楊碩知 ，劉 球 ，，吳際友 ，李志輝 ，程 勇

（1.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

多胺是普遍存在于高等動(dòng)物和植物體內(nèi)的一類(lèi)化合物。植物在進(jìn)行多胺合成和分解代謝的過(guò)程中有許多的關(guān)鍵酶， S-腺苷甲硫氨酸脫羧 酶（S-adenosylmethionine decarboxylase,即SAMDC）就是其中一種，研究其基因的克隆、定位和表達(dá)，可一定程度上從分子水平解釋多胺對(duì)高等植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆的調(diào)控規(guī)律[1]。到目前為止，SAMDC已經(jīng)在一些植物中進(jìn)行了提純、分析，甚至遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因植物的多胺代謝能力有明顯增強(qiáng)，抗旱等性能明顯提升[2]。早在1962年，Tabor[3]就發(fā)現(xiàn)了SAMDC基因，并開(kāi)始對(duì)其開(kāi)展深入研究。到目前為止，科學(xué)家們已從動(dòng)植物中克隆了約180個(gè)SAMDC基因，其中從植物中克隆出40多個(gè)[4]?？茖W(xué)家們還發(fā)現(xiàn)，幾乎每個(gè)植物品種都包含不止一個(gè)SAMDC基因，比如，水稻和擬南芥[5]中有4個(gè)，番茄[6]中有3個(gè)，羊草[7]中有2個(gè)，且各個(gè)基因在植物不同器官中的表達(dá)特性各不相同。通過(guò)對(duì)比還發(fā)現(xiàn)，已知植物SAMDC基因的核苷酸序列同源性比較高，因此可推導(dǎo)出氨基酸序列的相似度也比較高[4]。

SAMDC基因表達(dá)具有組織器官特異性，調(diào)節(jié)著不同器官組織的代謝過(guò)程。有研究人員發(fā)現(xiàn)，在百脈草中SAMDC基因在根、莖、葉中表達(dá)的RNA水平不同，在莖中較低，在幼葉和根中較高，而成熟葉中不表達(dá)[8]。劉志勇等[9]發(fā)現(xiàn)，番茄SISAMDC1基因組序列全長(zhǎng)為3 648 bp，有3個(gè)內(nèi)含子，均位于5′-UTR，與其他植物SAMDC基因的同源性較高，但與動(dòng)物、細(xì)菌等來(lái)源的SAMDC基因同源性較低。張梅等[10]發(fā)現(xiàn)，杜梨PbSAMDC基因全長(zhǎng)1 683 bp，有358個(gè)氨基酸，該基因與MdSAMDC1的同源性高達(dá)96%，跟甜橙、葡萄中SAMDC基因的同源性也較高。從辣椒中克隆出SAMDC基因，然后將其轉(zhuǎn)入擬南芥體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥中的亞精胺（Spermidine，即Spd）和外源精胺（Spermine，即Spm）含量比野生擬南芥要高，說(shuō)明轉(zhuǎn)入的SAMDC基因提高了辣椒體內(nèi)多胺的合成，有助于提高擬南芥抗旱能力[11]。李昌澎[12]以小麥品種‘晉麥47’為試驗(yàn)材料，擴(kuò)增了SAMDC基因，采用BSMV-VIGS技術(shù)進(jìn)行沉默，然后進(jìn)行干旱脅迫和復(fù)水處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAMDC基因的沉默降低了小麥‘晉麥47’抵御干旱脅迫的能力。

紅椿Toona ciliata是楝科香椿屬落葉大喬木，國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)瀕危種，是湖南林業(yè)優(yōu)先重點(diǎn)發(fā)展的珍貴用材樹(shù)種之一。湖南地區(qū)的6ü9月最容易出現(xiàn)季節(jié)性持續(xù)干旱，然而紅椿生長(zhǎng)旺盛期也是6ü9月，如遇季節(jié)干旱，紅椿的生長(zhǎng)將遭受很大的影響[13]。本研究以紅椿總RNA為模板，采用PT-PCR法克隆紅椿S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因TcSAMDC，并研究其在干旱脅迫及外源多胺修復(fù)處理下的表達(dá)情況，旨在了解多胺抗旱分子機(jī)制，探索紅椿幼苗遭受季節(jié)性干旱脅迫后的有效修復(fù)措施，以防發(fā)生大面積苗木損毀，進(jìn)而保證造林成活率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以2年生紅椿家系幼苗為試驗(yàn)對(duì)象。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅椿TcSAMDC基因克隆

選取多種植物SAMDC基因表達(dá)的氨基酸序列進(jìn)行分析比對(duì)，以期發(fā)現(xiàn)其保守區(qū)域，然后根據(jù)保守區(qū)域堿基序列設(shè)計(jì)引物。利用取得的引物，通過(guò)總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄cDNA并使用PCR擴(kuò)充獲得目的基因片段。使用T載體克隆目的基因，PCR擴(kuò)充后進(jìn)行陽(yáng)性菌落培養(yǎng)。將所獲得的DNA序列測(cè)序，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 紅椿TcSAMDC基因在外源多胺抗干旱脅迫條件下表達(dá)

根據(jù)已經(jīng)測(cè)序出的紅椿SAMDC基因序列，運(yùn)用primer5設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，從而監(jiān)測(cè)外源多胺在修復(fù)不同程度干旱脅迫時(shí)該基因的表達(dá)情況。

1.2.2.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于湖南省林產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心苗圃?xún)?nèi)，其地理坐標(biāo)為東經(jīng)112°59′、北緯28°05′，年平均氣溫16.8 ℃，平均日照時(shí)數(shù)1 496～1 850 h，年降水量1 400～1 900 mm，無(wú)霜期264 d，屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)，光照充足，雨量豐沛；海拔為110 m，土壤為砂巖發(fā)育的紅壤，土層厚達(dá)60 cm以上；土壤肥力中等，pH值為6.2[14]。

1.2.2.2 試驗(yàn)材料

本研究以2年生紅椿家系幼苗為試驗(yàn)對(duì)象展開(kāi)試驗(yàn)布置。2012年3月，在桃源縣白家育苗圃進(jìn)行田間播種育苗，并進(jìn)行日常管護(hù)。2014年3月，選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻、健康無(wú)病蟲(chóng)害的紅椿幼苗完成入盆，每盆一株，盆缽口徑25 cm，深20 cm，每盆裝土5 kg（黃心土∶泥炭土= 2∶1），配統(tǒng)一盆墊，正常澆水管護(hù)。2014年6ü7月，針對(duì)管護(hù)好的紅椿盆栽幼苗布置干旱脅迫和外源多胺修復(fù)調(diào)節(jié)試驗(yàn)[14]。

1.2.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

本試驗(yàn)為雙因素（干旱脅迫處理×多胺修復(fù)處理）試驗(yàn)，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，植株干旱脅迫梯度有3種（輕度干旱、中度干旱和重度干旱），噴施多胺修復(fù)處理有3種（外源腐胺，即Putrescine簡(jiǎn)稱(chēng) Put、外源亞精胺Spd和外源精胺Spm），先對(duì)參試植株進(jìn)行持續(xù)干旱脅迫，然后再對(duì)其進(jìn)行多胺修復(fù)處理并采樣分析。5株每重復(fù)，重復(fù)3次，總共150株。

干旱脅迫處理：1）對(duì)照處理（CK），即每天澆水至飽和狀態(tài)（土壤相對(duì)含水率45%～50%）；2）輕度干旱脅迫，即持續(xù)干旱7 d（土壤相對(duì)含水率30%～38%）；3）中度干旱脅迫，即持續(xù)干旱14 d（土壤相對(duì)含水率25%～30%）；4）重度干旱脅迫，即持續(xù)干旱21 d（土壤相對(duì)含水率20%～25%）。于每天傍晚18:00采用美國(guó)便攜式土壤含水率測(cè)定儀FIELD SCOUT TDR 200的200 mm探針進(jìn)行盆栽土壤含水率測(cè)定，并采取葉片樣品回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定[14]。

外源多胺修復(fù)調(diào)節(jié)處理：分別在輕度、中度和重度干旱結(jié)束日起，每天傍晚18:00對(duì)輕度干旱脅迫對(duì)象噴施濃度為1 mmol·L-1的外源Put、外源Spd和外源Spm水溶液，貼近植株葉片正反面進(jìn)行霧狀噴施，噴施量以葉片正反面水珠凝結(jié)滴落為限，連續(xù)噴施3 d。

2014年6月10日正式開(kāi)始試驗(yàn)，于2014年7月上旬試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)在人工遮雨棚中進(jìn)行，保證正常的光照和空氣條件，防止雨水入侵，保持棚內(nèi)外溫度一致。選擇第三輪成熟葉片進(jìn)行采樣，將摘取的葉片放進(jìn)避光的冰盒，迅速將其帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步操作。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用EXCEL2003進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

選取10種植物SAMDC氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)高度保守區(qū)域，據(jù)此設(shè)計(jì)引物（見(jiàn)表1）。

表1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果Table 1 Results of prime design

2.2 紅椿TcSAMDC基因克隆結(jié)果

2.2.1 RNA提取

圖1為紅椿葉片RNA樣品圖。電泳槽用3%的雙蒸水（滅菌DEPC處理水配制）處理0.5 h；配制1%變性瓊脂糖凝膠，0.2 g瓊脂糖，20 mL無(wú)菌1hTAE處理水，加熱至瓊脂糖溶解，冷至60 ℃，加入 0.5 μL EB（10 mg/mL），混勻后倒膠；取2 μL提取的RNA，按1∶5的比例與loading buffer premix混勻，120 V恒壓電泳，溴酚藍(lán)前沿遷移至凝膠總長(zhǎng)2/3處停止電泳；凝膠成像系統(tǒng)下觀察。圖1為紅椿葉片RNA樣品圖。為保證RNA的純度以及濃度，后續(xù)克隆實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)照2號(hào)樣品作為模板。

圖1 TcSAMDC RNA提取結(jié)果Fig.1 RNA extraction results of TcSAMDC gene

2.2.2 cDNA擴(kuò)增

圖2為PCR擴(kuò)增樣品。電泳條件同2.2.1凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

圖2 TcSAMDC基因PCR擴(kuò)增圖Fig.2 PCR amplification results of TcSAMDC gene

2.2.3 基因克隆

配制1%的瓊脂糖凝膠，上樣檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物中含有目的大小片段回收，產(chǎn)物與T載體連接后熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)。

用無(wú)菌牙簽挑取單克隆菌落，裝入0.2 mL已滅菌的EP管中，用10 μL無(wú)菌水稀釋菌落，取2 μL菌液進(jìn)行PCR，按克隆目的片段的反應(yīng)程序進(jìn)行菌落PCR。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性 15 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸50 s共31個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。電泳條件同2.2.1。紅椿TcSAMDC基因克隆結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 紅椿TcSAMDC基因測(cè)序及序列比對(duì)

測(cè)序得到一條532堿基對(duì)DNA。將測(cè)序得到的結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上比對(duì)，未找到相同的序列，結(jié)果如圖4所示。

從比對(duì)結(jié)果可知，所得產(chǎn)物堿基片與蕓香科甜橙以及克萊門(mén)柚的SAMDC基因相似度達(dá)79%，因此所得產(chǎn)物確實(shí)為紅椿SAMDC基因，命名為T(mén)cSADMC。

圖3 TcSAMDC基因克隆Fig.3 Clone of TcSAMDC gene

圖4 TcSAMDC序列BLAST比對(duì)結(jié)果Fig.4 Comparison results of TcSAMDC sequence by BLAST

2.4 外源多胺對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)的影響

2.4.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)已經(jīng)測(cè)序出的紅椿TcSAMDC基因序列，運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物合成（見(jiàn)表2）。

表2 熒光定量PCR引物合成Table 2 Prime synthesis of fluorogenic quantitative PCR

2.4.2 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5可以看出，各樣品基因均有不同程度的表達(dá)量。

圖5 紅椿RNA電泳圖Fig.5 RNA electrophoresis figure of T.ciliata

2.4.3 不同外源多胺對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片

TcSAMDC基因表達(dá)的影響

2.4.3.1 外源Put對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)的影響

在對(duì)照、輕度干旱脅迫（或中度干旱脅迫，或重度干旱脅迫）和外源Put修復(fù)調(diào)節(jié)處理之間，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)極顯著差異（F=130.477，P＜0.01；F=10 334.096，P＜0.01；F=3 225.829，P＜0.01）。如圖6、表3所示，輕度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著降低，降低幅度為13.90%，噴施外源Put處理后，相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)下降，幅度為脅迫狀態(tài)下的15.25%；中度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，升高幅度為對(duì)照的3.67倍，在噴施外源Put處理后，相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)以更迅猛的速度升高，升高幅度為脅迫狀態(tài)下的1.55倍，為對(duì)照狀態(tài)的10.91倍；重度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDCC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，升高幅度為對(duì)照的7.88倍，在噴施外源Put處理后，相對(duì)表達(dá)量有所下降，下降幅度為脅迫狀態(tài)的51.15%，但仍是對(duì)照狀態(tài)的3.34倍。

圖6 外源Put對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)的修復(fù)調(diào)節(jié)Fig.6 Repair and regulation of exogenous Put on leaf relative expression of TcSAMDC gene of T.ciliata seedlings under drought stress

表3 干旱脅迫及外源多胺調(diào)節(jié)處理下的紅椿TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量活性?Table 3 Relative expression of TcSAMDC gene of T.ciliata seedlings under drought stress and exogenous polyamines adjustment and treatment

2.4.3.2 外源Spd對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)的影響

在對(duì)照、輕度干旱脅迫（或中度干旱脅迫，或重度干旱脅迫）和外源Spd修復(fù)調(diào)節(jié)處理之間，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)極顯著差異（F=12 289.828，P＜0.01；F=1 927.361，P＜ 0.01；F=2 961.419，P＜0.01）。如圖7、表3所示，輕度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，升高幅度為對(duì)照的1.5倍，噴施外源Spd處理后，相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)以更迅猛的速度升高，升高幅度為脅迫狀態(tài)下的3.51倍，為對(duì)照狀態(tài)的10.27倍；中度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著下降，降低幅度為對(duì)照的73.55%，噴施外源Spd處理后，相對(duì)表達(dá)量飛速升高，升高幅度為脅迫狀態(tài)的42.22倍，為對(duì)照狀態(tài)的10.43倍；重度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，升高幅度為對(duì)照的5.91倍，然而噴施外源Spd處理后，相對(duì)表達(dá)量卻迅速下降，下降幅度為脅迫狀態(tài)的61.68%，仍是對(duì)照狀態(tài)的1.65倍。

圖7 外源Spd對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)的修復(fù)調(diào)節(jié)Fig.7 Repair and regulation of exogenous Spd on leaf relative expression of TcSAMDC gene of T.ciliata seedlings under drought stress

2.4.3.3 外源Spm對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)的影響

在對(duì)照、輕度干旱脅迫（或中度干旱脅迫，或重度干旱脅迫）和外源Spm修復(fù)調(diào)節(jié)處理之間，紅椿幼苗SAMDC基因相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)極顯著差異（F=2 510.552，P＜ 0.01；F=1 620.226，P＜0.01；F=2 134.233，P＜0.01）。如圖8、表3所示，輕度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，升高幅度為對(duì)照的89.11%，噴施外源Spm處理后，相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)升高，升高幅度為脅迫狀態(tài)下的1.07倍，為對(duì)照狀態(tài)的2.91倍；中度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，升高幅度為對(duì)照的6.6倍，噴施外源Spm處理后，相對(duì)表達(dá)量繼續(xù)升高，升高幅度為脅迫狀態(tài)下的87.23%，升高幅度為對(duì)照的13.23倍；重度干旱脅迫下，紅椿幼苗TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照顯著升高，升高幅度為對(duì)照的5.89倍，噴施外源Spm處理后，相對(duì)表達(dá)量極速下降，下降幅度為脅迫狀態(tài)的61.93%，但仍為對(duì)照狀態(tài)的1.62倍。

圖8 外源Spm對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)的修復(fù)調(diào)節(jié)Fig.8 Repair and regulation of exogenous Spm on leaf relative expression of TcSAMDC gene of T.ciliata seedlings under drought stress

2.5 外源多胺對(duì)干旱脅迫下紅椿葉片SAMDC基因表達(dá)的修復(fù)調(diào)節(jié)效果比較

SAMDC是亞精胺（spd）和精胺（spm）的合成關(guān)鍵酶之一，它在多胺的合成過(guò)程中起催化脫羧反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)后，腐胺（Put）與脫羧的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的氨丙基合成亞精胺（spd）和精胺（spm）。SAMDC基因表達(dá)量高，則說(shuō)明促進(jìn)植物啟動(dòng)多胺合成關(guān)鍵酶基因SAMDC以抵抗脅迫的力度越大，因此，SAMDC基因相對(duì)表達(dá)量變化值越大，外源多胺所起到的修復(fù)調(diào)節(jié)作用越明顯。

3種外源多胺在不同的干旱脅迫程度下對(duì)紅椿葉片的TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量修復(fù)調(diào)節(jié)效果不同（見(jiàn)表4），輕度干旱脅迫下，其修復(fù)調(diào)節(jié)效果呈現(xiàn)極顯著差異（F=7 835.689，P＜0.01）；中度干旱脅迫下，其修復(fù)調(diào)節(jié)效果呈現(xiàn)極顯著差異（F=154.212，P＜0.01）；重度干旱脅迫下，其修復(fù)調(diào)節(jié)效果差異不顯著。從圖9中可看出，輕度脅迫下，3種外源多胺試劑的修復(fù)調(diào)節(jié)效果大不相同，其中外源Put起到的是負(fù)向調(diào)節(jié)作用，而外源Spm和外源Spd則起到了顯著的正向調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)效果大小順序?yàn)镾pd＞Spm；中度干旱脅迫下，3種外源多胺試劑均起到了顯著的正向修復(fù)調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)效果大小順序?yàn)镾pd＞Put＞Spm，以Spd效果最好， Put、Spm二者效果差別不顯著；重度干旱脅迫下，3種外源多胺試劑均起到負(fù)向的調(diào)節(jié)作用，三者的負(fù)向作用差異不顯著。綜上分析可知，外源Spd和外源Spm對(duì)輕度干旱脅迫下紅椿葉片SAMDC基因表達(dá)有很好的促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源Spd和內(nèi)源Spm的有效合成，以修復(fù)干旱損傷，而外源Put則相反；外源Put、外源Spd和外源Spm三者均能非常有效地修復(fù)調(diào)節(jié)中度干旱脅迫下紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)，均能大力地促進(jìn)內(nèi)源Spd和內(nèi)源Spm的有效合成，以修復(fù)干旱損傷，且以外源Spd效果最佳；然而，到重度干旱脅迫程度，可能因?yàn)橹仓牦w內(nèi)細(xì)胞膜受損程度較大，以至于外源Put、外源Spd和外源Spm三者均不僅不能有效地促進(jìn)紅椿葉片TcSAMDC基因表達(dá)，反而對(duì)TcSAMDC基因的表達(dá)起到了明顯的相近程度的抑制作用。

表4 外源多胺在不同程度干旱脅迫下的調(diào)節(jié)作用?Table 4 Regulating effect of exogenous polyamines on T.ciliata seedlings under drought stress in different degrees

圖9 外源多胺修復(fù)對(duì)干旱脅迫下紅椿幼苗葉片TcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量變化值的影響Fig.9 Repair and regulation effect of exogenous polyamines on variation value of leaf relative expression of TcSAMDC gene of T.ciliata under drought stress

3 討論和結(jié)論

3.1 討 論

植物多胺及其合成與代謝途徑在很長(zhǎng)一段時(shí)間以來(lái)一直是研究的熱點(diǎn)。對(duì)該途徑中關(guān)鍵酶基因的克隆、定位和表達(dá)，可從分子水平上解釋多胺對(duì)高等植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆的調(diào)控規(guī)律[1]。常見(jiàn)植物多胺亞精胺和精胺是由腐胺與脫羧的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供的氨丙基合成[15]。SAMDC是上述步驟中的限速酶，因此其受到了許多研究者的關(guān)注。

蔡秋華等[16]成功克隆了斑茅SAMDC基因并進(jìn)行了原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)。張高陽(yáng)等[17]成功克隆了紅麻SAMDC基因。曾慶飛等[18]克隆了高羊茅SAMDC基因并成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體。王凡龍等[19]對(duì)棉花的SAMDC基因家族的3個(gè)基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，并對(duì)其在不同脅迫條件下的表達(dá)方式進(jìn)行了研究。王廣龍等[20]克隆了胡蘿卜DcSAMDC基因，并報(bào)道其能夠在38 ℃高溫、4℃低溫、干旱脅迫以及高鹽脅迫等條件下迅速響應(yīng)。劉金仙等[21]對(duì)甘蔗ScSAMDC基因進(jìn)行了克隆，且聚二乙醇或氯化鈉等脅迫可以促進(jìn)其表達(dá)，水楊酸或過(guò)氧化氫等脅迫對(duì)其表達(dá)具有抑制作用。文樂(lè)等[22]研究了甘蔗Sc-SAMDC3基因的克隆與表達(dá)，并進(jìn)行了生物學(xué)信息及其表達(dá)特性分析，發(fā)現(xiàn)甘蔗Sc-SAMDC3基因表達(dá)量隨著脅迫狀態(tài)的持續(xù)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論相似。本研究中，外源Spm和外源Spd對(duì)輕度干旱脅迫下紅椿TcSAMDC基因表達(dá)有很好的促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源Spm和內(nèi)源Spd的有效合成，以修復(fù)干旱損傷，而外源Put則相反；外源Put、外源Spm和外源Spd三者均能非常有效地修復(fù)調(diào)節(jié)紅椿中度干旱脅迫下紅椿TcSAMDC基因表達(dá)，均能大力地促進(jìn)中度脅迫下植株內(nèi)源Spm和內(nèi)源Spd的有效合成，以修復(fù)干旱損傷；然而，到重度干旱脅迫程度，可能因?yàn)橹仓牦w內(nèi)細(xì)胞膜受損程度較大，以致于外源Put、外源Spm和外源Spd三者均不僅不能有效地促進(jìn)紅椿TcSAMDC基因表達(dá)，反而對(duì)TcSAMDC基因的表達(dá)起到了明顯的相近程度的抑制作用；說(shuō)明用外源多胺刺激紅椿TcSAMDC基因的表達(dá)對(duì)植株的抗旱是有一定程度效果的。劉玉等[23]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入SmSAMDC基因可使煙草生理指標(biāo)抗旱特征更加顯著，通過(guò)表達(dá)SmSAMDC基因，可提高轉(zhuǎn)基因煙草抗旱能力。王廣龍等[20]對(duì)SAMDC基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)響應(yīng)分析，發(fā)現(xiàn)模擬干旱200 g·L-1PEG 1 h后，DcSAMDC基因相對(duì)表達(dá)量相比對(duì)照提高了1.46倍。

本研究?jī)H對(duì)2年生紅椿盆栽苗進(jìn)行了干旱脅迫修復(fù)試驗(yàn)，結(jié)論具有一定的局限性。在下一步研究中，可以考慮在本文研究基礎(chǔ)上，對(duì)不同年齡段的實(shí)生苗進(jìn)行抗干旱試驗(yàn)，同時(shí)增加噴施外源多胺的種類(lèi)與濃度梯度，以期能夠更好地解決生產(chǎn)栽培中的實(shí)際問(wèn)題[24-26]。

3.2 結(jié) 論

1）本實(shí)驗(yàn)得到了紅椿TcSAMDC基因的部分序列。將測(cè)序得到的結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上使用BLAST比對(duì)，未找到相同的序列。從比對(duì)結(jié)果可知，與所得產(chǎn)物堿基片段最相似的基因是蕓香科植物的SAMDC基因，因此所得產(chǎn)物確實(shí)為紅椿TcSAMDC基因片段。

2）本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在紅椿葉片人為施加外源多胺能夠在很大程度上影響植株的抗旱能力，并且不同種類(lèi)的外源多胺在不同程度的干旱脅迫下對(duì)紅椿葉片的抗旱性表現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用。

熒光定量PCR結(jié)果顯示其本質(zhì)原因是外源多胺的存在影響了TcSAMDC基因表達(dá)與內(nèi)源多胺的合成，并且其促進(jìn)或抑制程度與紅椿葉片表現(xiàn)出來(lái)的抗旱能力具有一致性。其中，外源Spd和Spm在輕度、中度干旱脅迫下均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，且前者作用程度均高于后者；而外源Put則在輕度、中度干旱脅迫時(shí)表現(xiàn)出先抑制后促進(jìn)的情況；重度干旱脅迫程度時(shí)，上述3種外源多胺對(duì)紅椿葉片抗旱能力均起到了明顯的抑制作用，且抑制程度相近，可能原因是植株體內(nèi)細(xì)胞膜受損程度較大，導(dǎo)致基因正常表達(dá)過(guò)程受到阻礙或者被破壞。整體而言，外源多胺對(duì)紅椿中度干旱脅迫修復(fù)效果較為顯著；3種外源多胺中，以外源Spd對(duì)各脅迫程度的修復(fù)效果更為理想。