金圣榆 葛麗特,2 綜述 盧明審校

阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種由多種因素引起，病理機(jī)制復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變?；颊叩呐R床表現(xiàn)以認(rèn)知功能障礙持續(xù)性惡化為主。最新研究結(jié)果表明，以下4個因素是AD的主要發(fā)病機(jī)制：（1）神經(jīng)元內(nèi)的微管相關(guān)蛋白— tau蛋白的過度磷酸化，導(dǎo)致微管塌陷并聚集成神經(jīng)原纖維纏結(jié)；（2）淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP） 的C 末 端（C-terminal fragment，CTF）被β-分泌酶和γ-分泌酶水解后生成β淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ），沉積成淀粉樣斑塊[1]；（3） 在慢性炎癥環(huán)境下，具有清除Aβ作用的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活為M1表型，吞噬能力下降，同時在Aβ的刺激下分泌IL-1β等大量促炎因子，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞，造成神經(jīng)元變性壞死；（4）大量神經(jīng)元的死亡和神經(jīng)突觸喪失。相關(guān)治療藥物只能在AD的早期起到延緩疾病發(fā)展進(jìn)程，改善小部分功能障礙，減輕相關(guān)臨床癥狀的作用，卻沒有辦法遏制AD的進(jìn)一步發(fā)展與惡化[2-3]。近幾年來，多項(xiàng)研究顯示，移植間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）對于AD的幾種病理機(jī)制都有不同程度的改善與緩解。而最新的研究結(jié)果表明，MSCs分泌的一種含有微小核糖核酸（microRNA，miRNA）的囊泡，即外泌體，很可能是相關(guān)療效的機(jī)制所在[4]。

一、MSCs外泌體的生物學(xué)特性

外泌體是一種在現(xiàn)階段已知的直徑最小的外分泌囊泡，體內(nèi)所有細(xì)胞幾乎都能分泌外泌體，包括在腦脊液、黏膜分泌液和血液等多種體液中[5]。外泌體可以作為載體將mRNA和miRNA從來源細(xì)胞轉(zhuǎn)載到遠(yuǎn)端受體細(xì)胞內(nèi)。這是一種新的信號傳遞方法，主要通過調(diào)控受體細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)，影響相關(guān)蛋白質(zhì)的合成和表達(dá)，從而發(fā)揮不同效應(yīng)[6]。

MSCs外泌體在臨床應(yīng)用中具有多種方式，例如RNA干擾（RNAi）治療、藥物傳輸，以及作為疾病的生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)志[7]。MSCs外泌體能夠產(chǎn)生類似于來源MSCs的再生與修復(fù)潛能，這一功能己經(jīng)在各種疾病模型中得到證實(shí)。MSCs外泌體能有效降低平均肺動脈，抑制肺部炎性細(xì)胞浸潤，還可以減少心肌梗死的面積，改善再灌注的損傷[8]；同時還能降低炎性因子TNF-α的表達(dá)，起到避免組織的炎性反應(yīng)及抗凋亡作用[9]。

在查閱相關(guān)文獻(xiàn)后，總結(jié)出外泌體能通過促進(jìn)抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能、加強(qiáng)Aβ降解、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突生長等，從以上這些方面，針對AD的幾項(xiàng)核心病理機(jī)制來發(fā)揮其治療效用，起到延緩疾病進(jìn)程的作用。另外，MSCs外泌體用于治療AD具有以下優(yōu)勢：（1）作為無細(xì)胞制劑，不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)；（2）不存在倫理矛盾等問題[10]；（3）性質(zhì)更穩(wěn)定，易于保存，便于管理及運(yùn)輸；（4）外泌體的直徑小，能順利通過血腦屏障，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接產(chǎn)生效用；（5）擁有的各項(xiàng)生物學(xué)功能不會因?yàn)榧?xì)胞繁殖傳代而失去效用[11-12]。這些特點(diǎn)都使得MSCs外泌體成為一種有著巨大潛力的治療AD新方法。

二、MSCs外泌體在AD治療中的應(yīng)用

（一）MSCs外泌體的免疫調(diào)節(jié)/抗炎作用

MSCs外泌體能夠通過緩解病理異常區(qū)域的炎癥反應(yīng)來改善神經(jīng)功能。有研究表明MSCs外泌體在神經(jīng)損傷動物模型中具有治療效果，并能明顯改善模型動物的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力和空間學(xué)習(xí)能力。Cui等[13]將預(yù)先用低氧環(huán)境處理的MSCs通過超速離心的方式獲取其外泌體，將收集的外泌體從尾靜脈注入雙轉(zhuǎn)基因AD模型大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這些外泌體能夠使促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1的表達(dá)下調(diào)，而同時抗炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10的表達(dá)上調(diào)，使AD模型大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力得到明顯提高。而Chen等[14]在另一個實(shí)驗(yàn)研究中，提取了骨髓MSCs外泌體，純化后將外泌體加入包括單核細(xì)胞在內(nèi)的血液微環(huán)境中，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)外周血所處環(huán)境中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1的含量明顯減少，而生長轉(zhuǎn)化因子以及包括IL-4、IL-10在內(nèi)的抗炎細(xì)胞因子含量顯著增加；進(jìn)一步檢驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，加入MSCs外泌體后血液中的抗炎型輔助T細(xì)胞—Th2型大幅度增加。

淋巴細(xì)胞有抗炎型與促炎型之分，在與MSCs外泌體共培養(yǎng)后，抗炎型淋巴細(xì)胞所占比例明顯增加，同時淋巴細(xì)胞的增殖速度大幅下降，從而能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[15]。巨噬細(xì)胞與MSCs外泌體共培養(yǎng)后，分泌抗炎性細(xì)胞因子的能力大幅度提高，同時向抗炎型細(xì)胞（M2型細(xì)胞）分化的比例明顯上升。Li等[16]將人臍帶MSCs外泌體加入了巨噬細(xì)胞炎性環(huán)境中共培養(yǎng)后，檢測到抗炎細(xì)胞因子的濃度明顯提高，而促炎細(xì)胞因子含量較前大幅減少。這一結(jié)論也在嚴(yán)重?zé)齻Ｐ痛笫髮?shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步證實(shí)。經(jīng)過MSCs外泌體處理后，燒傷模型大鼠血清中促炎因子TNF-α和IL- 1β的含量減少，而具有抗炎效果的IL-10濃度升高，才能夠減緩燒傷引起的炎癥反應(yīng)[17]。這些研究結(jié)果表明，MSCs外泌體能在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生明顯抗炎作用，減輕由于Aβ沉積產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，避免神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，達(dá)到減緩病程進(jìn)展的效果。

（二）MSCs外泌體促進(jìn)Aβ降解

MSCs外泌體對于治療AD有效果的另一種原因是能通過幾種不同方式減少體內(nèi)沉積的Aβ。Yuyama等[18]發(fā)現(xiàn)減少中性鞘磷脂酶-2（neutral sphingomyelin-2，nSMase2）的含量可以降低AD患者病理性細(xì)胞的分泌功能，通過拮抗nSMase2的合成，使得病理性外泌體減少，最終達(dá)到降低腦中Aβ含量的目的。他們的另一個實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，減少nSMase2能同時抑制鞘磷脂向神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)化，側(cè)面升高鞘磷脂含量，進(jìn)而促進(jìn)正常神經(jīng)元的外泌體分泌，這些外泌體能促進(jìn)淀粉樣蛋白沉積斑塊也就是Aβ沉積物發(fā)生構(gòu)象變化，轉(zhuǎn)變?yōu)閷δX組織沒有毒副反應(yīng)的纖維組織[19]。周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞將這些纖維組織攝取后，胞內(nèi)的溶酶體就進(jìn)行分化降解，最終使Aβ的含量減少。而MSCs外泌體的存在能促進(jìn)整個降解過程的加速運(yùn)轉(zhuǎn)[18]。

Yuyama等[20]在實(shí)驗(yàn)中，將SMS2的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）序列轉(zhuǎn)入正常神經(jīng)元后，檢測到神經(jīng)元外泌體分泌增加，Aβ清除量增加，達(dá)到了延緩AD病程進(jìn)展的效果。同時外泌體表面富含鞘糖脂，能促進(jìn)Aβ與外泌體相互結(jié)合，擁有這一特性使得外泌體能夠成為Aβ有效的吸附載體，加速移除體內(nèi)的Aβ。有研究發(fā)現(xiàn)，在正常人體內(nèi)，腦組織中最能有助于分解吸收Aβ的其中之一是被命名為腦啡肽的酶[21]。實(shí)驗(yàn)表明，向高表達(dá)Aβ相關(guān)蛋白的AD模型細(xì)胞所處環(huán)境中加入脂肪MSCs外泌體后，細(xì)胞內(nèi)與周邊環(huán)境中能檢測到的Aβ含量明顯下降，而脂肪MSCs外泌體的特點(diǎn)之一是富含有超過平均水平的腦啡肽酶[22]。這一結(jié)果表明脂肪MSCs外泌體在分解Aβ方面能發(fā)揮重要作用，而Aβ沉積正是AD病理改變的核心機(jī)制之一，體現(xiàn)了MSCs外泌體治療AD的潛能。

（三）MSCs外泌體保護(hù)神經(jīng)元和突觸/促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長

Mariana等[23]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MSCs及其外泌體能夠保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元和相關(guān)突觸，避免受到Aβ沉積所產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的損傷。Cui等[13]通過總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測MSCs外泌體可能通過改善損傷突觸的功能以及損傷部位的免疫調(diào)控達(dá)到改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。另一實(shí)驗(yàn)表明，MSCs外泌體同神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)膜融合后，能將攜帶的miR-133b轉(zhuǎn)入神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突修復(fù)生長，減輕造模產(chǎn)生的神經(jīng)損傷。同時MSCs外泌體內(nèi)富含miR-17-92，外源性增加含量，可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞生成和軸突生長。在短暫性腦缺血小鼠模型中，靜脈注射高表達(dá)miR-17-92的外泌體后，與注射普通MSCs外泌體相比，能增強(qiáng)神經(jīng)元的可塑性、軸突生長的速度，達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的效果[24]。

Chen等[25]研究結(jié)果顯示，脂肪MSCs外泌體內(nèi)含有豐富的神經(jīng)因子能促進(jìn)功能受損的腦組織修復(fù)再生。包括神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子等，能刺激受損神經(jīng)元軸突生成。脂肪MSCs外泌體的這一效應(yīng)在急性缺血性卒中大鼠模型中得到了有效的應(yīng)用，使大鼠腦組織內(nèi)急性缺血誘發(fā)的梗死面積減少，同時在大鼠功能評估的各項(xiàng)測試中，腦缺血癥狀得到明顯的改善。

（四）MSCs外泌體可作為RNA運(yùn)載體治療AD

miRNA是一種非編碼短鏈RNA，在一些生理現(xiàn)象中負(fù)責(zé)調(diào)控表觀遺傳性狀[26-35]。miRNAs調(diào)控多種生物過程，如生長、發(fā)育、血管生成、干細(xì)胞更新和分化[35-39]。MSCs外泌體作為一種最新的RNA理想載體，能自由通過包括血腦屏障在內(nèi)的各種生物屏障，同時保證外泌體內(nèi)含有的小分子生物活性物質(zhì)不會被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)細(xì)胞分解與清除，達(dá)到進(jìn)行跨器官甚至跨系統(tǒng)靶向分泌的目的[40]。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，AD患者大腦中，miR-9、miR-26b、miR- 181、miR- 221等幾個miRNA的含量有不同程度的增加或減少[41]。特定miRNA的差異表達(dá)有可能促進(jìn)AD病程的發(fā)生與進(jìn)展。

RNAi能夠下調(diào)某些靶向基因的表達(dá)。研究表明，RNAi可以將miRNA模擬物（miRNA mimics）和miRNA拮抗劑（antimiRNA）兩種類型的miRNA作為靶向目標(biāo)[42]。借助MSCs外泌體進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的mimics能夠模擬miRNA前體，下調(diào)與AD疾病相關(guān)的蛋白表達(dá)。利用mimics來降低AD發(fā)病機(jī)制中特異性蛋白的表達(dá)從而延緩AD病程進(jìn)展，可以作為AD治療的有力策略[43]。而另一種可用于治療包括AD在內(nèi)各種疾病的方法，就是antimiRNA能夠抑制miRNA的表達(dá)[44]。對于某些特定miRNA可以通過注射互補(bǔ)RNA序列來阻止翻譯。只要能識別AD患者的miRNA缺陷，就可以利用antimiRNA提供新的治療方式。

三、總結(jié)與展望

研究至今，多種體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MSCs外泌體能分別在AD的幾個核心病理機(jī)制環(huán)節(jié)產(chǎn)生較好療效。能促進(jìn)腦內(nèi)沉積的Aβ降解，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及突觸不受炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的損傷，并同時促進(jìn)已損傷部位的神經(jīng)元軸突生長，改善AD模型大鼠的行為、認(rèn)知功能。充分體現(xiàn)了在AD治療中擁有的療效及潛力。然而，目前關(guān)于MSCs外泌體的臨床應(yīng)用仍存在一定的局限性：（1）目前應(yīng)用于提取外泌體的方法耗時較長、效率較低，尋找高效提取外泌體并有效應(yīng)用于臨床的方法亟待探索研究；（2）MSCs外泌體調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)Aβ降解和促進(jìn)軸突生長的具體機(jī)制探討還不明確，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究；（3）將攜帶miRNA和siRNA的MSCs外泌體作為載體，應(yīng)用于動物體內(nèi)的安全性以及具體實(shí)施方案還未有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，需要進(jìn)一步研究討論。