牟萍 ，王兆升 ，范祺 ，張明 ，楊立風 ，馬超 ，吳茂玉 *

（1.山東農業(yè)大學，山東泰安271018；2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

葡萄（Vitis viniferaL.）為葡萄科葡萄屬木質藤本植物，既有為人稱道的風味和口感，又具有很好的營養(yǎng)價值。現(xiàn)代科學證實，葡萄中含有礦物質以及多種維生素，還含有多種人體所需的氨基酸，常食葡萄可以抗病毒、改善過敏癥狀、防癌抗癌、抗貧血、美容養(yǎng)顏等[1]。而葡萄多酚是葡萄重要的次生代謝產物，廣泛存在于葡萄的梗、皮、核中，是葡萄中存在的所有酚類物質的總稱。研究表明，葡萄多酚具有抗氧化、抗腫瘤、調節(jié)心血管系統(tǒng)等生理活性。因其生理功能的多樣性，近年來葡萄多酚成為國內外天然產物以及人類保健、醫(yī)學、健康的研究熱點。

目前對于葡萄多酚的研究主要集中在它的提取、純化以及組分分析和生理活性方面。在眾多的植物多酚中，葡萄多酚高效、無毒，具有很強的抗氧化、清除自由基等功能。葡萄在我國使用率高，產量豐富，副產物葡萄籽、葡萄皮剩余量大，因此葡萄多酚主要組分、生理活性、提取和純化方法及應用等方面的研究對于指導其開發(fā)利用、實現(xiàn)變廢為寶、提高利用率具有重要意義。

1 葡萄中的主要多酚類物質

表1 葡萄不同部位及其制品中的酚類化合物Table 1 Phenolic compounds in different parts of grape and their products

葡萄中的酚類物質主要存在于葡萄的表皮、莖、葉子和種子中，在種子、表皮、肉和葉子中的濃度分別約為2178.8、374.6、23.8和 351.6 mg/g（沒食子酸當量）[2]。目前，包括花色苷、黃酮醇、兒茶素類、白藜蘆醇、原花素、花色素以及黃烷酮醇類等十幾種多酚類物質已經成功從葡萄中分離鑒定出來[3]?；ㄉ帐侵参矬w內重要的類黃酮化合物，具有清除體內自由基并降低氧化酶活性的功能[4]；黃酮醇重要的生理功能及輔色作用決定了其是葡萄及葡萄酒中除花色苷之外最受關注的類黃酮類化合物，它與葡萄和葡萄酒的營養(yǎng)品質和感官品質的形成密切聯(lián)系[5]；兒茶素類化合物是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，抗氧化能力強、安全性高[6]；白藜蘆醇存在于葡萄漿果、葡萄干、葡萄汁和葡萄酒中，在醫(yī)學上具有防癌和防治心血管疾病的作用[7]。

2 葡萄多酚的生理活性

2.1 抗氧化作用

正常生命過程中產生的自由基是維持生命所必需的，但過剩的自由基會對人體內的生命分子造成損害，引發(fā)多種疾病，葡萄多酚能夠有效地清除人體內過剩的自由基。劉蕓等[8]采用鐵離子還原/抗氧化能力法（FRAP法）測定了葡萄皮渣提取物的總抗氧化能力，結果發(fā)現(xiàn)FRAP 值為（3.215±0.017）mmol/g；在此基礎上，測定其對DPPH、O2－·、OH 、ABTS+等自由基的 IC50分別為 20.5、52.5、566.4、16.8 mg/L，對 β-胡蘿卜素/亞油酸體系抑制作用的 IC50為28.2 mg/L，可見，葡萄皮渣提取物具有較強的抗氧化能力。Pataki等[9]對大鼠投喂含有葡萄籽原花青素提取物的飼料3周，通過電子自旋共振光譜法對氧自由基進行測量，發(fā)現(xiàn)原花青素能顯著抑制氧自由基的形成，給予葡萄籽原花青素提取物100 mg/kg的處理與對照相比，自由基強度降低75%±7%。

2.2 抗癌作用

研究表明，葡萄多酚具有抗癌作用。Agarwal等[10]用葡萄籽多酚處理體外培養(yǎng)的乳腺癌 MDA－MB－468細胞1～3 d，發(fā)現(xiàn)其對該細胞增殖具有高度顯著的抑制作用，抑制率達90%～100%。Vayalil等[11]通過研究得出，葡萄原花青素會抑制雄激素不敏感性前列腺癌細胞DU145和雄激素敏感性前列腺癌細胞LNCaP的增殖，以及MMP-2和MMP-9這兩種金屬蛋白酶的表達。

2.3 抑菌作用

葡萄多酚有較強的收斂作用，對多種細菌、真菌都有明顯的抑制功效。Sagdicet等[12]研究表明，不同濃度的葡萄渣粗提物在貯藏過程中能夠抑制大腸桿菌科和沙門氏菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌等食源性致病菌以及霉菌、酵母菌和溶脂菌等腐敗微生物的生長。李建慧等[13]試驗發(fā)現(xiàn)，葡萄多酚對普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌1（1884）、金黃色葡萄球菌2、志賀氏痢疾桿菌、傷寒沙門氏桿菌1（533黃）、傷寒沙門氏桿菌2（533白）、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏桿菌這8種致病菌的最低抑制濃度分別為 0.2、0.3、0.1、0.2、0.2、0.3、0.5、0.3 g/L，可見葡萄多酚對細菌有廣泛的抑制作用，是一種良好的天然抗菌劑。

2.4 調節(jié)心血管系統(tǒng)作用

葡萄多酚調節(jié)心血管系統(tǒng)的功能也得到了科學論證。連冠等[14]研究了葡萄籽多酚降血脂及抗動脈粥樣硬化的作用及機制，得出葡萄籽多酚具有降低小鼠血脂水平和改善動脈粥樣硬化的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽多酚降血脂可能與通過膽固醇代謝的代替途徑和中性合成途徑增加膽固醇轉化成膽汁酸、促進脂質的轉運有關；抗動脈粥樣硬化的機制可能與降低血漿中總膽固醇和甘油三酯水平、減少泡沫細胞的形成有關。Zhao等[15]研究表明，葡萄原花青素具有保護心血管系統(tǒng)的能力，有對抗再灌注性心律失常的作用。

2.5 其他作用

研究證實，葡萄多酚還有降血糖、抗輻射的功效。仇菊等[16]研究表明，長時間注射低劑量的葡萄籽多酚可以有效調節(jié)糖尿病大鼠的血糖水平。葡萄籽多酚通過修復胰島損傷來促進胰島素分泌、降低空腹血糖水平、改善葡萄糖耐受力，這一功效可能與其體內抗氧化作用相關。蔣寶泉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，單獨添加葡萄籽原花青素組及其與酪蛋白聯(lián)合干預組血清內毒素水平都明顯低于照射組（P＜0.05），這表明葡萄籽原花青素及其與酪蛋白聯(lián)合干預都對輻射造成的腸黏膜屏障功能損害具有明顯的保護作用。

3 葡萄多酚的提取與純化

3.1 葡萄多酚的提取方法

提取葡萄多酚的方法通常有溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、酶提取法等[18]。試驗證實，目前最適用的提取方法是溶劑萃取法；而新興的一些技術如超臨界萃取技術等，由于成本太高也僅限于小規(guī)模的科學實驗研究，不能廣泛應用。但隨著天然藥物在全球的興起和技術的進步，這些新興技術也會被廣泛應用到葡萄多酚的提取中。

3.1.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法是根據(jù)物料中各成分在溶劑中溶解性的不同，選用對待提取成分的溶解度大、而對不需提取成分的溶解度小的溶劑，將有效成分從原料中溶解出來的一種方法。常用溶劑有水、甲醇水溶液、乙醇水溶液、丙酮水溶液等。Nawaz H等[19]利用含水乙醇提取葡萄籽中的多酚，最佳提取工藝條件是采用5倍體積比的50%乙醇水溶液，在70℃條件下提取60 min。孫玉霞等[20]通過響應面法優(yōu)化了葡萄枝中多酚的提取條件，結果發(fā)現(xiàn)，乙醇水溶液濃度50%、提取溫度70℃、料液比 1:16.5，在此條件下提取液中多酚含量可以達到14.126 mg/g。

溶劑萃取法設備簡單，操作容易，但提取時間較長，提取率較低，而且所用的有機溶劑很有可能殘留在最終的產品中。所以，該法在提高提取率和安全性等方面有待改進。

3.1.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法是將超聲波產生的振動效應、空化效應、攪拌效應、粉碎效應等綜合效應應用到天然產物成分的提取工藝中，通過破壞其細胞壁，增加溶劑的穿透力，從而達到高效提取細胞內容物的目的[21]。

姜黎等[22]研究利用超聲波輔助提取葡萄皮渣中的多酚，最佳工藝條件為提取溫度40℃、料液比1:10、乙醇濃度40%、超聲波處理時間30 min、超聲頻率45 kHz、pH6；在此條件下提取的多酚含量可達17.79 mg/g。

超聲波輔助提取法具有提取速度快、得率高、對熱不穩(wěn)定、物質破壞少等特點，將此法應用于多酚的提取會取得很好的效果，但獲得產品的純度不高。

3.1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法的原理是通過微波加熱使植物細胞內的極性物質吸收微波能并產生熱量，使細胞內溫度急劇上升，水汽化導致植物細胞內部的壓力也迅速上升，沖破細胞膜和細胞壁形成孔洞；進一步加熱導致細胞水分減少，表面出現(xiàn)裂紋，使胞內物質容易從孔洞和裂紋釋放出來，而胞外溶劑易進入胞內溶解并釋放出胞內有效成分，從而提高提取效率[23]。

李鳳英等[24]采用微波輔助提取法，按1:25料液比加入體積分數(shù)50%的乙醇，在180 W微波功率下處理35 s，于70℃的水浴中浸提25 min，使多酚的浸提率達到95.02%。同時與常規(guī)的溶劑萃取法進行比較，結果發(fā)現(xiàn)，微波輔助提取法比傳統(tǒng)的溶劑萃取法提取率可提高20.14%，而且經紫外掃描圖譜顯示，此微波條件對葡萄皮多酚結構沒有產生破壞。

微波輔助提取技術作為一種新型的萃取技術，不僅快速、高效、穩(wěn)定、選擇性高，而且節(jié)物、節(jié)能、環(huán)保[25]。但與超聲提取相比，微波法只適合短時間內快速提取，長時間提取可能會導致提取液溫度過高而使多酚類物質分解，提取量減少。

3.1.4 超臨界流體萃取技術

超臨界流體萃取技術利用了溫度和壓力對超臨界流體溶解能力的影響。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待提取的物質接觸，使其有選擇性地依次把極性、沸點和相對分子質量大小不同的成分萃取出來[26]。張青松等[27]采用超臨界CO2萃取技術，對從釀酒后廢棄葡萄皮渣中萃取白藜蘆醇的技術進行了研究。以75%乙醇為最佳夾帶劑，通過壓力、溫度、時間的單因素試驗和正交試驗，研究出了CO2超臨界萃取的最佳工藝條件，結果表明：在13 MPa、38℃下萃取17 min的效果最好，在此條件下白藜蘆醇平均得率可達0.087%。Ghafoor K等[28]通過響應面法確定出超臨界流體萃取葡萄皮多酚的最佳工藝參數(shù)，經檢測，在此工藝下獲得的葡萄皮提取物中具有大于93%的DPPH自由基清除活性。

超臨界流體萃取技術具有高效提取、綠色環(huán)保等優(yōu)點，已經在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)等產業(yè)得到了廣泛的應用，今后應進一步研究超臨界流體萃取技術的影響因素、超臨界流體的性質等，在此條件下，超臨界流體萃取技術的應用前景將十分廣闊[29]。該項技術的不足之處在于投資成本較高。

3.1.5 酶提取法

酶提取法是利用酶反應溫和的特點將植物組織進行分解，大大提高提取率，酶法具有節(jié)約能源、提取率高、條件溫和、除雜和無污染等優(yōu)點[30]。李浡等[31]用纖維素酶、β-葡聚酶、果膠酶、木瓜蛋白酶以及復合酶提取葡萄皮渣中的總酚并測定含量，結果顯示，復合酶提取多酚效果較好，果膠酶提取效果次之。

3.2 葡萄多酚的純化方法

從原料中提取出來的葡萄多酚屬于粗品，要得到高純度的葡萄多酚或者葡萄多酚單體組分需要對粗品進行提純。目前常見的對天然活性多酚純化方法主要有樹脂吸附純化法、高效逆流色譜純化法、膜技術純化法、制備HPLC法以及金屬離子沉淀純化法等[32]。

3.2.1 樹脂吸附純化法

樹脂吸附純化法是將粗提取液通過大孔樹脂，吸附其中的有效成分，再經洗脫回收，去除雜質的一種純化方法。大孔樹脂的表面積較大、機械強度高、交換速度較快、熱穩(wěn)定好，在水溶液及非水溶液中都能使用；同時它具有物理化學穩(wěn)定性高、吸附選擇性獨特、使用周期長、不受無機物存在的影響、解吸條件溫和、費用低等眾多優(yōu)點[33]。

張靜等[34]通過靜態(tài)、動態(tài)結合的方法，以葡萄多酚類物質吸附量、吸附率和解吸率為指標，確定出了ME-1型樹脂是最佳的型號，其最佳吸附洗脫參數(shù)如下：在葡萄多酚含量17.335 mg/g，吸附流速2 mL/min的條件下，樹脂靜態(tài)吸附平衡時間為10 h，動態(tài)吸附最大上樣量為400 mL，動態(tài)洗脫蛋白質和多糖的蒸餾水用量分別為1300 mL和150 mL，洗脫劑為體積分數(shù)75%的乙醇，其用量為100 mL時的洗脫效果最好，此時葡萄多酚類物質的回收率可達84.8%。杜彬等[35]以 NKA-9、D101和NKA-II這3種大孔吸附樹脂作為吸附劑純化白藜蘆醇，實驗表明，由NKA-9大孔吸附樹脂填充的色譜柱效果最好，動態(tài)飽和吸附量約為2.31 mg/mL濕樹脂；解吸用75%的甲醇，在解吸流速1 mL/min、pH值為8的條件下，白藜蘆醇可被較好的純化。

3.2.2 高速逆流色譜純化法

高速逆流色譜法是利用互不相溶的兩相在螺旋管中進行高速行星式運動，使被分離純化的物質在兩相之間多次分配，從而實現(xiàn)短時間對混和物的高效分離和制備。由于高速逆流色譜法不需要固定相，因此克服了固相載體對樣品的污染、吸附和峰拖尾等缺點，而且使得樣品回收率較高[36]。羅蘭馨等[37]采用正己烷-乙酸乙酯-水（1:50:50）為溶劑系統(tǒng)對白葡萄皮多酚粗提物進行高速逆流色譜技術分離，結果高速逆流分離得到3個餾分，經制備液相分離得到6個多酚化合物單體，經質譜鑒定和對照品對照，鑒別為兒茶素、表兒茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、異槲皮苷、fertaric acid和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，其純度均大于90%。李媛媛等[38]采用高速逆流色譜法分離紅葡萄皮中的花色苷，以乙腈-正丁醇-甲基叔丁基醚-水-三氟乙酸（1:40:1:50:0.01，V/V）為溶劑體系，可得到純度分別為93.7%、95.2%、91.6%的飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷和芍藥色素-3-O-葡萄糖苷三種花色苷單體化合物。

3.2.3 膜技術純化法

膜技術純化法是天然或人工合成的高分子薄膜以濃度差、壓力差、溫度差和電位差等外界能量位差為推動力，對雙組分或多組分的溶質及溶劑進行分離、分級、提純和富集的一種分離純化方法。膜技術純化法具有簡單、節(jié)能、高效、易于操作、造價較低等特點，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的蒸發(fā)、精餾、結晶、萃取等方法[39]。陳文良等[40]開展了膜分離技術用于葡萄籽中低聚原花青素分離純化的工藝研究，結果表明：操作壓力在1.0 MPa的條件下，采用10萬道爾分子量規(guī)格的膜是最佳選擇。此時具有較大的膜通透性，產品的截留率低，為6.2%，且產品中的低聚原花青素含量較高。

3.2.4 制備型液相色譜法

制備型液相色譜法（HPLC）是利用組分在固定相和流動相中分配系數(shù)的細微差異，當兩相進行相對運動時，不同組分將形成不同遷移速度的譜帶，使得組分之間彼此分離，從而達到分離的目的。制備HPLC法由于具有分辨率高等優(yōu)點，在未來勢必會成為天然產物分離的重要手段之一[41]。王維茜等[42]采用HP-20樹脂和半制備型高效液相色譜結合的方法從刺葡萄中分離得到2種花色苷單體，分別是錦葵素-3,5-O-雙葡萄糖苷和錦葵素-3,5-O-雙葡萄糖苷-香豆酰，純度為99.54%和98.28%。

3.2.5 金屬離子沉淀純化法

通常采用金屬離子沉淀純化法，將植物多酚的粗提溶液與相應的金屬離子產生絡合沉淀，經過后續(xù)過濾、洗滌等處理，得到純度較高的植物多酚。金屬離子沉淀純化法具有設備簡單、成本低等優(yōu)點，但需要經過沉淀、洗滌等工序，操作比較麻煩。除此之外，有些組分的沉淀分離選擇性比較差，分離不夠完全，所得的產品純度也相應較低[43]。時國慶等[44]以葡萄籽為原料，利用溶劑法（70%乙醇）結合冷卻沉淀法（4℃、1 h）和鹽析法（加入6 g NaCl），調節(jié)澄清液pH值為3.5，用乙酸乙酯萃取，對原花色素提取物進行分級分離。

4 葡萄多酚的應用

葡萄多酚豐富的生理活性，使之在醫(yī)學、食品、化妝品領域有廣泛的應用前景。

4.1 在醫(yī)學方面的應用

首先，葡萄多酚良好的抗氧化能力可以在阻止血脂升高的同時提高低密度脂蛋白的含量，所以對心血管疾病有一定的治療作用。Meunier等國外學者將葡萄多酚應用于降低高血壓，結果證明，葡萄多酚可以抑制血管緊張素轉換酶（ACE）的活性，從而降低血管緊張素Ⅱ的含量，使血壓控制在一定水平。不僅如此，葡萄多酚還具有抗癌的功效，其也被應用在預防食道癌、乳腺癌、腸癌等癌癥疾?。淮送?，葡萄多酚也被應用到降血糖、抗過敏、抑菌等方面。

4.2 在食品方面的應用

在食品領域，葡萄多酚的應用主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，葡萄多酚的相關食品逐漸被開發(fā)出來。李鳳英等[45]以葡萄籽浸提液、脫脂乳粉為原料，研制出葡萄多酚酸奶。其次，目前已經有葡萄多酚作為食品添加劑添加到食物中解決食品的氧化等問題。例如肉制品在貯藏過程中會因脂肪氧化而變質，將葡萄多酚應用到其中會提高保鮮效果。Ahn等[46]將1%的葡萄籽多酚應用到熟牛肉的冷藏中，有效抑制了病原微生物的生長并降低了牛肉中脂肪的氧化產物，且沒有使牛肉發(fā)生褐變。

4.3 在化妝品方面的應用

葡萄多酚抗氧化、抗菌、抗輻射及抗衰老的生理活性使其在化妝品領域也有廣泛的應用，越來越多的葡萄多酚相關洗化產品被開發(fā)出來。如法國以低聚體原花青素為原料開發(fā)出的脂質體微膠囊晚霜、漱口水等；日本已開發(fā)出含葡萄籽多酚的皮膚免疫力增強劑、皮膚增白劑、口腔除臭劑等產品；我國也出現(xiàn)了葡萄多酚面霜、沐浴露、護手霜等相關產品。

5 小結

目前，葡萄多酚提取及純化等技術日臻成熟，再加上生理活性的多樣性，使得葡萄多酚在醫(yī)學、食品和化妝品等領域的應用越來越廣泛。而我國的葡萄種植面積很大，在葡萄日常管理中會產生很多修剪的枝條、丟棄的廢果，在我國葡萄酒產量猛增的同時，每年產生的葡萄皮渣也有數(shù)萬噸，如果把這些葡萄廢棄物當作垃圾丟棄或焚燒都會對環(huán)境造成很大的污染。在葡萄廢棄物中進行多酚類物質的提取研究將對提高葡萄資源的綜合利用、保護環(huán)境起到重要作用。

總而言之，作為一種天然又高效的活性物質，葡萄多酚越來越被人們重視。隨著人們對葡萄多酚研究的不斷探索，其應用必將越來越廣泛。