高聰, 付兆臣

1 惡性腫瘤中血管生成擬態(tài)的發(fā)現(xiàn)及特點(diǎn)

Maniotis等[1]在顯微鏡下觀察到腫瘤中存在由腫瘤細(xì)胞形成的一些阿利新藍(lán)-過碘酸-雪夫染色劑(Periodic acid-schiff stain,PAS)染色陽性的管道,并且在管腔中存在紅細(xì)胞。通過透射電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示,管道的形成并不依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此,他們提出了一種獨(dú)立于血管內(nèi)皮細(xì)胞的新的腫瘤微循環(huán)模式,即血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)。

Racordon等[2]通過PAS染色發(fā)現(xiàn)VM從外觀看是一種彼此關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),形態(tài)上有直的、弧形的、閉合環(huán)狀的及網(wǎng)狀的。管腔樣結(jié)構(gòu)內(nèi)部由一層癌細(xì)胞及具有分泌功能的糖蛋白覆蓋,含有豐富的基質(zhì)蛋白,實(shí)性結(jié)構(gòu)絕大部分為基質(zhì)被覆的癌細(xì)胞。VM在形態(tài)上分成管道型和圖案樣基質(zhì)型兩種不同的類型。管道型VM與由內(nèi)皮細(xì)胞襯里的血管相似,但在管道型的VM結(jié)構(gòu)中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞及其標(biāo)記物;在形態(tài)上圖案基質(zhì)樣VM跟由內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管相差大,是一種由富含基質(zhì)蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)鞘形成的中空的、能夠運(yùn)輸液體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),此種結(jié)構(gòu)與內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管相連通,可形成輸送血供的網(wǎng)絡(luò)整體。

2 缺氧影響惡性腫瘤血管生成擬態(tài)的分子機(jī)制

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是血管生成的主要調(diào)控因子,其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起到特異性作用,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[3]。VEGF也能刺激受體酪氨酸激酶惡性腫瘤的發(fā)展,通過氧含量影響腫瘤管道結(jié)構(gòu)的形成。在惡性腫瘤快速生長(zhǎng)的過程中,隨著腫瘤體積的增加,內(nèi)部可形成缺氧微環(huán)境,而缺氧可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞基因型改變,顯著增加其可塑性,并使血管內(nèi)皮相關(guān)的細(xì)胞基因選擇性表達(dá),進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞能夠作為血管內(nèi)皮樣的細(xì)胞形成VM。研究顯示,在缺氧微環(huán)境下能刺激缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)1α的表達(dá),而HIF-1α可以激活VEGF,研究顯示,缺氧環(huán)(erythropoiethi-producing hep-atocellular,Eph)A2和血管上皮鈣黏素(vascular endothelialin,VE-cadherin)蛋白的表達(dá)可促進(jìn)VM的形成,并可促進(jìn)腫瘤網(wǎng)狀管道結(jié)構(gòu)的形成[4]。Li等[5]在實(shí)驗(yàn)中證明VM 陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)中缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)增加,HIF-1α促進(jìn)表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)相關(guān)的緊密連接蛋白4(claudin-4)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vim)等相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn) EMT,而EMT表達(dá)增加CRC中VM的形成。

據(jù)報(bào)道,HIF-1α高表達(dá)可上調(diào)VM形成中關(guān)鍵基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和MMP-9的表達(dá)。MMP是VM形成中的重要分子,可通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和VM形成[6-7]。有學(xué)者將腫瘤細(xì)胞在氧氣正?；蛉毖鯛顟B(tài)下進(jìn)行三維培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在缺氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮樣細(xì)胞形成管道樣結(jié)構(gòu),且與HIF-1α形成有關(guān)的信使RNA高度表達(dá)[8]。VE-cadherin/EphA2/磷酯酰肌醇3激酶(phosphinositide 3-kinase,PI3K)/MMP等信號(hào)通路被證實(shí)是血管生成擬態(tài)網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)形成的至關(guān)通路[9]。缺氧不僅可以激活HIF-1α,還可以激活HIF-2α。HIF-2α作為VM的起始分子,上調(diào)了VE-cadherin的轉(zhuǎn)錄,繼而誘導(dǎo)EphA2重新定位到細(xì)胞膜,導(dǎo)致EphA2磷酸化,被激活的EphA2使局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)磷酸化,從而再激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsingal-regulated kinase 1 and 2,ERK1/2),進(jìn)而激活PI3K，值得注意的是,PI3K能同時(shí)被VE-cadherin與EphA2激活。激活的PI3K調(diào)控膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane type 1 matrix metalloproteinase,MT1-MMP)前基因的激活,轉(zhuǎn)換成MT1-MMP,從而激活MMP-2前基因。在MT1-MMP和MMP-2的共同作用下,促進(jìn)了層黏連蛋白(laminin5γ25γ2,LN-5γ2)鏈裂解成片段,即5γ2和5γ2x片段,而細(xì)胞外微環(huán)境中這兩個(gè)片段的數(shù)量增加最終導(dǎo)致了VM網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的形成[10]。

3 受缺氧微環(huán)境影響VM的靶點(diǎn)分析

缺氧微環(huán)境影響下VM的靶點(diǎn)研究主要包括HIF-la特異性抑制劑的應(yīng)用、沉默HIF-la基因、反義HIF-la質(zhì)粒轉(zhuǎn)染等[11-12]。俞旭君等[13]發(fā)現(xiàn)含有芪藍(lán)膠囊藥的血清可抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞3D培養(yǎng)模型中VM的形成,其中中、高劑量抑制作用更明顯。VEGF-α/EphA2/MMP1之間存在顯著的上下游關(guān)系,即VEGF-α激活EphA2-MMP1,進(jìn)一步有助于形成VM,由于三者是VM形成的重要起始因子,因此證實(shí)了該途徑存在于VM的形成過程中。HIF-1α與VEGF-α和EphA2之間無明顯抑制關(guān)系,其原因是其他因素對(duì)上游VEGF-α基因的調(diào)節(jié)作用。然而,沉默HIF-1α后,MMP-1的表達(dá)受到抑制,提示HIF-1α可能通過尚未知曉的其他途徑抑制MMP-1的表達(dá),從而影響VM的形成。前列腺癌組織中VM的表達(dá)在應(yīng)用芪藍(lán)膠囊后由于HIF-1α、VEGF-α、MMP-1基因和蛋白的表達(dá)受抑制而減少,進(jìn)而減少了腫瘤組織的血液供應(yīng),最終在前列腺癌的治療中發(fā)揮臨床作用。HIF-1α是腫瘤微血管形成機(jī)制中的“中樞”,針對(duì)HIF-1α靶點(diǎn)的藥物:如HIF-1α蛋白降解的分子伴侶Hsp90的抑制劑17-AAG和17-DMAG、HIF-1α蛋白翻譯的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑托泊替康、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑NSC644221、減少HIF-1α蛋白合成的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制藥雷帕霉素等,均可抑制腫瘤血管生成[14]。Cai等[15]發(fā)現(xiàn)替莫唑胺能夠通過降低HIF-1α蛋白的表達(dá),增強(qiáng)伊立替康的化療作用。洋地黃藥物地高辛可以抑制HIF-1α的活性,抑制腫瘤血管中血管的形成。低氧條件下在多種腫瘤細(xì)胞如喉癌、膀胱癌和胰腺癌中研究證實(shí)了四醇YC-1在腫瘤細(xì)胞缺氧條件下,對(duì)VM的形成具有一定的抑制作用。此外,還報(bào)道了參皂甙R93、2,甲氧雌二醇和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑(MFTZ-1)對(duì)HIF-1α具有一定的抑制作用[16]。

4 缺氧微環(huán)境下幾種腫瘤血管生成擬態(tài)的研究

4.1 缺氧影響腦膠質(zhì)瘤VM的靶點(diǎn)研究 膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性度高、預(yù)后差。腦膠質(zhì)瘤的增殖必須要有足夠的血液供應(yīng),但抗腫瘤血管生成療法如抗VEGF藥物在臨床試驗(yàn)中并未達(dá)到預(yù)期治療效果。王帆等[17]對(duì)膠質(zhì)瘤組織進(jìn)行CD34和PAS雙重染色證實(shí)膠質(zhì)瘤組織中存在VM。在研究期間證實(shí),缺氧是形成膠質(zhì)瘤VM的重要驅(qū)動(dòng)因素之一,并且缺氧誘導(dǎo)了涉及VM的多種微小RNA。膠質(zhì)瘤組織處于嚴(yán)重缺氧狀態(tài)的微環(huán)境下可對(duì)腫瘤細(xì)胞中microRNA的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。徐書剛等[18]最先發(fā)現(xiàn)microRNA-584-3p和microRNA-let-7f可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的VM,骨膜成骨細(xì)胞特異性因子(Periostin,POSTN)成骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞樣細(xì)胞系分泌的一種胞外基質(zhì)分泌性蛋白。研究表明,microRNA-let-7f通過調(diào)節(jié)POSTN可抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)的VM形成。此外,有研究顯示腫瘤血管抑肽可以滅活腫瘤中的MMP2蛋白和抑制磷酸化EphA2蛋白，從而抑制膠質(zhì)瘤中VM的產(chǎn)生[19]。在近年研究，低氧條件下膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成,結(jié)果表明YC-1通過抑制HIF-1α的表達(dá)來抑制MMPs的表達(dá),進(jìn)而使U87細(xì)胞的血管生成減少[20]。

4.2 缺氧影響舌鱗狀細(xì)胞癌VM的靶點(diǎn)研究 張勁濤等[21]建立裸鼠皮下移植瘤人舌鱗狀細(xì)胞癌模型發(fā)現(xiàn)，沉默HIF-1α后移植瘤的生長(zhǎng)速度變慢和體積顯著變小,瘤體內(nèi)的血管形態(tài)趨于正常并且微血管密度減小,VM現(xiàn)象少見,沉默HIF-1α后瘤體組織的VEGF、TGF-β1的表達(dá)顯著減弱,提示口腔鱗癌移植瘤中VM現(xiàn)象的形成與HIF-1(及其對(duì)靶基因VEGF～TGF-1)的表達(dá)調(diào)控存在一定聯(lián)系。最近有研究表明,存在EMT和VM的舌鱗狀細(xì)胞癌具有更高的臨床分期且更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,二者具有密切相關(guān)性[22]；同時(shí),也有研究顯示,TGF-β1、VEGF和MMP-2的表達(dá)與口腔鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[23]。

4.3 食管鱗癌VM在缺氧微環(huán)境下的研究 在消化道腫瘤中食管鱗癌較為常見,其晚期發(fā)展迅速,預(yù)后不良,這與腫瘤的血供密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)HIF-1α蛋白被破壞時(shí),腫瘤中管狀網(wǎng)絡(luò)數(shù)量明顯減少，VE-鈣粘蛋白、epha2和ln5γ2的表達(dá)明顯受到抑制,HIF-1α誘導(dǎo)血管鈣粘蛋白表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Ec9706中血管生成擬態(tài)的形成[24]。在缺氧微環(huán)境中食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Ec9706受Bcl-2-siRNA干擾后,VM相關(guān)的分子VE-cadherin和MMP2的表達(dá)明顯受抑,VM生成明顯減少,得知Bcl-2依賴的VE-cadherin高表達(dá)可能是缺氧誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞VM形成的重要分子機(jī)制[25]。

5 結(jié)論

缺氧是誘導(dǎo)惡性腫瘤VM形成的重要因素,對(duì)惡性腫瘤VM的形成具有促進(jìn)作用,HIF-1α是惡性腫瘤VM形成的關(guān)鍵因子,且被認(rèn)為是VM生成的始動(dòng)因子,因此,以HIF-1α及VM為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物,有望達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的目的,其中改變腫瘤缺氧微環(huán)境是潛在的治療策略。我們相信隨著研究的深入，缺氧微環(huán)境影響VM形成的機(jī)制研究將會(huì)更加清晰,將會(huì)推進(jìn)抗腫瘤血管生成擬態(tài)藥物的研制,這對(duì)提高惡性腫瘤的治愈率,延長(zhǎng)患者的生命意義深遠(yuǎn)。