李典睿，周善璧

0引言

正常角膜無(wú)血管、透明、神經(jīng)豐富，為人眼屈光介質(zhì)的最外層，屈光能力最強(qiáng)。位于角膜表層的角膜上皮細(xì)胞層，因處于不斷脫落和更新的動(dòng)態(tài)平衡中，而維持角膜的透明性、屈光性和眼表的完整性，保障視功能完好。角膜上皮細(xì)胞的不斷更新，是由Vogt柵欄結(jié)構(gòu)區(qū)角膜緣基底層內(nèi)的角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells, LSCs)不斷增殖、分化、移行而來(lái)。LSCs為眼表穩(wěn)定提供了保障。感染、外傷、物理刺激等，引起LSCs受損、缺失，導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)。致使角膜結(jié)膜化、血管化、瘢痕化等，角膜透明度下降，甚至功能缺失。單眼LSCD可通過(guò)從健眼取材，對(duì)患眼行角膜緣干細(xì)胞移植治療。雙眼LSCD則需移植異體角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行治療。角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，為這些患者帶來(lái)了新的希望。

1角膜緣干細(xì)胞定位

角膜與不透明鞏膜相聯(lián)系的環(huán)形區(qū)域?yàn)榻悄ぞ?，Schermer在1986年首次證明了LSCs為位于角膜緣Vogt柵欄結(jié)構(gòu)區(qū)的角膜緣基底細(xì)胞。柵欄樣的上皮結(jié)構(gòu)為角膜緣隱窩，但該區(qū)域的干細(xì)胞較少。2005年，Dua等[1]通過(guò)對(duì)角膜切片的觀察研究，發(fā)現(xiàn)了Vogt柵欄結(jié)構(gòu)區(qū)中存在的一種極其少量的實(shí)性細(xì)胞條索，其內(nèi)所有細(xì)胞ABCG2呈陽(yáng)性。Dua等稱(chēng)該結(jié)構(gòu)為角膜緣上皮小囊 (limbal epithelial crypts，LECs)，同時(shí)認(rèn)為，LECs很可能是存儲(chǔ)LSCs的“龕”。之后的研究又發(fā)現(xiàn)，角膜緣中干細(xì)胞優(yōu)先出現(xiàn)在上緣和下緣。還發(fā)現(xiàn)OCT可以較好對(duì)Vogt柵欄進(jìn)行定位，但OCT耗時(shí)、且費(fèi)用較貴。為了培養(yǎng)時(shí)取材準(zhǔn)確、快速，Sigal等[2]通過(guò)對(duì)圓偏振光(circularly polarized light，CPL)進(jìn)行了研究。他們將樣本角膜緣以時(shí)鐘12∶00方向定位后，先用OCT進(jìn)行成像，定位Vogt欄桿區(qū)。再分別用線偏振光、圓偏振光照射成像。之后將三者的結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CPL的定位結(jié)果與OCT的結(jié)果相符。并用免疫標(biāo)記法標(biāo)記膠原蛋白Ⅶ，識(shí)別角膜上皮基底細(xì)胞的細(xì)胞膜，以進(jìn)一步驗(yàn)證CPL的定位結(jié)果。通過(guò)他們的研究顯示，CPL可以在以后的研究中或角膜緣干細(xì)胞移植時(shí)，快速、準(zhǔn)確地定位Vogt欄桿區(qū)，從而方便LSC的取材。

2角膜緣干細(xì)胞標(biāo)志物

若要分離出單個(gè)角膜緣干細(xì)胞，角膜緣干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物必不可少。而在過(guò)去的幾十年里，研究者們?yōu)榇烁冻隽嗽S多努力，并提出了許多可能成為特異性標(biāo)志物的生物因子，但仍沒(méi)能找出角膜緣干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等方法從干細(xì)胞的蛋白、胞漿、染色體、核糖體等，甚至細(xì)胞與細(xì)胞間、LSC周?chē)奈h(huán)境中尋找特異性的標(biāo)志物，并提出了許多可能成為標(biāo)志物的“候選人”。

2.1目前角膜緣干細(xì)胞的推定標(biāo)志物分類(lèi)目前角膜緣干細(xì)胞的推定標(biāo)志物分類(lèi)[3]:(1)細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白：細(xì)胞角蛋白K5/K14、細(xì)胞角蛋白15、細(xì)胞角蛋白19、波形蛋白(Vimentin)；(2)細(xì)胞黏附因子：整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α6、整合素α8、整合素α9、整合素αv、整合素β1、整合素β4、整合素β5、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、P-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白、Frizzled7；(3)細(xì)胞酶：α-烯醇化酶、細(xì)胞色素氧化酶、Na+/K+-ATP酶；(4)生長(zhǎng)因子及其受體：上皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGF-R)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)等；(5)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子：ΔNp63α；(6)ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG2)、ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5(ATP-binding cassette subfamily G member 2, ABCG5)；(7)分化相關(guān)標(biāo)志物：連接蛋白43(connexin 43, Cx43)、細(xì)胞角蛋白K3/12、外皮蛋白(Involucrin)。

2.2可能的新標(biāo)志物(1)基于RNA或mircoRNA的生物標(biāo)志物：在過(guò)去的生物醫(yī)學(xué)研究中，學(xué)者們已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到了二代測(cè)序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)，使得我們能夠獲得更多的有關(guān)RNA和mircoRNA的信息。近年，其他方面的研究，已報(bào)道了許多RNA水平的新的生物標(biāo)志物。Howlett等[4]通過(guò)對(duì)招募的24位符合條件的志愿者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈鈣化的評(píng)分>100的人與評(píng)分為0的人相比，miRNA8059顯著下調(diào)。所以他們認(rèn)為，miRNA8059可作為這一疾病外周血液中的生物標(biāo)志物。Shen等[5]運(yùn)用NGS技術(shù)，鑒定出了主動(dòng)脈夾層患者與非此病患者的主動(dòng)脈組織樣本中差異表達(dá)的miRNA,再對(duì)這些miRNA進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。最后研究結(jié)果表明，has-miR-320d和has-miR-582可作為主動(dòng)脈夾層的生物標(biāo)志物。由此，我們可以看出，基于RNA或mircoRNA的新的生物標(biāo)志物的研究，為L(zhǎng)SCs的特異性標(biāo)志物研究，提供了新的方向。(2)Wnt信號(hào)通路中的傳導(dǎo)介質(zhì)：Wnt信號(hào)通路廣泛存在于多種生物體內(nèi)，并在調(diào)節(jié)干細(xì)胞的自我更新中發(fā)揮著重要作用。其家族成員存在于多種組織中，進(jìn)化上具有高度保守性。從低等動(dòng)物到高等動(dòng)物中，具有高度的同源性。Wnt信號(hào)通路分為：經(jīng)典Wnt通路(β-catenin依耐性通路)、非經(jīng)典Wnt通路(β-catenin非依耐性通路)。對(duì)經(jīng)典Wnt通路的研究更多，這一信號(hào)通路中所產(chǎn)生的蛋白降解復(fù)合物，其可磷酸化β-catenin，使之降解。若蛋白降解復(fù)合物不產(chǎn)生或被解聚，則增多的β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，最終激活下游靶基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化等。非經(jīng)典通路由于激活信號(hào)通路的受體不同而不同，種類(lèi)繁多、復(fù)雜，常見(jiàn)有Wnt/Ca通路、Wnt/JNK通路等。Nakatsu等[6]研究發(fā)現(xiàn)不同的Wnt信號(hào)相關(guān)基因優(yōu)先在人角膜緣或角膜中表達(dá)，并且在調(diào)節(jié)LSCs增殖中起重要作用。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Wnt2，Wnt6，Wnt11和Wnt16b在角膜緣處優(yōu)先表達(dá)。Wnt通路中的傳導(dǎo)介質(zhì)也已開(kāi)始作為L(zhǎng)SCs的標(biāo)志物使用。

3干細(xì)胞來(lái)源

雙眼LSCD患者，無(wú)足夠的自體LSCs取材，供體細(xì)胞缺乏，這迫使研究者們尋找新的細(xì)胞來(lái)源。目前的研究，已提供了不少新的細(xì)胞來(lái)源，如胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、口腔黏膜上皮細(xì)胞等。這些細(xì)胞為雙眼LSCD的眼表重建，提供了新的細(xì)胞來(lái)源。而研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還有更多、更好的選擇，等待學(xué)者們發(fā)現(xiàn)。

(1)皮下脂肪組織：由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[7](bone mesenchymal stem cells, BMSCs)可考慮成為新來(lái)源，而皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue, AT)更容易獲得。所以Nieto-Miguel等[8]由此研究了人類(lèi)皮下脂肪組織體外衍生的MSCs(human AT-derived MSCs, hAT-MSCs)。他們從人體抽脂后分離出hAT-MSCs，擴(kuò)展3～4代后，分別于塑料及膠原蛋白Ⅳ基質(zhì)上培養(yǎng)。培養(yǎng)15d后通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β受體CD105、角膜上皮標(biāo)志物細(xì)胞角蛋白K12的表達(dá)增加。并認(rèn)為hAT-MSCs可以成為一種新的、較BMSCs更易獲得的干細(xì)胞來(lái)源。(2)牙髓干細(xì)胞：牙髓干細(xì)胞是來(lái)源于牙髓腔的干細(xì)胞，有自我更新能力和具有多分化的潛能。其與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有很相似的免疫表型，在一定條件下可分化為骨、軟骨、肌細(xì)胞等。牙髓干細(xì)胞易獲得、來(lái)源廣，目前組織工程學(xué)等，已將牙髓干細(xì)胞運(yùn)用于骨組織修復(fù)、神經(jīng)組織修復(fù)、循環(huán)系統(tǒng)功能的改善等方面。Gomes等[9]將牙髓干細(xì)胞片，移植入兔眼角膜燒傷模型角膜床中，3mo后觀察，發(fā)現(xiàn)兔眼角膜的透明度有所好轉(zhuǎn)。Kushnerev等[10]則將用綠色熒光Qtracker525標(biāo)記的牙髓干細(xì)胞接種到已預(yù)處理的角膜接觸鏡上，并以角膜接觸鏡為載體，將牙髓干細(xì)胞移植到已清創(chuàng)的患者角膜上。之后觀察發(fā)現(xiàn)牙髓干細(xì)胞在植床上分化出角膜上皮祖細(xì)胞。這一研究說(shuō)明，牙髓干細(xì)胞可用于人角膜上皮的修復(fù)和再生，可能替代角膜緣干細(xì)胞成為新的干細(xì)胞移植來(lái)源。

4角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)載體

在進(jìn)行LSCs體外培養(yǎng)時(shí)，需要有安全、可靠的載體。載體的選擇及優(yōu)化是LSCs移植的一大研究熱點(diǎn)。

4.1目前的培養(yǎng)載體分類(lèi)(1)生物材料：羊膜、膠原、胎鼠3T3細(xì)胞、脫細(xì)胞角膜基質(zhì)、絲素蛋白等；(2)人工合成材料：纖維蛋白凝膠、聚乳酸羧基乙酸、改良的聚二甲基硅氧烷等；(3)復(fù)合材料：膠原硫酸軟骨素共混膜、聚乙烯醇-膠原、膠原結(jié)合羊膜等。

4.2新培養(yǎng)載體(1)新生物材料：1)人臍帶襯里細(xì)胞：胎鼠3T3細(xì)胞為一常用生物載體，但鼠緣性飼養(yǎng)細(xì)胞，可產(chǎn)生乙醇甘露糖胺丙酮酸(Neu5Gc)，這些細(xì)胞用于人體后，會(huì)激發(fā)人的免疫排斥反應(yīng)，殺死外源性細(xì)胞[11]。Leonard等[12]在PTTe-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)人臍帶襯里細(xì)胞(human umbilical cord lining cells, CLEC-muc)，并用絲裂霉素C處理后，作為新的角膜緣干細(xì)胞培養(yǎng)載體。同一培養(yǎng)系統(tǒng)中,發(fā)現(xiàn)CLEC-muc作為載體所培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞，同胎鼠3T3細(xì)胞作為載體培養(yǎng)的干細(xì)胞比較，同樣表達(dá)了ABCG2等LSC相關(guān)標(biāo)志物。他們認(rèn)為人類(lèi)的CLEC-muc可能成為胎鼠3T3細(xì)胞的合適替代品。2)非桑蠶絲：非桑蠶絲具有可控降解性和生物相容性。其轉(zhuǎn)變?yōu)樯锊牧系难芯繒r(shí)間雖短，但其承載能力和拉伸強(qiáng)度，已可用于骨、軟骨、脂肪和其他組織的再生[13]?？紤]到非桑蠶絲的這些優(yōu)點(diǎn)，Hazra等[14]進(jìn)行了對(duì)非桑蠶絲膜作為角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)載體的研究，發(fā)現(xiàn)這一支架不僅易于處理，且大鼠角膜上皮細(xì)胞等能在這一載體上發(fā)芽、遷移、附著、生長(zhǎng)成片，并表達(dá)了細(xì)胞角蛋白K3、波形蛋白等LSCs相關(guān)標(biāo)志物。這表示非桑蠶絲能支持LSCs的增長(zhǎng)，成為新的LSCs培養(yǎng)載體。3)魚(yú)鱗膠原：Krishnan等[15]對(duì)魚(yú)鱗膠原進(jìn)行了研究，以其為載體培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞，與羊膜載體進(jìn)行比較。觀察后發(fā)現(xiàn)，魚(yú)鱗膠原透明度好，作為支架較羊膜物理強(qiáng)度更佳、上皮細(xì)胞增長(zhǎng)率更高。同時(shí)，魚(yú)鱗膠原作為支架所培養(yǎng)的干細(xì)胞P63、ABCG2陽(yáng)性。該研究認(rèn)為魚(yú)鱗膠原有望成為新的干細(xì)胞培養(yǎng)支架。(2)新人工合成材料：納米纖維：Biazar等[16]將LSCs分別種植并培養(yǎng)于羊膜及納米纖維墊上，在培養(yǎng)第1、3、15d進(jìn)行觀察、比較。發(fā)現(xiàn)納米纖維的生物相容性良好，所培養(yǎng)出的干細(xì)胞ABCG2、P63、細(xì)胞角蛋白K2、細(xì)胞角蛋白K13陽(yáng)性，與羊膜上培養(yǎng)的LSCs相比，細(xì)胞表達(dá)譜無(wú)變化。所以他們認(rèn)為，納米纖維可以成為羊膜的良好替代品。(3)新復(fù)合材料：絲素蛋白/殼聚糖支架：絲素蛋白由蠶所吐絲獲得，具有良好的韌性。殼聚糖則與人體內(nèi)的黏多糖生物性質(zhì)相似，具有良好的生物相容性。兩者在既往研究中可分別作為L(zhǎng)SCs的培養(yǎng)支架。由于兩者各有優(yōu)點(diǎn)，后有研究提出，將兩者以一定比列混合，構(gòu)成新的復(fù)合材料，是更為理想的支架[17]。Kim等[18]的研究中，將絲素蛋白/殼聚糖支架中殼聚糖的質(zhì)量調(diào)整為5%，認(rèn)為在此比例時(shí)，支架具有良好的透明度。Fedotov等[19]則能將絲素蛋白及殼聚糖通過(guò)3D打印技術(shù)以任意的比例進(jìn)行制備。由此可見(jiàn)，絲素蛋白/殼聚糖支架的未來(lái)可期。

5展望

1997年，Pellegrini等[20]從2例單眼嚴(yán)重堿燒傷患者的健眼角膜緣取材，體外培養(yǎng)后，移植到這2例患者的患眼上，重建其眼表。移植物在隨后2a的隨訪中表現(xiàn)穩(wěn)定。這是再生醫(yī)學(xué)在眼科領(lǐng)域應(yīng)用的第一批例子之一。2004年角膜緣干細(xì)胞移植在意大利成為患者的常規(guī)治療，并由國(guó)家衛(wèi)生系統(tǒng)報(bào)銷(xiāo)。2008年在印度被接受。而在美國(guó)，由于監(jiān)管要求停止此項(xiàng)治療[21]。2015年，Holocar藥物成為歐盟批準(zhǔn)的首個(gè)干細(xì)胞高級(jí)療法[22]。由此可見(jiàn)，通過(guò)體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行移植，從而重建眼表，是很有實(shí)現(xiàn)商品化發(fā)展前景的，這將造福于更多的患者。但從各個(gè)國(guó)家對(duì)這一技術(shù)的態(tài)度中我們也能看出，在初次證明原理之后，我們還需要很長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)研究，如何控制穩(wěn)定再生的機(jī)制、是否有充足的細(xì)胞來(lái)源、完善培養(yǎng)的流程等，并在制造過(guò)程中實(shí)現(xiàn)高重復(fù)性。同時(shí)，我們也面對(duì)著如何選擇患者，如何處理復(fù)雜眼表情況，如何減少異體移植排斥等問(wèn)題。隨著科技的進(jìn)步，學(xué)者們研究的更為深入，角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)的使用會(huì)越來(lái)越規(guī)范，應(yīng)用越來(lái)越廣闊。