王亞娜，張 磊

0引言

視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)的形成是缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變中最重要的病理過程，病變進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致視功能不可逆性損害甚至喪失[1]。越來越多的研究表明，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)兼具抑制新生血管形成和神經(jīng)保護(hù)的作用[2]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是趨化因子家族中的主要成員之一，在腫瘤、炎癥、視網(wǎng)膜色素變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)等缺血缺氧性疾病中起著重要的作用。本研究通過建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠模型，觀察PEDF對視網(wǎng)膜新生血管和MCP-1表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步探討PEDF對缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用和機(jī)制，為PEDF治療缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物C57BL/6J新生小鼠160只，7日齡，雌雄不限，清潔級，由上海市瑞金醫(yī)院動物房提供，動物飼養(yǎng)條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》。

1.1.2主要試劑和儀器重組PEDF蛋白(美國Peprotech公司)；熒光標(biāo)記的GS-Isolectin B4(Vector Laboratories)；RIPA裂解液(美國Sigma公司)；BCA試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；5%脫脂奶粉；SYBR green PCR試劑盒(日本Takara公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；PEDF兔抗單克隆抗體一抗(sc-25594，美國Santa Cruz公司)，MCP-1兔抗單克隆抗體一抗(ab25124，美國Abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗單克隆抗體一抗(ab9485，美國Abcam公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(碧云天生物技術(shù)公司，A0208)；PVDF膜(美國Millipore公司)；Quantity One圖像處理系統(tǒng)、蛋白電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠OIR模型的建立采用隨機(jī)數(shù)字表法將160只7日齡小鼠分為正常組(24只)、正常對照組(16只)、OIR模型組(40只)、PBS治療對照組(40只)、PEDF藥物治療組(40只)。參照既往方法[3]制作OIR模型。取7日齡C57BL/6J新生小鼠與哺乳母鼠共同置于氧濃度為(75±2)%的氧環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)5d，然后返回正常氧環(huán)境中飼養(yǎng)5d，建立OIR模型；正常組及正常對照組小鼠始終置于正常氧環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2.2小鼠玻璃體腔注射所有小鼠均取右眼為實(shí)驗(yàn)眼。參照既往PEDF玻璃體腔注射的方法[4]，12、14日齡時(shí)PEDF藥物治療組和PBS治療對照組小鼠玻璃體分別注射等量的PEDF(1μL，2μg/μL)和PBS(1μL，10mmol/L，pH=7.4)；正常組小鼠不作任何干預(yù)，正常對照組小鼠分別于12、14日齡時(shí)玻璃體腔注射等量PBS(1μL，10mmol/L，pH=7.4)，注射后氧氟沙星眼膏涂眼預(yù)防感染。

1.2.3小鼠視網(wǎng)膜鋪片和染色造模結(jié)束17日齡時(shí)，所有小鼠過量麻醉處死。各組隨機(jī)抽取8只小鼠摘除右眼球，立即浸泡于40g/L多聚甲醛溶液中固定2h，手術(shù)顯微鏡下用角膜剪沿眼球的角鞏膜剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體和玻璃體，分離出完整視網(wǎng)膜組織，用PBS(10mmol/L，pH=7.4)漂洗后以1∶50稀釋的GS-Isolectin B4染色液對游離視網(wǎng)膜進(jìn)行染色，室溫避光45min～1h；用PBS漂洗后在手術(shù)顯微鏡下以視盤為中心做5～6個放射狀切口，平鋪于載玻片上，樹脂膠封片。全部視網(wǎng)膜分為5～6瓣，熒光顯微鏡下照相，觀察是否出現(xiàn)血管迂曲擴(kuò)張、微血管瘤和新生血管的形態(tài)。Image Pro Plus 6.0計(jì)算各組RNV面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4Western-blot檢測視網(wǎng)膜組織中PEDF和MCP-1蛋白的表達(dá)造模結(jié)束后(P17)，所有小鼠過量麻醉處死。手術(shù)顯微鏡下分離取出所有小鼠視網(wǎng)膜，液氮迅速冷凍后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。取出冰箱中保存的各組視網(wǎng)膜放入勻漿杯中，4℃條件下12000g離心10min后，加入預(yù)冷的蛋白裂解液200μL，冰上作用30min，振蕩混勻，4℃條件下14000g離心15min后取上清液提取蛋白，后酶標(biāo)儀測蛋白濃度，計(jì)算含40μg蛋白的溶液體積為上樣量，與蛋白上樣緩沖液混合后100℃加熱5min使其變性，常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1～2h，三羥基甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)洗膜后分別加入按1∶100稀釋的PEDF、MCP-1一抗以及1∶1000稀釋的GAPDH一抗；4℃搖床過夜后洗膜，分別加入1∶500稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的相應(yīng)二抗。室溫下孵育2h，TBST洗膜10min×3次。進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯色并拍照，以GAPDH作為內(nèi)參照。用GIS-2020凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描蛋白條帶的光密度(OD)值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH OD值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)量，并依此進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖1全視網(wǎng)膜鋪片染色觀察各組視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)的變化(×400) A：正常組；B：OIR模型組；C：PBS治療對照組；D：PEDF藥物治療組。

1.2.5RT-PCR檢測視網(wǎng)膜組織中PEDF和MCP-1mRNA的表達(dá)取出冰箱中保存的各組視網(wǎng)膜，每組隨機(jī)取8個視網(wǎng)膜樣本，Trizol試劑一步法提取總RNA，分光光度計(jì)測定A260、A280及其濃度，根據(jù)A260/A280和A280/A260的比值鑒定總RNA純度，后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。各引物序列利用Gene Runner軟件設(shè)計(jì)并經(jīng)NCBI BLAST檢索無顯著同源性序列，引物設(shè)計(jì)合成：PEDF上游引物：5’-TCTGGGAGCTGAACATCGA-3’，下游引物：5’-GGGCAGTAACAGAGGCAAG-3’；MCP-1上游引物：5’-ACTGAAGCCAGCTCTCTCTTCCTC-3’，下游引物：5’-TTCCTTCTTGGGGTCAGCACAGAC-3’；β-actin上游引物：5’-CTTCTTTGCAGCTCCTTCGT-3’，下游引物：5’-GTGCCAGATCTTCTCCATGT-3’。采用SYBR green PCR試劑盒優(yōu)化反應(yīng)條件，使目的基因和管家基因的擴(kuò)增效率保持一致，接近于1。ABI Prism 7500-HT定量PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)完成后，軟件進(jìn)行自動數(shù)據(jù)分析，2-△△Ct表示目的基因相對表達(dá)量。每組8個樣品，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1PEDF對氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管的影響各組小鼠視網(wǎng)膜血管染色鋪片顯示，造模結(jié)束時(shí)(P17)，正常組小鼠視網(wǎng)膜血管呈放射狀自視盤發(fā)出，走形平滑自然，分支良好(圖1A)；OIR模型組和PBS治療對照組小鼠視網(wǎng)膜中央均出現(xiàn)程度不同的無血管化區(qū)及迂曲擴(kuò)張的放射狀新生血管叢，新生血管成簇或成團(tuán)分布(圖1B、C)；PEDF藥物治療組小鼠視網(wǎng)膜新生血管團(tuán)較PBS治療對照組明顯減少(圖1D)。統(tǒng)計(jì)分析顯示：正常組、OIR模型組、PBS治療對照組、PEDF藥物治療組病理性新生血管面積分別為1.055±0.163、8.538±0.975、6.860±1.397、2.306±0.984mm2，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=93.386，P<0.001)。OIR模型組、PBS治療對照組小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積較正常對照組都增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；PEDF藥物治療組小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積較PBS治療對照組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；正常組小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積與PEDF藥物治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.121，圖2)。

圖2各組小鼠視網(wǎng)膜新生血管面積的比較bP<0.01vs正常組；dP<0.01vsPBS治療對照組。

圖3Westernblot檢測正常組和OIR模型組視網(wǎng)膜PEDF和MCP-1蛋白表達(dá)量A：PEDF；B：MCP-1。

2.2氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中MCP-1、PEDF蛋白和mRNA的表達(dá)Western-blot檢測結(jié)果顯示，與正常組小鼠視網(wǎng)膜PEDF蛋白的相對表達(dá)量相比，OIR模型組小鼠視網(wǎng)膜PEDF 蛋白相對表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.82±0.44vs0.55±0.23，t=5.67，P<0.01，圖3A)。與正常組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1蛋白的相對表達(dá)量相比，OIR模型組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1蛋白相對表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.45±0.06vs0.88±0.10，t=5.61，P=0.04，圖3B)。

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與正常組小鼠視網(wǎng)膜PEDF mRNA的相對表達(dá)量比較，OIR模型組小鼠視網(wǎng)膜PEDF mRNA相對表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.27±0.03vs1，t=3.35，P<0.01，圖4A)。與正常組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1 mRNA的相對表達(dá)量比較，OIR模型組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1 mRNA相對表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.63±1.05vs1，t=4.43，P=0.046，圖4B)。

2.3PEDF對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中MCP-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響Western-blot檢測結(jié)果顯示，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.12，P<0.01)，PEDF藥物治療組MCP-1蛋白的相對表達(dá)量(0.30±0.15)較PBS治療對照組(0.78±0.11)顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PEDF藥物治療組MCP-1蛋白的表達(dá)量較正常對照組(0.28±0.10)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，正常對照組、PBS治療對照組、PEDF藥物治療組視網(wǎng)膜MCP-1 mRNA相對表達(dá)量分別為1、17.63±7.58、3.47±2.34，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.842，P=0.041)。PBS治療對照組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1 mRNA相對表達(dá)量較正常對照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)；PEDF藥物治療組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1 mRNA相對表達(dá)較PBS治療對照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.042)；正常對照組小鼠視網(wǎng)膜MCP-1 mRNA相對表達(dá)量與PEDF治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.707，圖6)。

圖4RT-PCR檢測正常組和OIR模型組視網(wǎng)膜PEDF和MCP-1mRNA相對表達(dá)量A：PEDF；B：MCP-1；aP<0.05，bP<0.01vsOIR模型組。

圖5Westernblot檢測各組視網(wǎng)膜MCP-1蛋白的相對表達(dá)量。

圖6RT-PCR檢測各組視網(wǎng)膜MCP-1mRNA相對表達(dá)量aP<0.05vsPBS治療對照組。

3討論

諸多致盲性眼病如年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央/分支靜脈阻塞和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等的病理基礎(chǔ)在于視網(wǎng)膜膜微血管異常，缺血缺氧致RNV形成[5-6]。越來越多的研究表明，PEDF在缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮重要作用[2,7]。同時(shí)關(guān)于炎癥趨化因子MCP-1在缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變中的作用也日漸顯現(xiàn)[8-10]，PEDF作為抑炎因子，兩者是否存在某種關(guān)聯(lián)尚未闡明。本研究通過建立OIR小鼠模型模擬缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變，再用重組PEDF玻璃體腔注射進(jìn)行干預(yù)，觀察PEDF對氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成及對炎癥因子MCP-1表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討PEDF對缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用。

PEDF最初是從胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出來的一種糖蛋白，具有營養(yǎng)神經(jīng)、抗炎等多種生物學(xué)作用而于近年來備受關(guān)注。既往研究證實(shí)PEDF具有促進(jìn)視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元生長和分化的功能[11]，同時(shí)還具有抑制視網(wǎng)膜、玻璃體和角膜血管形成的作用[12]。組織中高水平的PEDF還可以抑制缺血性視網(wǎng)膜病變中的細(xì)胞凋亡、抑制視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管的形成[13]。既往研究還發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜細(xì)胞產(chǎn)生PEDF的量與氧濃度呈正相關(guān)[14]，但其機(jī)制尚不清楚。研究顯示早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變患者玻璃體中PEDF蛋白表達(dá)水平較對照組明顯降低[15]。Notari等[16]利用動物和細(xì)胞模型證實(shí)缺氧顯著下調(diào)由色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生的PEDF，而這一過程是通過細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)介導(dǎo)的蛋白降解作用實(shí)現(xiàn)的，PEDF對于缺氧或血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的蛋白降解很敏感。PEDF的低表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)RNV的生成和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。本研究中OIR小鼠視網(wǎng)膜PEDF的表達(dá)較正常組明顯降低，同時(shí)病理性新生血管顯著增生，這與既往研究相一致。

在實(shí)驗(yàn)性糖尿病視網(wǎng)膜中，PEDF作為眼內(nèi)最強(qiáng)的抑炎因子之一，能夠減少促炎因子的表達(dá)[17]。而多種視網(wǎng)膜病變的病理過程往往有免疫炎癥因素參與。我們前期研究[18]表明，缺氧情況下PEDF可能通過下調(diào)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中白細(xì)胞介素1-β的表達(dá)，上調(diào)Müller細(xì)胞谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸/天冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(glutamate/aspartate transporter，GLAST)的表達(dá)，從而改善谷氨酸循環(huán)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)缺氧情況下PEDF可能通過下調(diào)視網(wǎng)膜白細(xì)胞介素1-β的表達(dá)，以抑制RNV的形成[3]。Park等[19]利用大量表達(dá)PEDF的轉(zhuǎn)基因小鼠制作OIR模型，研究發(fā)現(xiàn)氧誘導(dǎo)后的PEDF轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜RNV和視網(wǎng)膜炎癥因子較氧誘導(dǎo)后的野生小鼠明顯減少。在激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管模型中，與野生型小鼠相比，PEDF轉(zhuǎn)基因小鼠視網(wǎng)膜中炎癥因子、血管內(nèi)皮生長因子、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、MCP-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosises factor-α，TNF-α)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)mRNA表達(dá)明顯降低。其中趨化因子MCP-1具有趨化單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞聚集并激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的作用，其不僅是參與炎癥的重要因子，還參與正常血管的發(fā)育和病理性新生血管的形成[20]。糖尿病視網(wǎng)膜損傷中單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞聚集，促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展[21]。而且，玻璃體中MCP-1的表達(dá)水平與PDR的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[8]。Yoshida等[9]研究顯示，缺血性視網(wǎng)膜病變中MCP-1和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)與RNV形成有關(guān)，同時(shí)兩者還參與了炎癥反應(yīng)的過程。董寧等[10]研究證實(shí)，小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中始終伴隨著MCP-1的表達(dá)，MCP-1的表達(dá)上調(diào)可能與小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育和OIR模型中RNV的形成密切相關(guān)。本研究亦顯示OIR小鼠于17日齡時(shí)視網(wǎng)膜MCP-1蛋白與mRNA表達(dá)較正常組均上調(diào)。

結(jié)合PEDF的抗新生血管形成及其抑炎作用，那么缺血缺氧條件下PEDF能否抑制視網(wǎng)膜MCP-1的高表達(dá)？為此，本研究采用玻璃體腔注射的方法對OIR小鼠視網(wǎng)膜進(jìn)行PEDF干預(yù)，結(jié)果顯示其較PBS治療對照組MCP-1表達(dá)水平明顯降低、新生血管面積顯著減少，提示在缺血缺氧環(huán)境下，PEDF能夠抑制視網(wǎng)膜MCP-1的高表達(dá)，而且PEDF可能通過下調(diào)MCP-1的表達(dá)而減弱或抑制RNV的形成。既往研究顯示，與對照組病例相比，PDR患者和糖尿病黃斑水腫患者玻璃體中均有高水平的IL-6、MCP-1和VEGF蛋白表達(dá)量，而PEDF蛋白表達(dá)量則顯著下調(diào)[22-23]。同時(shí)在DR動物模型中，玻璃體腔注射低劑量的PEDF即可降低視網(wǎng)膜血管通透性，而且PEDF玻璃體腔注射組較對照組視網(wǎng)膜中炎癥因子VEGF、ICAM-1和MCP-1水平均有明顯的降低[17]，這與本研究結(jié)果一致?，F(xiàn)有研究證實(shí)葡萄膜炎患者房水中PEDF的表達(dá)水平亦與MCP-1密切相關(guān)[24]；在培養(yǎng)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，PEDF抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的活性氧生成以及后續(xù)MCP-1 mRNA和蛋白的高表達(dá)，而PEDF的替代物可以通過抑制晚期糖基化終產(chǎn)物的不利因素來抑制DR的發(fā)展進(jìn)程[25]。因此，缺血缺氧條件下，PEDF可能通過抑制MCP-1的表達(dá)從而減弱或抑制單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞聚集，最終發(fā)揮其抑制RNV形成的作用。

綜上，本研究利用OIR小鼠模型觀察了缺血缺氧環(huán)境下PEDF對RNV的形成和MCP-1表達(dá)的影響，證實(shí)了PEDF能夠下調(diào)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變中視網(wǎng)膜MCP-1的表達(dá)，這可能是其抑制RNV形成而發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用的機(jī)制之一。這為將來尋找RNV潛在治療靶點(diǎn)提供了新的思路。但本實(shí)驗(yàn)還存在一些缺陷，比如尚缺乏PEDF對MCP-1相關(guān)效應(yīng)細(xì)胞的影響以及MCP-1誘導(dǎo)RNV形成的直接證據(jù)，因此需要更深入的研究。