劉琨，李勇，王蓉，丁萬(wàn)隆

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

由灰葡萄孢BotrytiscinereaPers.引起的灰霉病是一種重要的全球性農(nóng)業(yè)病害?；移咸焰呒闹鲝V泛，可侵染糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、蔬菜、果樹(shù)、藥用植物等586屬1400余種植物[1]?；移咸焰邼摲陂L(zhǎng)且具有低溫致病性，對(duì)貯藏期蔬菜、瓜果等威脅較大。

灰葡萄孢變異頻率高、再侵染頻繁、抗藥性強(qiáng)，屬于存在高抗藥性風(fēng)險(xiǎn)的致病菌之一?；移咸焰咭跃z、分生孢子和菌核侵染寄主植物的莖、葉、花和果實(shí)等，并在侵染后期產(chǎn)生分生孢子或菌核[2]。

不同來(lái)源的灰葡萄孢無(wú)明顯的寄主專(zhuān)化性，如灰葡萄孢B.cinerea、草莓葡萄孢B.fragariae、卡羅萊納葡萄孢B.caroliniana、中華葡萄生葡萄孢B.sinoviticola和蘋(píng)果葡萄孢B.mali均能引起草莓灰霉病[3]。農(nóng)作物上的灰葡萄孢也可侵染人參引發(fā)病害，如：除人參灰霉菌外，番茄灰葡萄孢和草莓灰葡萄孢亦可侵染人參葉片，且致病力較強(qiáng)[4]。鑒于以上兩點(diǎn)，建議在人參灰霉病綜合防治中予以高度重視。

1 葡萄孢菌的分類(lèi)

葡萄孢無(wú)性態(tài)屬于半知菌亞門(mén)Deuteromycotina、絲孢綱Hyphomyeetes、絲孢目Myphomycetales、淡色孢科Moniliaceae，有性態(tài)屬于子囊菌亞門(mén)Ascomycota、盤(pán)菌綱Discomycetes、柔膜菌目Helotiales、核盤(pán)菌科Selerotiniaeeae、葡萄孢盤(pán)菌屬Botryotinia[5]。Botrytiscinerea是葡萄孢屬真菌的一個(gè)復(fù)合種，也是本屬最大的類(lèi)群，常以無(wú)性態(tài)侵染植物并傳播孢子?；移咸焰呔咦庸＜?xì)長(zhǎng)不分枝或分枝群生，有隔膜，長(zhǎng)317～940 μm，直徑8.5～12.3 μm?；移咸焰呔z透明，直徑5～6 μm，分生孢子叢生于孢?；蛐」ｍ敹耍破咸汛疇?，單個(gè)孢子倒卵形、球形或橢圓形，光滑，近無(wú)色，(8.4～15.8)μm×(6.3～12.6)μm。在PDA培養(yǎng)基上，菌落初呈淡白色，后轉(zhuǎn)為灰色，同時(shí)伴有菌核生成[6]。

灰葡萄孢表型變異豐富，根據(jù)其分生孢子的產(chǎn)生、分布以及菌核有無(wú)，Paul[7]將其分為菌絲型、孢子型和菌核型。張艷杰等[8]通過(guò)形態(tài)觀察和生長(zhǎng)速率測(cè)定，將分離自不同葡萄種植區(qū)的143株灰葡萄孢菌劃分為菌絲型(40.56%)和菌核型(59.44%)；菌絲型又分為6個(gè)亞型(M1～M6)，以M6亞型居多；菌核型分為5個(gè)亞型(S1～S4，S6)，以S3亞型居多。研究還發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢致病力與灰葡萄孢的形態(tài)型、寄主無(wú)明顯相關(guān)性，但與菌株所在地域存在關(guān)聯(lián)，通常相似環(huán)境分離的灰霉病菌致病力也相近。結(jié)合酶切片段以及環(huán)酰菌胺敏感性測(cè)定，Albertini等[9]、Fournier等[10]將灰葡萄孢B.cinerea分為2個(gè)亞種，即group I和group II；而Walker[11]通過(guò)對(duì)法國(guó)葡萄園灰霉菌多樣性分析，將group I亞種重新命名為假灰葡萄孢B.pseudocinerea。

2 灰葡萄孢菌的致病機(jī)理

灰葡萄孢菌分生孢子首先附著于寄主表皮細(xì)胞，隨后孢子萌發(fā)形成芽管和附著胞，幫助灰葡萄孢侵入[12]?；颐咕煞置诖罅康募?xì)胞壁降解酶，從寄主組織獲取營(yíng)養(yǎng)完成自身生活史[13]。灰葡萄孢菌侵染過(guò)程中產(chǎn)生纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶、活性氧物質(zhì)、蛋白酶、脫落酸、乙烯、毒素等致病因子，用以擾亂、破壞寄主植物防御系統(tǒng)，殺死寄主細(xì)胞，成功完成侵染定殖。缺失上述致病因子合成相關(guān)基因會(huì)導(dǎo)致灰霉菌毒性減弱甚至完全喪失[14]。

死體營(yíng)養(yǎng)型病菌侵染的最終結(jié)果是將寄主的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為自身物質(zhì)?；移咸焰呔闹鞯墓餐攸c(diǎn)是細(xì)胞壁中果膠含量高[15]。研究發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢菌至少含6種多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)基因，其在侵染時(shí)上述基因的表達(dá)情況與寄主、組織類(lèi)型及環(huán)境因素等密切相關(guān)[15]。RNA-seq研究結(jié)果表明，灰葡萄孢菌能合成多聚半乳糖醛酸酶、果膠甲酯酶、纖維素酶、半纖維素酶等水解酶，且侵染時(shí)灰葡萄孢水解酶的表達(dá)量與寄主果膠等多糖類(lèi)物質(zhì)含量密切相關(guān)[16]。

3 人參灰霉病的發(fā)生與危害

人參PanaxginsengC.A.Meyer為五加科人參屬藥用植物，為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，主產(chǎn)于我國(guó)東北地區(qū)[17]。

人參灰霉病于1984年首次在中國(guó)渾北河口參場(chǎng)被發(fā)現(xiàn)，隨后在韓國(guó)等地也有報(bào)道[18]。人參灰霉病通常6月下旬開(kāi)始發(fā)生，7月中旬至8月下旬進(jìn)入發(fā)病盛期。該病主要為害人參葉片、葉柄、花和果實(shí)，造成莖、葉萎縮枯死，嚴(yán)重時(shí)亦可為害莖及根部[19]。近年，灰霉病在東北人參產(chǎn)區(qū)危害逐年加重，通常病株率為15%～30%，嚴(yán)重地塊超過(guò)50%，已成為影響人參產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的限制性因素之一[20]。

發(fā)病初期葉部出現(xiàn)水漬狀、灰褐色斑點(diǎn)，多從葉尖或葉緣開(kāi)始侵染而呈倒V形，后病斑迅速擴(kuò)展，葉片正反面生出灰色霉層。發(fā)病后期病斑組織壞死，易破碎脫落，葉片穿孔[19]。莖部首先出現(xiàn)水浸狀小點(diǎn)，逐漸擴(kuò)展為淺褐色，長(zhǎng)圓形或不規(guī)則形，嚴(yán)重時(shí)病部以上莖葉枯死，產(chǎn)生大量霉層；柱頭或花瓣被侵染后，向果實(shí)或果柄擴(kuò)展，受害果實(shí)不能成熟產(chǎn)籽[6]。

4 人參灰霉病的發(fā)病規(guī)律

4.1 灰霉菌生物學(xué)特性

灰葡萄孢菌絲在5～30 ℃均可生長(zhǎng)，最適產(chǎn)孢溫度25 ℃，孢子8～32 ℃均可萌發(fā)，孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)最適溫度20～24 ℃?；颐咕咦用劝l(fā)要求較高的相對(duì)濕度(RH≥90%)，濕度過(guò)低孢子無(wú)法萌發(fā)?；移咸焰呔z生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)喜弱酸性環(huán)境，最適pH值分別為5.0和6.2，菌絲生長(zhǎng)對(duì)光照不敏感[21]。人參灰霉菌孢子、菌絲和菌核致死條件分別為50、55、60 ℃處理10 min。

4.2 人參灰霉病病害循環(huán)

灰霉菌以菌絲體、分生孢子、菌核在病株殘?bào)w或土壤中越冬。菌核抵抗不良環(huán)境條件的能力較強(qiáng)。翌年春天條件適宜時(shí)，灰霉菌菌核萌發(fā)產(chǎn)生新的菌絲體及分生孢子，后者經(jīng)氣流、雨水、農(nóng)事操作、昆蟲(chóng)活動(dòng)等途徑在寄主間傳播[22]。具備外滲物營(yíng)養(yǎng)條件下，分生孢子萌發(fā)并通過(guò)傷口、自然孔口及幼嫩組織侵入寄主組織，新生成的分生孢子往復(fù)侵染，進(jìn)一步導(dǎo)致病害發(fā)生和流行。灰霉病發(fā)生與環(huán)境溫度、濕度關(guān)系密切，空氣濕度高、澆水后逢雨天或地勢(shì)低洼積水等，均有利人參灰霉病發(fā)生[23]。

4.3 影響病菌侵染的因素

灰葡萄孢是一種弱寄生真菌，通常無(wú)法侵染健康植物組織，只能在衰老植物組織中定殖?；移咸焰呔稚咦訚舛葘?duì)侵染效果影響較大。高濃度分生孢子接種后多形成芽管的頂點(diǎn)型，能快速完成侵染；低濃度分生孢子接種后多形成附著胞和侵染墊，2～4 d完成侵染，及時(shí)施藥可阻止侵染結(jié)構(gòu)的形成，從而降低病害發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[24]。植物傷口可加快病菌侵入，即使空氣中無(wú)自由水，分生孢子也可通過(guò)傷口完成侵染。

5 人參灰霉病的防治

灰霉菌基因型豐富，表現(xiàn)型多樣，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)。另外，灰霉菌繁殖快，變異頻率高，對(duì)化學(xué)殺菌劑存在不同程度抗藥性，導(dǎo)致人參灰霉病的防治難度較大。目前，用于人參灰霉病防治的技術(shù)手段主要有下面幾種。

5.1 化學(xué)防治

化學(xué)防治是當(dāng)前灰霉病防治中最為經(jīng)濟(jì)、有效，且使用最為普遍的防治方法。自20世紀(jì)70年代，相繼開(kāi)發(fā)出苯丙咪唑類(lèi)、二甲酰亞胺類(lèi)、N-苯基氨基甲酸酯類(lèi)、苯基吡咯類(lèi)、三唑類(lèi)等化學(xué)殺菌劑用于人參灰霉病的防治。目前，人參病害登記農(nóng)藥有：苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、赤霉酸、代森錳鋅、多菌靈、多抗霉素、噁霉靈、哈茨木霉菌、枯草芽孢桿菌、醚菌酯、嘧菌環(huán)胺、嘧菌酯、噻蟲(chóng)·咯·霜靈、噻蟲(chóng)嗪、霜脲·錳鋅、王銅、乙霉·多菌靈、異菌脲。2018年5月29日，在撫松召開(kāi)了人參生產(chǎn)用藥登記專(zhuān)家審定會(huì)，此次會(huì)議針對(duì)13種人參生產(chǎn)用農(nóng)藥——嘧菌酯、嘧霉胺、氟硅唑、烯酰嗎啉、多抗霉素、氟啶胺、氟嗎-唑菌脂、甲霜-霜霉威、精甲-惡霉靈、氫氧化銅、雙炔酰菌胺、氨基寡糖素等通過(guò)初步評(píng)審?；颐共》乐蔚臍⒕鷦┲饕ǎ寒惥?、嘧霉胺、腐霉利和福美雙等。但是病菌對(duì)上述殺菌劑的抗(耐)藥性也在逐漸產(chǎn)生，亟需尋求新的灰霉病防治方法，以減緩病菌抗藥性的產(chǎn)生。

5.2 生物防治

生物防治是近年來(lái)新興的植物病害防治方法，該方法環(huán)境友好、毒副作用小、無(wú)殘留，是用于人參病害防治的理想選擇。木霉是生物防治中應(yīng)用最廣的一類(lèi)。其通過(guò)合成抗菌素、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生等途徑達(dá)到抑菌效果[25]。Dik等[26]研究發(fā)現(xiàn)，哈茨木霉T39和出芽短梗霉Aureobasidiumpullulans能顯著降低灰霉病株死亡率，防效高于異菌脲。潘曉曦等[27]從人參根際土中篩選出7株枯草芽孢桿菌，其中6株對(duì)人參灰霉病有良好的抑制作用。上述菌株的挖掘?yàn)槿藚⒒颐共∩锓乐蔚於肆己没A(chǔ)。目前，受復(fù)雜環(huán)境因素的制約，微生物菌劑在使用中可能存在防效不穩(wěn)定等問(wèn)題，但是經(jīng)過(guò)菌株改良及菌劑制備工藝的提升，相信上述問(wèn)題都能得到解決。隨著中藥材人工栽培面積的不斷擴(kuò)大，藥用植物病害問(wèn)題愈發(fā)突出；加之國(guó)家對(duì)中藥材病蟲(chóng)害防治過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥使用的嚴(yán)格限定和規(guī)范，生物防治將迎來(lái)巨大的發(fā)展空間。

5.3 其他途徑

我國(guó)藥用植物資源豐富，多種中草藥中的藥效物質(zhì)或次生代謝產(chǎn)物對(duì)灰葡萄孢具有顯著的抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，木醋液對(duì)灰霉菌菌絲體及孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用[28]。潘曉曦等[29]研究發(fā)現(xiàn)，丁香、五味子、北豆根、細(xì)辛、白頭翁、錦燈籠的乙醇提取物均對(duì)人參灰霉菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)有抑制作用；其中，丁香乙醇提取物的病害防效與多菌靈1000倍液相當(dāng)[30]。此外，通過(guò)加強(qiáng)田間管理、合理灌溉、平衡施肥等手段，也可增強(qiáng)寄主抗病性，有效減緩人參灰霉病害的發(fā)生與危害。

6 結(jié)語(yǔ)

灰葡萄孢作為一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)群體，研究過(guò)程中應(yīng)盡可能擴(kuò)大取樣范圍及樣本數(shù)量，深入探究病菌的形態(tài)型及基因型差異，以及致病性與地域、寄主來(lái)源、氣候區(qū)等的關(guān)系。另外，還應(yīng)結(jié)合抗藥性實(shí)驗(yàn)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)特定產(chǎn)區(qū)灰葡萄孢菌的抗藥性變化情況，提早預(yù)防，防止高抗藥性菌株引發(fā)嚴(yán)重的灰霉病流行。采用DNA重組技術(shù)、細(xì)胞質(zhì)融合技術(shù)構(gòu)建出耐不良環(huán)境或耐藥性強(qiáng)的工程菌株[31]?；移咸丫闹虏C(jī)理研究也在逐漸深入，為開(kāi)發(fā)灰葡萄孢菌特有致病途徑中的蛋白、酶抑制劑提供了理論基礎(chǔ)[2]。

目前，植物病害防治主要依靠化學(xué)殺菌劑。但日益嚴(yán)重的環(huán)境污染、病菌抗藥性及農(nóng)藥殘留問(wèn)題，迫使病害防治策略發(fā)生轉(zhuǎn)變。積極研發(fā)新型高效、低毒化學(xué)農(nóng)藥，加快環(huán)境友好型微生物菌劑的研制、升級(jí)和示范推廣，是確保人參灰霉病可防可控的關(guān)鍵[32]。此外，加強(qiáng)人參種植過(guò)程中的田間管理，對(duì)于人參病害防治也至關(guān)重要。