劉 菁，宮美鳳，張立臣，黎宇翔

（北京航空航天大學(xué) 體育部，北京 100191）

羊肚菌是當(dāng)前被認(rèn)為是具備美味且珍稀性的食用菌。通過近年來有關(guān)研究學(xué)者的發(fā)現(xiàn)，羊肚菌能夠提升人體的免疫力，抗衰老，抗疲勞等，具有重要保健功效。隨著當(dāng)前社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提升以及人們生活質(zhì)量要求提升，同時(shí)，生活節(jié)奏的加快，使得人們出現(xiàn)了疲勞過度或者體力透支，身體抵抗力降低的問題。進(jìn)一步導(dǎo)致在實(shí)際工作過程中工作效率降低，身體受到嚴(yán)重的健康威脅。因此，人們?cè)絹碓街匾暱蛊诤捅＝∑返陌l(fā)展。它分為單個(gè)組分，如細(xì)胞外多糖、細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)，細(xì)胞內(nèi)多糖等、并可在緊急攝入小鼠中的不同成分后確定。身體在運(yùn)動(dòng)過程中產(chǎn)生抗疲勞，并延長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力的相關(guān)效果。通過研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)多糖羊肚菌細(xì)胞外多糖具有顯著的抗疲勞作用。該結(jié)果能夠?yàn)橹筢t(yī)學(xué)行業(yè)研發(fā)羊肚菌多糖抗疲勞保健品，提供重要參考。

近年來，許多研究學(xué)者都重視了羊肚菌的重要價(jià)值。其中，孫曉明在負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)中觀察了小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間、血清尿素氮、血乳酸等生理指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于羊肚菌子實(shí)體粉能夠延長(zhǎng)其運(yùn)動(dòng)時(shí)間，減少血乳酸的水平和血清尿素氮水平，它可以增加肝糖原的量，并表現(xiàn)出更好的抗疲勞作用。段玉鶴等結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羊肚菌的胞內(nèi)外多糖能夠從一定程度上延長(zhǎng)小鼠的運(yùn)動(dòng)時(shí)間，具有計(jì)量依賴性。通過大量的藥理研究證明，羊肚菌具有良好的抗疲勞效果，可以通過現(xiàn)代工藝技術(shù)將其制為保健品，延緩人們的抗疲勞對(duì)改善生活質(zhì)量具有重要意義。在本文中我們基于段巍鶴等人的研究成果，對(duì)羊肚菌藥理活性對(duì)緩解運(yùn)動(dòng)應(yīng)急性疲勞的應(yīng)用進(jìn)行深入分析。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

首先，段義和等人選擇的菌株。使用的試劑是小鼠抗Motus單抗，其經(jīng)過初步腹水處理，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體，其購(gòu)自北京生物技術(shù)有限公司，由美國(guó)sigma公司購(gòu)買一些所需的試劑，包括PDA液體培養(yǎng)基，其具體成分為200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 g磷酸二氫鉀、0.5 g硫酸鎂、3 g蛋白胨，加水至1mL體積并消毒20 min。所有其他試劑均購(gòu)自國(guó)家公司的分析試劑。在研究中所使用的儀器有恒溫振蕩培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，酶標(biāo)儀，紫外分光光度計(jì)，超聲破碎儀，電泳槽。

研究方法上，首先需要活化群種，并對(duì)菌種進(jìn)行鑒定和擴(kuò)大培養(yǎng)。在菌株的活化中，將菌株的試管傾斜在無菌操作臺(tái)中培養(yǎng)到無菌培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)基在PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在23℃下培養(yǎng)1周，以獲得羊肚菌的菌絲體培養(yǎng)物。其次，進(jìn)行菌絲鑒定，并通過加入一定量的無菌生理鹽水和海砂將取適量培養(yǎng)物得到的菌絲培養(yǎng)半小時(shí)。然后，將研磨液倒入離心管中，以300 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液進(jìn)行抗原檢測(cè)。研磨后得到的抗原分別用緩沖液稀釋，梯度控制在5倍和10倍。在12孔酶標(biāo)儀上其中1到4孔可以利用5倍稀釋抗原，第5孔為 PBS緩沖液對(duì)照，6至10個(gè)孔是10倍抗原稀釋液，11個(gè)孔是羊肚菌陽性抗原對(duì)照，12個(gè)孔是空白對(duì)照。依次向各個(gè)酶標(biāo)孔中加入100 μL的50倍稀釋的單抗體，常溫孵育1h之后分別用 PBS洗滌三次，甩干之后向各個(gè)孔加入100 μL經(jīng)過2 000倍稀釋的 HRP羊抗鼠抗體，常溫孵育1h之后再用 PBS洗滌3次，干燥后，向每個(gè)孔中加入100 μL底物，避免在黑暗中15 min。通過酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)孔中的OD值以實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增的培養(yǎng)。經(jīng)過上一步的研究，檢測(cè)，便能夠鑒定羊肚菌的菌絲?？稍跓o菌工作站上將其轉(zhuǎn)移至含有無菌PDA培養(yǎng)液的100 μL三角燒瓶中。用密封膜密封，置于21℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，并以115 r·min-1溫育5 d。并做好標(biāo)記，收集菌絲培養(yǎng)物的培養(yǎng)液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。提取羊肚菌和細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)和胞外多糖。首先，當(dāng)提取羊肚菌的胞外多糖時(shí)，我們選擇300 mL過濾并離心，并將無菌菌培養(yǎng)液置于50℃恒溫?cái)嚢柘?。將體積濃縮為150 mL，采取sevage的方法去除菌絲中的蛋白，將去蛋白后的培養(yǎng)液加入三倍體積中的乙醇溶液中，置于零下20℃進(jìn)行蛋白沉淀，24 h會(huì)析出絮狀白色物。經(jīng)過離心，其條件為400 r·min-1，離心20 min獲得白色沉淀，加入50 mL溶菌水，進(jìn)行溶解，并在50℃的水浴鍋中除去乙醇獲得胞外多糖。在提取胞內(nèi)多糖時(shí)，經(jīng)過液體培養(yǎng)的菌絲利用蒸餾水洗滌兩次，并獲得菌絲沉淀物，對(duì)沉淀按照比例50∶1加入去離子水，置于85℃恒溫水浴中2 h，離心后除去羊肚菌絲。離心之后將上清液置于50℃的恒溫水鍋中，使體積濃縮為一半。離心去沉淀，上清沉淀處理方法與胞外多糖的處理方法一致，能夠獲得胞內(nèi)多糖，并進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。在提取細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)時(shí)，采用液體培養(yǎng)得到的羊肚菌菌絲，用蒸餾水洗滌2次，用超聲波破碎菌絲體。將其功率設(shè)置為180 W，破碎條件為每破碎10 s，間隔15 min，循環(huán)破碎30次，利用冰塊快速降溫的方法或者停機(jī)操作，避免破碎液溫度較高。同時(shí)，在菌絲完全破碎后，也可以通過光學(xué)顯微鏡檢查，并將上清液離心。上清液是羊肚菌細(xì)胞內(nèi)相中的活性物質(zhì)，并在下一步中研究。

測(cè)定葡萄糖濃度曲線以及多糖濃度。在該研究中，苯酚硫酸法可用于測(cè)定溶液中多糖的濃度。每個(gè)需要100 mL每毫升葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和6%苯酚溶液100 mL。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別取0、0.2 mL、0.4 mL。將0.6 mL、0.8 mL和1 mL置于相應(yīng)的管中，并加入蒸餾水至體積為2 mL。加入1 mL 6%苯酚溶液并充分混合后，加入2 mL濃硫酸，再在沸水浴中加熱反應(yīng)15 min。將其放于冰塊中快速冷卻，以空白設(shè)計(jì)作為對(duì)照。使用1 cm比色皿在490 nm的波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。根據(jù)線性范圍，我們對(duì)樣品濃度進(jìn)行調(diào)整，進(jìn)而檢測(cè)樣品的吸光值。由線性方程獲得所測(cè)樣品中的多糖濃度，為了能夠進(jìn)一步明確羊肚菌中包內(nèi)胞外多糖以及胞內(nèi)活性物質(zhì)，有效緩解疲勞作用濃度。我們選擇8只ICR成年小鼠稱重，然后將它們分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并在實(shí)驗(yàn)組中包括3組。胞內(nèi)多糖，胞外多糖，胞內(nèi)活性物質(zhì)這三個(gè)組，每組共計(jì)2只小鼠。將上述組份提取液分別配制為多糖濃度為14.4 mg·mL-1的溶液，以蒸餾水作為對(duì)照組。給小鼠腹部空腹后，每只小鼠需要注入1 mL的液體。測(cè)量小鼠游泳時(shí)間，比較不同組分和對(duì)照組中不同濃度多糖對(duì)游泳時(shí)間的影響。并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行下一步多糖濃度的檢測(cè)。

測(cè)定羊肚菌中胞內(nèi)多糖，胞外多糖，胞內(nèi)物質(zhì)在抗疲勞上的作用。選擇20只經(jīng)過1 d斷食之后的成年ICR小鼠對(duì)其進(jìn)行稱重，將其平均分為4組，每組共計(jì)5只小鼠，可以將其分為對(duì)照組，胞外多糖，胞內(nèi)活性物質(zhì)組。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所確定具有顯著提高運(yùn)動(dòng)時(shí)間的胞內(nèi)外多糖組，胞內(nèi)活性物質(zhì)組所灌注的多糖濃度，空腹灌胃之后，每只小鼠需要灌注1 mL，測(cè)定每只小鼠游泳時(shí)間，最后將所得數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素分析。

2 研究結(jié)果

首先，需要對(duì)菌株的ELISA進(jìn)行間接鑒定。通過試驗(yàn)我們可以知道經(jīng)過活化培養(yǎng)之后的羊肚菌絲經(jīng)過破碎處理后，做ELISA時(shí)，通過5倍和10倍稀釋，P/N值均大于2.1為陽性。在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中陽性，陰性對(duì)照組成立，進(jìn)一步說明經(jīng)過活化培養(yǎng)之后，我們所獲得的菌絲確定是羊肚菌菌絲。用水提法所獲得的多糖濃度測(cè)定結(jié)果如上表所示。初步選擇羊肚菌胞內(nèi)外多糖以及胞內(nèi)活性物質(zhì)，抗疲勞作用的最佳濃度。我們可以通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)小鼠灌胃液多糖濃度為14 mg·mL-1時(shí)，相比于多糖濃度為4 mg·mL-1，小鼠游泳時(shí)間明顯增加。與在對(duì)羊肚菌保內(nèi)外多糖以及胞內(nèi)活性物質(zhì)抗疲勞作用進(jìn)行分析時(shí)，我們可以通過數(shù)據(jù)可知，胞外多糖組相比對(duì)照組來說具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明胞外多糖組與對(duì)照組的小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)時(shí)間比較具有顯著差異，而胞內(nèi)多糖組與對(duì)照組相比也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但胞內(nèi)活性物質(zhì)與對(duì)照組相比，小鼠游泳時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 羊肚菌藥理活性緩解運(yùn)動(dòng)的應(yīng)急性疲勞分析

根據(jù)很多研究學(xué)者的發(fā)現(xiàn)，我們分析羊肚菌的發(fā)酵液中多糖與體內(nèi)多糖溶液，在應(yīng)急攝入之后，小鼠的游泳時(shí)間相比對(duì)照組來說具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明這種多糖溶液能夠提升應(yīng)激性抗疲勞作用。當(dāng)羊肚菌的胞內(nèi)多糖和胞外多糖濃度控制為14 mg·mL-1時(shí)，此時(shí)可以從一定程度上延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間。在相同狀態(tài)下，高濃度的羊肚菌多糖，相比低濃度的羊肚菌多糖來說能夠明顯延長(zhǎng)小鼠的游泳運(yùn)動(dòng)時(shí)間。但相比來說，胞內(nèi)物質(zhì)與對(duì)照組的小鼠進(jìn)行游泳時(shí)間比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果也說明了影響小鼠應(yīng)激性抗疲勞的主要是羊肚菌的胞內(nèi)外多糖，而胞內(nèi)活性物質(zhì)中含有與胞內(nèi)多糖抗疲勞性相互拮抗的有效成分。然而針對(duì)該機(jī)理還需要后續(xù)進(jìn)行深入探索，通過上述的研究也進(jìn)一步驗(yàn)證了羊肚菌中的多糖能夠明顯提升應(yīng)急性抗疲勞，具有一定的保健功能。我們所采用小鼠游泳實(shí)驗(yàn)是在相關(guān)研究基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行一次性應(yīng)急灌喂，而這種方法能夠獲得直觀數(shù)據(jù)，并且在對(duì)抗疲勞保健品使用上具有一定的指導(dǎo)意義。該研究所采用的方法能夠?yàn)橹笱芯繎?yīng)急性抗疲勞作用，保健品研發(fā)提供參考依據(jù)。根據(jù)之前的文獻(xiàn)，在上述研究中采用了免疫學(xué)檢測(cè)對(duì)不同菌絲進(jìn)行菌落鑒定，進(jìn)而能夠提高結(jié)果的可靠性，同時(shí)所獲得的應(yīng)急性灌胃小鼠游泳時(shí)間相比羊肚菌多糖抗疲勞程度來說，這一結(jié)果更具有可靠性。然而，我們分析該結(jié)構(gòu)可能與所研究使用的菌種長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)，菌絲活性，多糖組分含量有一定的相關(guān)性。

4 結(jié)語

總而言之，羊肚菌是一種珍貴的藥用真菌，具有良好的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值，在食品，保健，醫(yī)療方面具有廣闊的市場(chǎng)應(yīng)用前景。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)羊肚菌中含有多種化學(xué)成分，包括多糖，酶，有機(jī)酸，氨基醇等。隨著研究技術(shù)的發(fā)展，研究人員應(yīng)當(dāng)致力于羊肚菌物質(zhì)和分離純化活性單體，創(chuàng)新藥理實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明羊肚菌具有良好的免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞性能。在后續(xù)研究中，應(yīng)當(dāng)針對(duì)羊肚菌的藥理活性機(jī)制展開深入的探索，能夠?yàn)樾滦退幬镅邪l(fā)提供方向。除此之外，由于當(dāng)前還無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；娜斯ぴ耘啵虼诉€需要進(jìn)一步加快規(guī)?；斯づ囵B(yǎng)羊肚菌的力度。