郝婧瑋 梅念念 渠利霞 黃靜 季宇彬

摘要：以東北紅豆杉的枝和葉為原材料，在UV-B紫外輻射的條件下，分別采用超聲提取法、酶解法、微波法來研究紫杉醇的提取工藝，定時取樣。對3種方法提取的紫杉醇樣品通過高效液相色譜法（HPLC）進行含量檢測，研究UV-B對不同提取方式下紫杉醇含量的影響。測定結(jié)果顯示，紫杉醇標準品在5.7～6.1 min出峰，計算峰面積，進而求得紫杉醇提取率，來判斷UV-B對這3種提取方法的影響。結(jié)果表明，在UV-B條件下，1～2 h內(nèi)，紫杉醇含量增加，在紫外輻射2 h時，提取率達到最大值;在3～5 h內(nèi)，紫杉醇含量逐漸下降。在3種方法中，超聲提取法優(yōu)于酶解法，酶解法優(yōu)于微波法，微波法的提取效果稍差，超聲提取法在紫外輻射2 h時，提取率達到最大值，為7.65%。其中2種方法合用優(yōu)于單一法，加入纖維素酶的微波法在紫外輻射2.5 h時，提取率為8.39%。

關(guān)鍵詞：紫杉醇;高效液相色譜（HPLC）;UV-B紫外輻射;紅豆杉;提取方式

中圖分類號： S791.490.1;R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0266-04

收稿日期：2018-08-09

基金項目：牡丹江師范學(xué)院科研項目（編號：QY2014010）;黑龍江省教育廳項目（編號：1353MSYQN009）;哈爾濱商業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新科研專項基金（編號：YJSCX2017-402HSD）。

作者簡介：郝婧瑋（1985—），女，遼寧寬甸人，碩士，講師，主要從事腫瘤藥理學(xué)研究。Tel：（0453）6511042;E-mail：swxhjw@126.com。

紅豆杉（Taxus chinensis）是紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物的總稱，別名紫杉。因資源稀少，紅豆杉被劃分在我國一級珍稀保護樹種范圍內(nèi)[1]。我國紅豆杉有1個變種4個種，分散于我國大部分地區(qū)[2]。從紅豆杉樹皮和枝葉中提取的紫杉醇（Paclitaxel，商品名Taxol）的藥用價值很高，是一種治療癌癥的一線臨床用藥[3]。

東北紅豆杉作為珍稀藥用植物[1-4]，主要分布在中國東北地區(qū)、日本、朝鮮、俄羅斯等，主要以莖、枝、葉、根入藥，有抗腫瘤作用，并可以抑制糖尿病和心臟病[5-6]。從東北紅豆杉枝葉中分離得到了紫杉烷類二萜化合物、倍半萜類化合物、甾體類化合物、木脂素類化合物、黃酮類化合物、糖苷類化合物及其他類化合物等多種成分，多種化合物是通過植物次生代謝途徑生成的，其中最具代表性的物質(zhì)是紫杉醇和三尖杉寧堿。紫杉醇是從紅豆杉屬植物中分離得到的一種具有五甲基十五碳烯骨架的二萜類化合物，具有獨特的抗癌作用，能與微管蛋白結(jié)合，并促進其聚合、抑制癌細胞有絲分裂，阻止癌細胞的增殖，對卵巢癌、子宮癌、乳腺癌等十幾種癌癥具有很好的療效[7-8]，同時對治療惡性黑色素瘤、類風濕性關(guān)節(jié)炎和早老性癡呆[9-11]等也有一定潛力。由于其作用機制新穎、療效獨特、廣譜抗癌的特點，紫杉醇成為世界關(guān)注的焦點[12-14]。紫杉醇的開發(fā)、研究和應(yīng)用已成為近年來腫瘤化療研究中的熱點之一。然而，植物中紫杉醇的含量極低，天然資源匱乏、含量低、全合成成本高一直制約著紫杉醇的臨床應(yīng)用[15-16]，從1 kg干樹皮中僅能分離得到50～150 mg紫杉醇，1 g紫杉醇需要3～4株60齡的樹來生產(chǎn)。為滿足臨床用藥的需求，尋找新的生物資源已迫在眉睫。本研究以東北紅豆杉枝葉為試驗材料，對其紫杉醇進行了初步研究，并建立了應(yīng)用高效液相色譜法測定東北紅豆杉枝和葉中紫杉醇含量的方法[9-11]，對不同方法提取紅豆杉中紫杉醇最佳工藝進行研究，為東北紅豆杉這種可再生資源的開發(fā)、利用及質(zhì)量標準研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料預(yù)處理

剪取東北紅豆杉植物體部分枝葉，放入恒溫箱中烘24 h，烘干至恒質(zhì)量。將枝葉放入微型植物粉碎機中粉碎，稱取，分裝。稱取1.5 g紅豆杉粉末分別裝在①②③④號錐形瓶中，按料液比1 g ∶10 mL用甲醇對紅豆杉粉末進行浸提;將4個錐形瓶于紫外燈下照射5 h，并且隔1 h取樣，備用。

1.2試驗方法

1.2.1酶解法提取依據(jù)10 ∶1的紅豆杉粉末、纖維素酶的質(zhì)量比例，在①號樣品瓶中加入0.15 g纖維素酶。60 min后，將①號樣品瓶再放于紫外燈下照射5 h，每1 h取樣，得到樣品，備用。

1.2.2超聲提取法提取將②號樣品瓶放入超聲波清洗機中超聲60 min。然后，將①號樣品瓶再放于紫外燈下照射5 h，每1 h取樣，得到樣品，備用。

1.2.3微波法提取依據(jù)10 ∶1的紅豆杉粉末、纖維素酶的質(zhì)量比例，在④號樣品瓶加入0.15 g纖維素酶，與③號樣品瓶一同放入微波爐中大火微波4～5 s。將③號和④號錐形瓶樣品再放于紫外燈下照射5 h，每1 h取樣，得到樣品，備用。

1.2.4高效液相色譜檢測條件的建立色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-乙腈-水（體積比為34 ∶32 ∶34）為流動相，檢測波長為227 nm[17]。將樣品離心6～8 min，12 000 r/min。取有關(guān)物質(zhì)項下系統(tǒng)適用性溶液10 μL 注入液相色譜儀[18-19]，對標準品、抽樣的樣品進行液相色譜分析，將樣品紫杉醇峰與紫杉醇標準品進行對照，觀察出峰時間。得到數(shù)據(jù)，譜圖，進行分析。

1.2.5標準曲線的建立精確稱取4 mg紫杉醇標準品，用2 mL 甲醇配制成濃度為2 mg/mL的標準品溶液，取1 mL標準品溶液進行稀釋，在此溶液中再取1 mL進行稀釋，以此類推，梯度濃度不斷稀釋，配制出2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL 一系列濃度的溶液，得到標準品溶液[19]。按高效液相色譜（HPLC）條件進行檢測，求峰面積。繪制標準曲線，計算回歸方程。

2結(jié)果與分析

2.1標準曲線回歸方程

線性回歸方程為y=6×106x+20 357，相關(guān)系數(shù)為r2=1。其中y為峰面積，x為標準品質(zhì)量濃度（圖1、圖2）。

2.2UV-B對酶解法提取紫杉醇含量的影響

通過圖3、圖4可以看出，紫外照射前5 h內(nèi)，原材料經(jīng)預(yù)處理后進行浸提過程紫外照射1～2 h，紫杉醇含量增加，紫外照射3～5 h，紫杉醇含量下降。在酶解法中，加入纖維素酶后進行提取，由于酶分解細胞壁的作用促進紫杉醇含量增加，在紫外照射1～2 h內(nèi)，紫杉醇含量增加;在紫外照射3～5 h內(nèi)，紫杉醇含量逐漸下降。

2.3UV-B對超聲波法提取紫杉醇含量的影響

通過圖5、圖6可以看出，在超聲提取法中，由于振蕩破碎作用，紫杉醇含量增加，在紫外照射1～2 h內(nèi)，紫杉醇含量增加;在紫外照射3～5 h內(nèi)，紫杉醇含量逐漸下降。

2.4UV-B對微波法提取紫杉醇含量的影響

通過圖7、圖8、圖9可以看出?在微波法中，由于微波加熱作用，紫杉醇含量增加，紫外照射2.5 h內(nèi)，紫杉醇含量緩慢增加，紫外照射5 h時，紫杉醇含量下降。加有纖維素酶的微波法，由于雙重作用，紫杉醇含量增加明顯，照射2.5 h時，含量比照射0 h時明顯增加了2倍以上，照射5 h時，含量有所下降。

3討論

本研究主要分析UV-B對不同提取方法紫杉醇含量的影響。在UV-B相同的條件下，觀察UV-B對不同提取方法紫杉醇含量的影響。通過紫杉醇提取率的比較，結(jié)果表明，UV-B對酶解法、超聲提取法、微波法這3種不同提取方法提取的紫杉醇含量有不同的影響，但影響趨勢是相似的，均為在UV-B條件下1～2 h呈增長趨勢，3～5 h呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于紫外輻射的增強可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生較多酚醛類等紫外吸收物質(zhì)，增強抗氧化能力，減少紫外輻射對植物自身的傷害。有研究表明，二萜類化合物合成的關(guān)鍵酶乙酰輔酶A（acetyl-CoA）與乙酰乙酰輔酶A（acetoacetyl-CoA）受紫外和藍光調(diào)控，在紫外輻射下二萜類合成途徑的乙酰輔酶A與乙酰乙酰輔酶A以及其他分支點的酶積累或活性加強，引起植物體內(nèi)萜類及二萜類化合物等的增加。作為二萜類化合物的紫杉醇與三尖杉寧堿是紅豆杉光合作用過程中通過一系列酶促反應(yīng)得到的，其代謝受到許多代謝酶的調(diào)控。在紫外脅迫的環(huán)境下，東北紅豆杉鮮葉中二萜類化合物表現(xiàn)出含量變化的現(xiàn)象，其實質(zhì)是紫外輻射影響了萜類化合物代謝過程中的許多關(guān)鍵酶和調(diào)節(jié)萜類代謝的一些重要反應(yīng)。在本試驗中，由于不同方法本身對紅豆杉植物的作用不同，所以紫杉醇含量的增加或下降的幅度不同。

參考文獻：

[1]中國科學(xué)院中國植物志委員會.中國植物志（第七卷）[M]. 北京：科學(xué)出版社，1978：438-443.

[2]王亞飛，王強，阮曉，等. 紅豆杉屬植物資源的研究現(xiàn)狀與開發(fā)利用對策[J]. 林業(yè)科學(xué)，2012，48（5）：116-125.

[3]Mok T S，Wu Y L，Thongprasert S. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma[J]. The Journal ofEvidence-Based Medicine，2009，361（10）：947.

[4]費永俊. 紅豆杉藥用價值評價及解決藥源危機的途徑[J]. 時珍國醫(yī)國藥，1997（5）：463-464.

[5]李振麟，呂旭輝，王新婕，等. 曼地亞紅豆杉枝葉化學(xué)成分研究[J]. 中草藥，2018，49（14）：3226-3231.

[6]孟愛平，李娟，濮社班. 紅豆杉屬植物化學(xué)成分及藥理作用研究新進展[J]. 中國野生植物資源，2017，36（2）：47-51.

[7]佘琨，丁艷濤，孟憲璟，等. 紫杉醇在我國的應(yīng)用近況[J]. 腫瘤防治雜志，2001，8（4）：440-443.

[8]蘭文智，余龍江，吳元喜. 磷酸戊糖途徑的調(diào)節(jié)對紅豆杉細胞生長及紫杉醇合成的影響[J]. 植物研究，2002，2（2）：201-204.

[9]查沖，杜亞填，劉磊磊，等. 南方紅豆杉枝葉中10-DABⅢ與紫杉醇HPLC檢測及檢測樣的制備[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：140-145.

[10]Oliver S J，Banquerigo M L，Brahn E. Suppression of collagen-induced arthritis using an angiogenesis inhibitor，AGM-1470，and a microtubule stabilizer，taxol[J]. Cellular Immunology，1994，157（1）：291-299.

[11]高明波，阮成江，李賀，等. 紫杉醇和紫杉烷的生物合成途徑研究進展[J]. 中國藥學(xué)雜志，2010，45（24）：1900-1903.

[12]劉先芳，梁敬鈺，孫建博. 紫杉醇：具有里程碑意義的天然抗癌藥物[J]. 世界科學(xué)技術(shù)（中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2017（6）：941-949.

[13]Sun N K，Huang S L，Chang T C，et al. TLR4 and NF kappa B signaling is critical for taxol resistance in ovarian carcinoma cells[J]. Journal of Cellular Physiology，2017，233（3）：2489-2501.

[14]Mastropaolo D，Camerman A，Luo Y G，et al. Crystal and molecular structure of paclitaxel （taxol）[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1995，92（15）：6920-6924.

[15]李乃偉，汪慶，束曉春，等. 營養(yǎng)脅迫對曼地亞紅豆杉生長與生理指標及紫杉醇含量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：193-195.

[16]劉本葉，葉和春，李國鳳. 抗癌新藥紫杉醇的研究概況[J]. 植物學(xué)報，1995，12（3）：8-14，27.

[17]常杰華，張萬忠. 紫杉醇提取及分離純化技術(shù)研究進展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（11）：3388-3390.

[18]王秀君，張偉，王軍. 紅豆杉紫杉醇提取方法的建立[J]. 生物技術(shù)通訊，2007，18（5）：789-791.

[19]李乃偉，束曉春，彭峰. 紫杉醇提取方法和曼地亞紅豆杉HPLC指紋圖譜的研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：296-298.