趙 婕 ，張子晗 ，侯秋彥 ，喻方圓

（1.南京林業(yè)大學 a.林學院；b.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.南京創(chuàng)新教育信息咨詢有限公司，江蘇 南京 210028）

東京野茉莉Styrax tonkinensis (Pierre) Craib ex Hartwich,又名越南安息香、白花樹等，為野茉莉科野茉莉屬的落葉喬木。其模式植物采自越南[1]，在境外主要分布于老撾和越南北部次生雨林[2]；其國內種源大都見于長江流域以南各省海拔100～2 000 m的疏林中或林緣，在重慶、浙江[3]和江蘇等省也有引種記錄。

東京野茉莉具有良好的適應能力，能耐一定程度的干旱和貧瘠，具有很強的萌芽更新能力[4]，且其木質細致、均勻、潔白，是理想的工藝、膠合板和紙漿材[5]。國內外學者對其木材脆性[6]、木纖維特征[7]等做了研究，并在其木材綜合利用研究方面取得一定進展[8]。種子含油率達50%以上[9-11]，是生物柴油潛在的原料；其種子營養(yǎng)成分高，油酸和亞油酸含量占種子油總量的80.76%～85.62%[12]，其中人體必需氨基酸組分比例均符合FAO/WHO的推薦模式，可以基本滿足各年齡層的營養(yǎng)需求[9]；其花序白色成串，幽香，且樹形挺拔，具觀賞價值。該樹種集材用、食用、油料、觀賞等于一身，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

東京野茉莉主要采用播種繁殖，但由于其種子具有休眠習性，處理不當則會導致大田出苗率低。目前國內外對東京野茉莉種子休眠特性的研究很少。有報道顯示，低溫沙藏能打破東京野茉莉種子休眠[13]，但其并未探討種子休眠機理，且播種60 d后其發(fā)芽率不到20%；許曉崗等[14]發(fā)現(xiàn)經過500 mg/L GA324 h浸種和沙藏的復合處理，江西吉安東京野茉莉種子發(fā)芽率能達59.4%，并認為種被阻力和種內發(fā)芽抑制物質是導致其休眠的主要原因。

本研究以東京野茉莉種子為材料，研究其休眠機制，探索休眠解除方法，旨在為播種育苗提供理論依據(jù)和實踐基礎。同時，也期望為其它同類型林木種子的休眠解除研究提供經驗和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

東京野茉莉每果1～2粒種子，種被質硬（下文稱種殼），銹褐色，具胚乳，于2012年10月采自浙江省遂昌縣，存于0～4 ℃冷庫。種子千粒重為116.306 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子預處理設計和發(fā)芽試驗

對采回的東京野茉莉新鮮種子進行下列預處理：1）層積處理（CS，cold stratification）：在0～4℃低溫庫中層積120 d，每15 d取樣，每周攪拌1次，下同；2）層積后機械處理（CSSCR，cold stratification+ seed coat remove）：在層積處理取樣后除去種殼；3）層積后赤霉素浸 種（CS-GA3，cold stratification+gibberellin soaking）：在0～4 ℃冷庫中層積后取樣，以赤霉素浸種5 d。層積時間（0、15、30、45、60 d）和激素質量濃度（1 000、1 200、1 400 mg/L）2因素交互作用。種子預處理后，按林木種子檢驗規(guī)程（GB2772-1999）進行沙床發(fā)芽試驗。培養(yǎng)箱光照周期16 h/8 h，溫度25℃，濕度70%～75%，30 d后統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.2 種子透水性的測定

隨機數(shù)取層積0、60 d東京野茉莉種子各兩份，每份30粒，重復3次；一份去殼，另一份不作處理，稱質量后放入燒杯并加20 mL去離子水；于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中放置，定期取出（前48 h白天每3 h、夜間每12 h測定1次；之后白天每6 h、夜間每12 h測定1次）；拭干種子表面水分后測定種子質量，直至其不再變化為止。測定種子吸水率。

1.2.3 離體胚培養(yǎng)

隨機取未層積東京野茉莉種子各4組，每組10 粒，重復3次，去殼，在蒸餾水中浸泡24 h后分別進行4種處理：1）將胚乳完全剝離，取出胚；2）剝除部分胚乳，露出1/3子葉；3）剝除部分胚乳，露出1/3胚根；4）保留完整的胚乳。將上述材料分別置于鋪有兩層潔凈濾紙的培養(yǎng)皿中，用去離子水浸濕后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內光照培養(yǎng)，并觀察各組萌發(fā)情況。

1.2.4 內源性物質提取及白菜籽發(fā)芽的測定

隨機取未層積新鮮種子的種殼和胚乳各5 g，以少量去離子水研磨后倒入燒杯；用80%的甲醇溶液于4℃冰箱中浸提72 h（期間不時振蕩燒杯以充分提?。闉V，重復2次；混合濾液后在50℃恒溫箱內濃縮蒸干，用去離子水定容至50 mL。將定容后的浸提液稀釋為25%、50%、75%、100% 4個濃度，分別浸泡白菜籽并以同體積去離子水為對照，設3次重復，在25℃恒溫光照箱中培養(yǎng)；48 h后測定發(fā)芽率（以白菜籽種皮脫落為標準）。所用白菜籽為南京市蔬菜科學研究所售“早熟五號”白菜籽，發(fā)芽率≥85%，含水量≤7%，凈度≥96%

1.2.5 層積過程中種子生化指標的測定

自第1天始，每隔15 d取層積處理后種子（直到120 d層積結束），去殼，測定其生理生化指標。采用蒽酮比色[15]測定可溶性糖和淀粉含量；采用考馬斯亮藍染色法[15]測定可溶性蛋白含量；采用3，5-二硝基水楊酸法[15]測定淀粉酶活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法[15]測定過氧化物酶活性。所有測定重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用Excel 2003和SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行分析和處理，對CS-GA3進行2因素方差分析，對其它數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan多重比較（α=0.05）。為使數(shù)據(jù)在分析前達到方差齊性，對發(fā)芽率數(shù)據(jù)采用平方根反正弦變換處理。

2 結果與分析

2.1 層積處理對東京野茉莉種子透水性的影響

圖1為東京野茉莉種子的吸水率變化曲線。在前24 h內，種子迅速吸水，之后速度減慢，趨于穩(wěn)定。未層積的完整種子吸水率最終達到19.16%，而經60 d層積后其吸水率達到28.11%；層積60 d后，去殼種子的吸水能力與層積前相比增加了49.58%。由此可知：種殼明顯阻礙種子的吸水速度；同時，層積過程中東京野茉莉去殼種子獲得了更強的吸水能力。

2.2 種殼阻礙對東京野茉莉種子萌發(fā)的影響

整體來說，層積處理后東京野茉莉發(fā)芽率呈上升趨勢（見圖2）。方差分析表明，層積時間對其萌發(fā)率產生顯著影響（P＜0.01），說明低溫沙藏可以打破東京野茉莉種子的休眠。完整種子發(fā)芽率雖有所提高，但最高發(fā)芽率仍低于10%（見圖2A），而種子經機械處理后，最大發(fā)芽率可達47%（見圖2B），說明種殼的機械阻礙是東京野茉莉種子休眠的主要原因之一。

圖1 層積中東京野茉莉完整種子（A）和去殼種子（B）的吸水率Fig.1 Water permeability of intact (A) and coat-removed (B) S.tonkinensis seeds

圖2 東京野茉莉完整種子（A）和去殼種子（B）的層積后萌發(fā)率Fig.2 Germination rate of intact (A) and coat-removed (B) S.tonkinensis seeds after stratification

2.3 胚乳阻礙對東京野茉莉種胚萌發(fā)的影響

具有完整胚乳的未層積種子在培養(yǎng)過程中陸續(xù)發(fā)霉腐爛；而露出1/3子葉和1/3胚根的部位在前期能夠部分變綠或膨大，但后期均停止生長，不斷霉爛，種胚無法正常萌發(fā)；離體胚培養(yǎng)良好，兩周后子葉均可伸長變綠，萌發(fā)率為100%。可見，東京野茉莉種子的種胚并不具有休眠特性。除種殼外，胚乳可能也是影響種子休眠的原因之一。

2.4 種子浸提液對白菜籽萌發(fā)率的影響

不同處理下，白菜籽萌發(fā)率均大于95%。方差分析顯示，白菜籽發(fā)芽率并未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。由此推斷，種子種殼、胚乳浸提液中不含抑制種子萌發(fā)的物質。

2.5 層積過程中東京野茉莉種子生理指標的變化

隨著層積時間的延長，東京野茉莉去殼種子中可溶性糖含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢；層積60 d時可溶性糖的含量達到最大值，為40.76 mg/g，隨后下降并保持在30～35 mg/g范圍內（見圖3A）。而淀粉含量則在層積45 d達到最大值，先于可溶性糖，并在隨后迅速下降（見圖3B）。東京野茉莉種子中可溶性蛋白含量隨層積時間的延長，從146 mg/g逐漸減少至65 mg/g（見圖3C）。在層積0～45 d內，種子淀粉酶活性大體呈現(xiàn)增加趨勢（見圖3D）；層積45 d時淀粉酶活性達到最高值，為36.69 U·min-1g-1。從圖3E可以看出，隨著層積時間的延長，過氧化物酶（POD）的活性逐步增大，在層積105 d時達到最高值，為497.34 U·min-1g-1。

圖3 層積過程中東京野茉莉去殼種子中可溶性糖、淀粉、蛋白含量及淀粉酶、POD活性Fig.3 Dynamics of soluble sugar, starch, soluble protein contents, amylase activity and POD activity in S.tonkinensis de-coated seeds in stratification process

2.6 東京野茉莉種子層積過程中的生理生化動態(tài)變化與發(fā)芽率的相關性

東京野茉莉種子萌發(fā)能力與胚（乳）內生理生化水平相關性較大。具體來看，可溶性糖含量和POD活性與種子發(fā)芽率呈正相關關系（見圖4A、E）。其中，與去殼種子相關性顯著，R值分別為0.885和0.658。而隨著淀粉與可溶性糖等種內大分子貯藏物質含量以及淀粉酶活性的逐漸降低，完整和去殼種子的發(fā)芽率均有上升趨勢（見圖4B、C、D）。

2.7 赤霉素（GA3）對層積后種子發(fā)芽率的影響

方差分析表明，不同赤霉素質量濃度處理間（F=39.82，P＜0.01）、不同層積時間處理間（F=18.90，P＜0.01）以及GA3質量濃度和層積時間的交互效應（F=10.84，P＜0.01）對種子發(fā)芽率的影響均達到極顯著水平。1 000、1 200 mg/L GA3處理過的種子隨著層積時間的延長，發(fā)芽率大體上呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；而1 400 mg/L GA3處理的種子發(fā)芽率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。從GA3質量濃度來看，除層積60 d外，GA3質量濃度對種子休眠的解除效果均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。層積30 d后1 200 mg/L GA3處理的種子發(fā)芽率最高，為54%；層積30 d后1 000 mg/L GA3處理的種子發(fā)芽率次高，為42%（見圖5）。

圖4 層積過程中東京野茉莉完整和去殼種子萌發(fā)率和去殼種子中可溶性糖、淀粉、蛋白含量及淀粉酶、POD活性的相關性分析Fig.4 Correlations among benzoin seed germination and soluble sugar, starch, soluble protein contents,amylase activity and POD activity in stratification process

圖5 層積后赤霉素處理對東京野茉莉種子萌發(fā)率的影響Fig.5 Effects of CS+GA3 treatments on S.tonkinensis seeds germination rates

3 結論與討論

3.1 東京野茉莉種子特性

種胚引起的休眠可以分為形態(tài)的、生理的或兩種同時存在。唐安軍等人[16]發(fā)現(xiàn)當種子成熟時，地涌金蓮Musella lasiocarpa的胚仍未發(fā)育完全，其種子的形態(tài)和生理后熟需通過半年的暖層積才能達到。本研究的離體胚萌發(fā)結果表明東京野茉莉種子種胚發(fā)育完全，不存在形態(tài)休眠；去除種殼和胚乳后能夠萌發(fā)，說明胚內并不存在生理休眠。綜上所述，種胚不存在休眠特性。

物理休眠主要由密封性過強的包覆組織引起。一些種子的種皮含蠟質、粘質或革質化，致使種子不透氣不透水，或者對種胚的生長造成機械束縛[17]。對于茼蒿Glebionis coronaria來說，在堅硬的果皮中，僅基部存在“水通道”?！八ǖ馈钡拇笮t在一定程度上控制了茼蒿種子的休眠[18]。而另一類休眠則由種皮或胚乳的約束力導致。這類種子的種皮堅硬木質化或表面具有革質；胚乳體積較大且細胞結構致密，將種胚完全包裹；這些往往會引起限制胚根伸長的機械阻力。耿文娟等人[19]發(fā)現(xiàn)新疆野生歐洲李種子種皮透水性不良是引起種子休眠的原因之一。由透水性、CS和CS-SCR處理實驗可知，層積60 d種子吸水率、發(fā)芽率與層積0 d種子相比均有所增加，但其發(fā)芽率均小于5%，遠小于層積后機械處理種子47%的萌發(fā)率，由此可知種殼的透水性低雖是東京野茉莉種子休眠原因之一，但種殼的機械障礙在其中似乎占據(jù)更大的作用。Baskin和Baskin[20]將此類休眠歸為非淺性生理休眠（Nondeep physiological dormancy），種被的移除能夠促進這類種子的萌發(fā)[21-22]。

種子中內源抑制物的存在可能是導致休眠的原因之一，然而本研究內源性抑制物的提取及生物測定表明東京野茉莉種子胚乳和種殼中并不存在發(fā)芽抑制物質，不是導致種子休眠的原因。這與許曉崗等[14]的研究結果相反，認為其根本原因是抑制物提取方法的不同。大部分種子中的萌發(fā)抑制物質以酚類等居多，溶于有機溶劑。而許曉崗等[14]使用蒸餾水在室溫條件下浸泡鮮種子樣品長達48 h。首先，抑制物質并不會溶解于水相；其次，阻礙白菜籽發(fā)芽的可能是種子上的微生物（在較適宜的環(huán)境中）分解活細胞后產生部分有毒害作用的代謝產物，但具體原因還需要繼續(xù)深入研究。由于離體胚試驗發(fā)芽率為100%，所以抑制物提取試驗無種胚本身的提取液試驗。

3.2 綜合處理解除休眠

由發(fā)芽實驗可知，單純層積處理效果不好，而經層積處理后再機械處理能打破種子休眠，種子發(fā)芽率大大提高。本研究中，層積+機械處理不光消除了種殼的機械阻力，胚乳中也產生一系列變化，導致種子在生理水平上達到休眠解除的條件。在非淺性生理休眠種子中，離體胚能夠正常萌發(fā)，種子休眠源自于胚乳和（或）種殼[23]，而激素水平的提高，例如GA3，是解除此類休眠的主要方法之一[24]。前人對休眠解除過程中胚乳做了大量的工作[25]，在番茄Lycopersicon esculentum種子中，胚乳的根尖區(qū)域的降解需要GA3的參與，對于GA3缺乏的基因型，則需要外源GA3或者移除胚乳的處理才能使種子萌發(fā)[26]。Jacobsen等[27]認為參與胚外組織軟化作用的GA3源于胚中，其作用于胚乳，使水解作用加強，胚乳細胞因此分散而被軟化。然而似乎GA3并不是唯一解除胚外組織障礙的信號，在白云杉Picea glauca中，β-甘露聚糖酶活性的上升導致了其雌配子體的軟化和胚根突破種殼，但這一變化并非由GA3誘導所致[28]。另外有研究表明，赤霉素和低溫層積相結合能快速打破許多種子的休眠，效率更高[29]。在山桃種子中，低溫層積的效果可以被GA3代替，而GA3處理和低溫層積相結合，解除休眠的效果更優(yōu)[30]。而袁雅琪等人[31]通過98% 的 H2SO4、400 mg/L 的 GA3、砂藏綜合處理提高了漆樹種子的萌發(fā)率。本研究中，外源GA3可以縮短東京野茉莉種子的層積時間，赤霉素+層積處理的最佳組合為1 200 mg/L GA3+30 d層積，發(fā)芽率為54%。

3.3 休眠解除過程與種子生理生化變化密切相關

種子中內含物質包括淀粉、可溶性糖和蛋白。這些物質在休眠解除的過程中進行代謝，為種子解除休眠提供所需要的能量[32]。研究種子的代謝過程有利于揭示種子的休眠機理。在層積0～60 d內，隨著種子可溶性糖含量的上升，種子萌發(fā)率也逐漸升高，相關性達到極顯著水平，暗示可溶性糖的積累對東京野茉莉種子休眠解除有重要作用。值得注意的是，即使種子內可溶性糖含量達到一定水平，種殼對種胚的束縛作用依然明顯。

淀粉在淀粉酶作用下水解為單糖，為種子萌發(fā)儲備可直接被利用的碳源。本研究中，東京野茉莉種子中淀粉含量在層積過程中呈下降趨勢，在層積初始階段，淀粉酶活性比較低，淀粉含量下降趨勢緩慢；之后隨著層積時間的延長，淀粉酶的活性加強，淀粉迅速水解，淀粉含量急劇下降?？扇苄缘鞍诪榉N子萌發(fā)提供氮素營養(yǎng)，種胚分化生長與蛋白代謝緊密相關。本研究中，種子在層積過程中可溶性蛋白質含量下降，說明細胞的代謝越來越旺盛，為萌發(fā)作準備。整體看來，種胚內貯藏物質的動員，有利于種子萌發(fā)率的上升，即休眠的解除。洑香香等人[29]在四照花種子的休眠解除中也觀察到類似結果。前人研究表明，過氧化物酶的活性隨著種子休眠的解除而迅速增加[33]。東京野茉莉種子在層積過程中，POD活性也逐漸增強。Zhang等[34]認為，POD活性的升高同時關聯(lián)吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性的降低，有助于細胞中生長素（IAA）的積累；同時，POD活性上升能夠促進木質素、木栓層及羥脯氨酸糖蛋白（HRGP）的生物合成[35-37]，加強細胞壁的穩(wěn)定性。所以，種子休眠解除過程中POD活性升高，可能有助于細胞分裂、細胞體積增大以及新細胞壁形成等過程。不過，由于試驗材料的局限性，未對種內ABA含量進行測定，需進一步探究。