌癥轉(zhuǎn)移擴(kuò)散提供一個(gè)新的維度，并且有可能為評(píng)價(jià)腫瘤預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。

Aceto等［28］發(fā)現(xiàn)了在血液中存在與CTC結(jié)合的白細(xì)胞。Szczerba 等［29］對(duì)該類細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的深入研究，從乳腺癌患者外周血中檢測(cè)出CTC-WBC簇，將CTC-WBC簇內(nèi)與中性粒細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的癌細(xì)胞分離出來(lái)后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)存在的CTC相比，CTC-WBC 簇內(nèi)的CTC中促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因呈高表達(dá)，結(jié)果導(dǎo)致更高效的轉(zhuǎn)移形成。因此認(rèn)為，中性粒細(xì)胞和CTC 之間的聯(lián)系促進(jìn)了血液中腫瘤細(xì)胞周期的發(fā)展，并擴(kuò)大了CTC 的轉(zhuǎn)移潛能。此外，關(guān)于CTM 相比單個(gè)CTC 更具轉(zhuǎn)移潛能的特性也已在胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、頭頸部癌及肺癌等相關(guān)研究中得到證實(shí)［24-27］，但缺乏HCC相關(guān)研究報(bào)道。值得注意的是，已有研究表明HCC 患者外周血中的中性粒細(xì)胞升高是HCC 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且中性粒細(xì)胞作為腫瘤進(jìn)展和性能惡化的推動(dòng)者具有獨(dú)特作用［30］。然而其具體作用機(jī)制不明。綜上，推測(cè)HCC患者外周血中的中性粒細(xì)胞也通過(guò)加快循環(huán)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展的方式促進(jìn)了腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。然而，目前尚缺乏相關(guān)臨床研究結(jié)果。因此，為了更好地了解CTC及CTM在HCC復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等方面的作用機(jī)制及臨床意義，尚需大規(guī)模的臨床試驗(yàn)及循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

4 結(jié)語(yǔ)

CTC的發(fā)現(xiàn)及深入研究在HCC診療方面發(fā)揮了巨大作用，使動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展及判斷預(yù)后等成為可能，為HCC的診療提供了新的思路，并且已經(jīng)成為HCC臨床研究中的一種重要工具。目前尚有部分問(wèn)題還未得到解決，如何在不影響其形態(tài)及生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上將一定量外周血中的全部CTC分離出來(lái)尚需進(jìn)一步的研究。此外，已有研究表明僅從CTC的數(shù)目上反映HCC臨床病理特征及預(yù)后遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，個(gè)體化的單細(xì)胞分析或許會(huì)成為以后研究的重點(diǎn)，但對(duì)分離出的CTC如何進(jìn)行精細(xì)化研究（包括分型、分類以及單個(gè)細(xì)胞分析等）尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。CTC的研究有可能為人類治愈HCC帶來(lái)新的希望。